復(fù)方黃柏口腔護(hù)理液體外抑菌及刺激性評價研究

許慶友，徐鳳霞，任松鵬，韓德鳳，李 連，臧恒昌

（1. 山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2. 山東漢方制藥有限公司，山東 濟(jì)南 250000；3. 國家藥品監(jiān)督管理局藥物制劑技術(shù)研究與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250012）

口腔健康是全身健康的重要組成部分，口腔微生物菌群及自身免疫失調(diào)是導(dǎo)致口腔疾病乃至全身疾病的重要原因[1-2]。對于治療口腔疾病，有臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗菌藥物聯(lián)合辯證清熱解毒藥物的中西醫(yī)結(jié)合療法，可顯著提高機(jī)體免疫和治療效果[3]。

復(fù)方黃柏液涂劑為已上市中成藥，由連翹、黃柏、金銀花、蒲公英、蜈蚣配伍，經(jīng)水提醇沉工藝制備而成，無添加任何抑菌防腐劑；清熱解毒，消腫祛腐，用于瘡瘍潰后，傷口感染，屬陽證者；治療范圍從體表皮膚損傷至內(nèi)臟腔道黏膜損傷，具有較高的臨床應(yīng)用價值?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，復(fù)方黃柏液涂劑具有抑菌、消炎、促愈合、增強(qiáng)局部非特異性免疫的作用[4-7]?？谇豢茟?yīng)用方面亦有治療口瘡、口腔黏膜炎等臨床報道[8-9]。但復(fù)方黃柏液涂劑用于治療口腔疾病時，口味較苦，患者往往難以接受。本研究在復(fù)方黃柏液涂劑處方工藝基礎(chǔ)上，配伍薄荷腦和抗抑菌成分的葡萄糖酸氯己定，并加入適量甜菊糖苷、食用香精矯味，制備成復(fù)方黃柏口腔護(hù)理液，并實(shí)驗(yàn)觀察其抑菌作用和黏膜刺激性。

1 材料

1.1 原輔料

連翹（批號：191127）、黃柏（批號：1908061）、金銀花（批號：191108）、蒲公英（批號：190911）、蜈蚣（批號：201023）由山東漢方制藥有限公司提供，符合中國藥典質(zhì)量要求。

20 %葡萄糖酸氯己定（批號：190304，錦州九泰藥業(yè)有限公司）；吐溫80（批號：20190628），丙二醇（批號：20181116，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；薄荷腦（批號：X190508，黃山天目薄荷藥業(yè)有限公司）；甜菊糖苷（批號：20190906，曲阜圣仁制藥有限公司）。

1.2 菌株

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（ATCC 8099），取其第9代新鮮斜面培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)；白色念珠菌（ATCC 10231），取其第7代新鮮斜面培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)，由廣東省食品微生物安全工程技術(shù)研究開發(fā)中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

普通級新西蘭兔3只，雄性。合格證號：No.1108222011000319，由山東省濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2015 0001。

2 方法

2.1 口腔護(hù)理液制備

取連翹、黃柏、金銀花、蒲公英、蜈蚣，以上五味，加水煎煮3次，第一次1 h，第二次45 min，第三次30 min，合并煎液；濾過，濾液濃縮至相對密度為1.10～1.15（50 ℃）的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)70 %，靜置24 h，濾過，濾液減壓濃縮至無醇味，加水至100 ml，攪勻，靜置，冷藏24 h，濾過，依次攪拌加入吐溫80適量、20 %葡萄糖酸氯己定溶液2.5 g、薄荷腦丙二醇溶液適量、甜菊糖苷適量，食用香精適量，混勻，加水調(diào)節(jié)至1000 ml，即得。

2.2 抑菌試驗(yàn)[10]

2.2.1 制備抑菌片 取滅菌并干燥的直徑為5 mm的新華1號定性濾紙片。每片滴加2.1項(xiàng)制備的口腔護(hù)理溶液 20 μl，將濾紙片鋪于無菌平皿內(nèi)，半密封狀態(tài)置干燥箱（37 ℃）中烘干，備用。

2.2.2 制備陰性對照樣片 同2.2.1項(xiàng)，取滅菌處理并且干燥后的濾紙片，每張濾紙片上滴加無菌蒸餾水20 μl，干燥后備用。

2.2.3 接種試驗(yàn)菌 用涂布工具，酒精燈火焰滅菌并冷卻后，蘸取濃度為5×105～5×106cfu/ml 試驗(yàn)菌懸液，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面均勻涂布。蓋好平皿，室溫下干燥5 min。

2.2.4 抑菌劑樣片貼放 用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面。貼放好后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。每個平皿貼放5張樣片，其中4張抑菌片、1張陰性對照樣片，使各樣片中心之間相距25 mm以上，與平板的周緣相距 15 mm 以上，蓋好平皿，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16～18 h 觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測量抑菌環(huán)的直徑（包括貼片）并記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2.5 評價規(guī)定 抑菌環(huán)直徑大于7 mm者，判為有抑菌作用。抑菌環(huán)直徑小于或等于7 mm者，判為無抑菌作用。3 次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用結(jié)果者，判為合格。陰性對照組應(yīng)無抑菌環(huán)產(chǎn)生。否則試驗(yàn)無效。

2.3 急性眼刺激試驗(yàn)[10]

參照《消毒產(chǎn)品衛(wèi)生安全評價規(guī)定》，用于黏膜的抗（抑）菌制劑應(yīng)當(dāng)進(jìn)行眼刺激性試驗(yàn)[11]。

2.3.1 實(shí)驗(yàn)動物準(zhǔn)備 試驗(yàn)前24 h內(nèi)檢查每只新西蘭兔的雙眼是否有異?，F(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)有異?，F(xiàn)象則淘汰。

2.3.2 染毒方法 采用同體左右側(cè)自身對比法，取受試物原液0.1 ml滴入左側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，將眼睛被動閉合4 s，30 s后用氯化鈉注射液沖洗。右側(cè)眼睛同法給予氯化鈉注射液0.1 ml作為陰性對照組。

2.3.3 結(jié)果記錄 滴受試物后，將眼被動閉合4 s，30 s后用生理鹽水沖洗。分別在24，48，72 h肉眼觀察新西蘭兔眼結(jié)膜、虹膜和角膜的損傷與恢復(fù)情況并記錄。如有刺激反應(yīng)情況下，可繼續(xù)觀察記錄7，14和21 d情況；如果72 h內(nèi)未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，或第7天或第14天，眼睛刺激反應(yīng)完全恢復(fù)，即可提前終止試驗(yàn)。

2.3.4 評價規(guī)定 按《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）表2-13對家兔眼角膜、虹膜和結(jié)膜的急性刺激反應(yīng)進(jìn)行評分，并分別計(jì)算每只動物在3個不同觀察時間（24，48和72 h）角膜損害、虹膜損害、結(jié)膜充血和結(jié)膜水腫四方面的“平均評分”。分別以動物眼角膜、虹膜和結(jié)膜充血、水腫的平均評分和恢復(fù)時間進(jìn)行，按《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）表2-14、表2-15眼刺激反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)判定受試物對眼睛的刺激強(qiáng)度。

3 結(jié)果

3.1 抑菌試驗(yàn)

口腔護(hù)理液原液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的抑菌環(huán)數(shù)據(jù)分別見表1～表3。

表1 樣品原液對金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)直徑

表2 樣品原液對大腸桿菌的抑菌環(huán)直徑

表3 樣品原液對白色念珠菌的抑菌環(huán)直徑

由表1～表3可見，依據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002 年版），在試驗(yàn)條件下，由口腔護(hù)理液原液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的平均抑菌環(huán)直徑可見，口腔護(hù)理液原液對上述3個菌種均有抑菌作用，符合《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）標(biāo)準(zhǔn)要求。抑菌作用金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞白色念珠菌。

3.2 急性眼刺激試驗(yàn)

口腔護(hù)理液原液對受試物角膜損害、虹膜損害、結(jié)膜充血和結(jié)膜水腫情況見表4。

表4 急性眼刺激試驗(yàn)評分結(jié)果

由表4可見，本實(shí)驗(yàn)條件下，該樣品原液對新西蘭兔眼刺激的損傷類型為無刺激性，符合《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）的要求。

4 討論

基于復(fù)方黃柏液涂劑對于陽證型黏膜損傷廣泛而良好的臨床應(yīng)用反饋，以及口腔部位常見疾病特點(diǎn)，復(fù)方黃柏口腔護(hù)理液組方最終選擇以葡萄糖酸氯己定為抑菌防腐劑。因葡萄糖酸氯己定有長效廣譜抑菌作用，可顯著抑制致齲菌生長、抗菌斑形成[12]，同時對于破損皮膚刺激性較低，安全性高[13]；常用于牙齦炎、冠周炎、口腔黏膜炎等引致的牙齦出血、牙周膿腫、口腔黏膜潰瘍等輔助治療。本組方中薄荷腦作為清涼矯味劑、促透劑，同時也有疏風(fēng)清熱功效[14]，以協(xié)同增強(qiáng)連翹、黃柏、金銀花、蒲公英、蜈蚣組合的清熱解毒效力。

至于新配方制備的復(fù)方黃柏口腔護(hù)理液在護(hù)理治療包括口腔潰瘍、牙齦腫痛等在內(nèi)的陽證型口腔疾病療效上，與復(fù)方黃柏液涂劑相比是否提高，有待進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。