顧順心，姜 琴，施鵬飛

(江蘇海洋大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

藥物治療是目前臨床治療腫瘤的重要手段之一，開發(fā)具有獨(dú)特療效的抗腫瘤藥物一直是藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。順鉑(CDDP)是最早臨床應(yīng)用的金屬抗腫瘤藥物[1]，該藥物因具有廣譜抗腫瘤活性和高治愈率而在多種癌癥治療中表現(xiàn)不俗[2-4]，特別是針對(duì)睪丸癌的治療，它使睪丸癌患者的死亡率從100%降到10%以下[5]。但順鉑類藥物也存在嚴(yán)重的毒副作用[6]，且容易產(chǎn)生耐藥性、水溶性小、在體內(nèi)不易代謝，因此迫切需要開發(fā)新型金屬抗腫瘤替代藥物,以減少鉑類藥物毒副作用和交叉耐藥性帶來(lái)的問題。

很多銥(Ⅲ)配合物因具有較強(qiáng)的細(xì)胞滲透能力以及獨(dú)特的抗腫瘤活性，而引起生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究人員的廣泛關(guān)注[7-9]。不僅如此，銥(Ⅲ)配合物還表現(xiàn)出優(yōu)異的發(fā)光性能，包括激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)易于調(diào)節(jié)、量子產(chǎn)率高、斯托克斯位移值大、發(fā)光壽命長(zhǎng)、光穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，使其在發(fā)光材料研究領(lǐng)域也備受青睞[10-11]。鑒于發(fā)光銥(Ⅲ)配合物所具有的光學(xué)特性，可采用激光共聚焦顯微鏡來(lái)追蹤其在腫瘤組織內(nèi)的攝入、分布與代謝狀態(tài)，這將有助于研究者明確銥(Ⅲ)配合物抗腫瘤的靶分子與作用機(jī)理。另外，部分配合物在光激發(fā)下還可在腫瘤細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)生成具有強(qiáng)氧化性能的活性氧(ROS)物種，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。目前發(fā)光銥(Ⅲ)配合物已經(jīng)作為一類非常有潛力的腫瘤光動(dòng)力學(xué)治療的光敏劑[12]而被廣泛研究。

Ye等[13]的研究表明，Ir(Ⅲ)配合物對(duì)多種癌細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)抗增殖活性(強(qiáng)于順鉑類藥物)，甚至對(duì)順鉑耐藥細(xì)胞株也有很好的藥效；該配合物具有強(qiáng)磷光發(fā)射性能，利用激光共聚焦顯微成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)配合物能夠有效地滲透到Hela細(xì)胞中；對(duì)線粒體的形態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)現(xiàn)，配合物能誘導(dǎo)線粒體損傷從而殺死癌細(xì)胞。Yang等[14]研究表明，半三明治型Ir(Ⅲ)配合物對(duì)A549細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抗癌活性(IC50=4.7 μmol/L)，該配合物能靶向并破壞A549細(xì)胞的溶酶體，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Liu等[15]研究表明環(huán)金屬化銥配合物具有雙重(轉(zhuǎn)移抑制和溶酶體損傷)抗癌機(jī)制：配合物通過血清白蛋白及靜電力猝滅機(jī)制進(jìn)行運(yùn)輸，且能有效地阻止癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，擾亂細(xì)胞周期G0/G1期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；配合物通過能量依賴性細(xì)胞攝取機(jī)制，有效積累在溶酶體中，誘導(dǎo)溶酶體損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Liu等[16]將四苯乙烯基團(tuán)引入Ir(Ⅲ)配位單元，得到的系列配合物對(duì)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞具有一定的選擇性；不同結(jié)構(gòu)的配合物其抗腫瘤機(jī)制有所不同：部分配合物不僅可以催化NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD+，還可以誘導(dǎo)ROS富集。Lu等[17]報(bào)道了末端含芘基團(tuán)的雙核三聯(lián)吡啶銥配合物，該配合物表現(xiàn)出強(qiáng)光毒性和相對(duì)較弱的暗毒性；配合物能在細(xì)胞內(nèi)生成ROS，導(dǎo)致肺癌細(xì)胞A549和人皮膚癌細(xì)胞A431的線粒體和溶酶體功能損傷，以細(xì)胞凋亡的方式促使細(xì)胞壞死。Kuang等[18]報(bào)道了一種以蒽醌三聯(lián)吡啶衍生物作為主配體的Ir(Ⅲ)配合物，該配合物在雙光子PDT治療厭氧腫瘤方面具有非常良好的應(yīng)用前景。該配合物在缺氧條件下經(jīng)還原酶還原后，發(fā)光性能顯著增強(qiáng)，且在近紅外雙光子光激發(fā)下具有很高的穩(wěn)定性；輻照后，配合物可以誘導(dǎo)產(chǎn)生碳自由基，促進(jìn)線粒體膜電位降低與細(xì)胞死亡(光激發(fā)下IC50=2.1 μmol/L, 黑暗中IC50=58.2 μmol/L,PI=27.7)；體內(nèi)有A549癌細(xì)胞的雄性小鼠注射給藥后，經(jīng)雙光子激發(fā)照射(730 nm, 50 mW, 1 kHz, 脈沖寬35 fs, 5 s/mm)，2 d后小鼠體重沒有明顯變化，14 d后小鼠體內(nèi)的腫瘤組織顯著減小。Pracharova等[19]報(bào)道的配合物對(duì)順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)抑制活性；研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤活性并非基于DNA損傷，而是通過優(yōu)先靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并抑制蛋白翻譯過程從而殺死腫瘤細(xì)胞；配合物表現(xiàn)出良好的PDT活性，可見光照可使IC50值降低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

本文中未特別指明的化學(xué)品都來(lái)源于商業(yè)采購(gòu)并直接使用，小牛胸腺DNA(ct-DNA)和牛血清蛋白(BSA)從Sigma-Aldrich公司購(gòu)買。所有合成的化合物均在真空干燥器(CaSO4)中干燥后再進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。核磁數(shù)據(jù)(1H NMR)采用500 MHz Bruker DMX采集，利用四甲基硅烷(TMS)做內(nèi)標(biāo)。質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Agilent 1290-6545 LC/MS質(zhì)譜儀采集。紫外-可見吸收光譜用UV-3100記錄，熒光光譜用Hitachi F-7000記錄。ct-DNA的濃度用紫外光譜標(biāo)定(ε260 nm=6 600 L/(mol·cm))。在Tris-HCl的緩沖溶液中(pH=7.42)，260 nm和280 nm處紫外吸光度的比值為1.87，表明DNA中已完全去除了蛋白質(zhì)雜質(zhì)。稱取一定量牛血清蛋白BSA，用Tris-HCl緩沖液溶解，配制濃度為2×10-4mol/L的儲(chǔ)備液，置于4 ℃保存。

1.2 合成與表征

NNC配體及其Ir(Ⅲ)配合物合成路線見圖1。

圖1 NNC配體及其Ir(Ⅲ)配合物的合成路線

1.2.1N,N-二羥乙基苯甲醛的合成與表征 將52 gN,N-二(2-羥乙基)苯胺溶于70 g吡啶中，加入90 g乙酸酐后在90 ℃下攪拌24 h，冷卻至室溫，用400 mL水洗滌后用200 mL乙酸乙脂萃取。乙酸乙酯溶液用無(wú)水硫酸鎂干燥，減壓蒸除溶劑，得油狀物N,N-二乙酸乙酯基苯胺(化合物a)。1H NMR(CDCl3，500 MHz),δ:7.2(2H)，6.8(3H)，4.3(4H)，3.6(4H)，2.1(6H)。

將40 g POCl3在0 ℃攪拌滴入50 mL DMF中，溶液變?yōu)榈t色油狀物。0 ℃繼續(xù)攪拌15 min后，將50 gN,N-二乙酸乙酯基苯胺溶于30 mL 1,2-二氯乙烷并滴入淡紅色油狀物中，滴完后升溫至90 ℃，攪拌3 h得墨綠色混合溶液。冷至室溫后，倒入碎冰中攪拌，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的K2CO3溶液將溶液pH調(diào)節(jié)至6～8，得到黃色固體N,N-二乙酸乙酯基苯甲醛(化合物b)。1H NMR(CDCl3,500 MHz)，δ:9.6(1H)，7.7(2H)，6.8(2H)，4.2(4H)，3.6(4H)，2.0(6H)。

取15 gN,N-二乙酸乙酯基苯甲醛溶解于含有12.5 g氫氧化鈉的250 mL乙醇水溶液(乙醇與水體積比為175∶75)中，攪拌7 h后用稀鹽酸(4 mol/L)調(diào)節(jié)pH至8～9。將溶液蒸干后用乙酸乙酯洗滌3遍，蒸除乙酸乙酯，得黃色油狀固體。柱層析(硅膠柱，展開劑為體積比1∶1的乙酸乙酯和石油醚)后得到黃色粉末N,N-二羥乙基苯甲醛(化合物c)，產(chǎn)率90%。1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ:9.65(1H)，7.71(2H)，6.71(2H)，3.91(5H)。

1.2.2 配體PhbpyOH的合成與表征 將2.9 g(14 mmol)N,N-二羥乙基苯甲醛、1.68 g(14 mmol)苯乙酮和2.24 g(56 mmol)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的NaOH水溶液在常溫下攪拌12 h后，用二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鎂干燥后，旋蒸去除溶劑，得到2.2 g紅色油狀物(化合物d)，產(chǎn)率為50.57%。

將11.8 g(50 mmol)I2溶于72 mL吡啶中，加熱到60 ℃至完全溶解，再加入7.1 g(58.7 mmol)2-乙?；拎ぃ郎刂?5 ℃，反應(yīng)3 h，靜置冷卻后析出固體。將固體濾出后用CH2Cl2洗滌，得到7.28 g灰色固體吡啶嗡鹽(化合物e)，產(chǎn)率44.7%。

將2.2 g(7 mmol)化合物d和2.3 g(7 mmol)化合物e溶于100 mL甲醇，回流反應(yīng)30 min后分3批加入3.27 g NH4Ac，繼續(xù)回流24 h后靜置冷卻，用乙酸乙酯萃取后干燥，旋蒸除去溶劑得棕色油狀物。柱層析(硅膠柱，展開劑為體積比4∶1的乙酸乙酯和石油醚)后得到黃色粉末(化合物PhbpyOH)，產(chǎn)率為14%。1H NMR(CDCl3，500 MHz)，δ:8.70(t，1H)，8.67(d，1H)，8.57(d，1H)，8.20(d，2H)，7.93(d，1H)，7.88(td，1H)，7.74(d，2H)，7.47(t，1H)，7.38～7.31(m，1H)，6.77(d，2H)，4.17～3.96(m，2H)，3.88(t，4H)，3.64(t，4H)。

1.2.3 配合物Ir-NNC的合成與表征 將397 mg(2.56 mmol)的2-苯基吡啶、764 mg(1.28 mmol)的三氯化銥水合物和20 mL乙二醇水溶液(V(乙二醇)∶V(水)=3∶1)的混合溶液置于Schlenk管中，N2保護(hù)下120 ℃加熱回流24 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫析出沉淀，離心過濾得到黃色粉末，依次用水(3×20 mL)、乙醇(3×10 mL)和乙醚(3×10 mL)分別洗滌，真空干燥后得到543.8 mg[Ir(bpy)2Cl]2(化合物f)。

將100 mg(0.093 mmol)化合物f和76.57 mg(0.186 mmol)PhbpyOH溶于30 mL二氯甲烷與甲醇的混合溶液(V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=1∶1)中，65 ℃下回流反應(yīng)24 h，全程N(yùn)2保護(hù)且避光處理。反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸除溶劑，得到橙色固體。將橙色固體溶于30 mL水中，加入150 mg NH4PF6固體后繼續(xù)攪拌30 min，過濾收集橙色沉淀物，依次用水(3×20 mL)、乙醇(3×10 mL)和乙醚(10 mL)洗滌，真空干燥后得到橙色粉末(化合物Ir-NNC)72.4 mg，產(chǎn)率為37.2%。表征結(jié)果為1H NMR(d6-丙酮，500 MHz)，δ：9.07(d，1H)，9.03(d，1H)，8.28(td，J=8.1 Hz，1H)，8.11(dd，J=8.5 Hz,2H)，8.01(ddd，5H)，7.93(td，J=7.9 Hz，1H)，7.76(d，1H)，7.70(dd，1H)，7.65～7.59(m，1H)，7.41～7.36(m，1H)，7.27(ddd，1H)，7.23～7.17(m，1H)，7.01～6.94(m，3H)，6.92(td，1H)，6.86～6.60(m，5H)，6.58～6.53(m，1H)，6.35(td，1H)，6.02(dd，1H)，5.65(dd，1H)，4.23(t，2H)，3.89～3.73(m，4H)，3.70(t，4H)。ESI-MS(+p)，m/z=912.289 1,可指認(rèn)為[Ir(ppy)2PhbpyOH]+的分子離子峰。

1.3 單晶結(jié)構(gòu)分析

配體PhbpyOH的單晶通過其在溶劑(V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶1)中緩慢揮發(fā)得到。選取表面光滑、無(wú)裂紋、大小合適的單晶，置于帶有石墨單色器的Bruker APEX CCD X-ray衍射儀上，于296 K下使用MoKα(k=0.071 073 nm)射線收集衍射數(shù)據(jù)，使用Bruker APEX2[20]和Bruker SAINT[21]程序進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)的收集和還原。使用Olex2[22]軟件進(jìn)行晶體解析。Olex2.Solve程序?qū)ε潴wPhbpyOH晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行初解, 并使用SHELXTL-2018[23]程序?qū)w結(jié)構(gòu)進(jìn)行精修獲得非氫原子坐標(biāo)和各向異性參數(shù)，氫原子由理論計(jì)算方法得到。CCDC:2125620。

1.4 DFT理論計(jì)算

配體和配合物的DFT計(jì)算采用Gaussian 09程序包進(jìn)行，利用B3LYP密度泛函理論對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化。在基態(tài)和激發(fā)態(tài)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，運(yùn)用TDDFT方法研究了激發(fā)態(tài)的電子性質(zhì)。在計(jì)算過程中，配體的所有原子采用 6-31g(d)基組，配合物采用了6-31g(d)(H，O，N，C)/LANL2DZ(Ir)混合基組。

1.5 單線態(tài)氧量子產(chǎn)率

在體外使用9,10-蒽二基-二(亞甲基)二丙二酸ABDA作為1O2指示劑,用功率為6 W的紫外燈在365 nm處激發(fā)配合物Ir-NNC(初始濃度為10 μmol/L)的乙腈溶液,每間隔10 s記錄一次ABDA的吸光度(418 nm處)。采用不含配合物的ABDA的乙腈溶液作為對(duì)照試驗(yàn)，采用Ru(bpy)3Cl2(ΦΔ=0.56)敏化ABDA為參考，計(jì)算Ir-NNC敏化ABDA的量子產(chǎn)率。量子產(chǎn)率計(jì)算公式為

其中：sam表示配合物Ir-NNC；std表示Ru(bpy)3Cl2；S表示ABDA吸光度圖的斜率；F表示吸收校正因子，F(xiàn)=1-10-OD(OD為Ru(bpy)3Cl2和配合物的光密度)。

1.6 雙光子熒光光譜

雙光子激發(fā)熒光光譜使用鎖模鈦寶石激光器(Coherent Mira900F)作為激發(fā)光源，脈沖持續(xù)時(shí)間200 fs，重復(fù)頻率76 MHz，采用單掃描條紋相機(jī)(Hamamastu C5680-01)及單色儀記錄雙光子熒光信號(hào)。樣品溶于DMSO，濃度1.0×10-3mol/L。

1.7 與DNA和BSA相互作用的分子模擬

采用Autodock程序?qū)ε浜衔锱cDNA(或BSA)之間的相互結(jié)合進(jìn)行模擬。Ir-NNC的結(jié)構(gòu)通過DFT(B3LYP)方法優(yōu)化得到，DNA(PDB ID 1BNA)和BSA(PDB ID 4f5sBSA)的分子結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得(http://www.rcsb.org/pdb)。在建模時(shí)，DNA-Ir-NNC的網(wǎng)格盒大小為6.8 nm×7.6 nm×12.6 nm，網(wǎng)格間距為0.037 5 nm。BSA-Ir-NNC的網(wǎng)格盒大小為15.0 nm×6.6 nm×10.4 nm，網(wǎng)格間距為0.1 nm。運(yùn)用拉馬克遺傳算法(LGA)計(jì)算結(jié)合在DNA/BSA上的Ir-NNC可能出現(xiàn)的構(gòu)象，進(jìn)行100次GA運(yùn)算，其他參數(shù)使用默認(rèn)值。利用Pymol軟件分析結(jié)合自由能最低的構(gòu)象的對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 配體與配合物的結(jié)構(gòu)

配體分子的X-ray單晶衍射結(jié)構(gòu)如圖2a所示，配合物經(jīng)DFT優(yōu)化的結(jié)構(gòu)如圖2b所示。

從圖2a可以看出，純配體PhbpyOH中的兩個(gè)吡啶環(huán)與苯環(huán)具有一定的共平面性，最大偏差為24.63°。而在配合物Ir-NNC中，由于配位中心的位阻效應(yīng)，PhbpyOH中的苯環(huán)平面與聯(lián)吡啶平面的夾角增大，達(dá)到74.75°。從Ir-NNC的DFT優(yōu)化的結(jié)構(gòu)(圖2b)可以看出，PhbpyOH中的苯環(huán)沒有參與配位，這與質(zhì)譜結(jié)果是一致的。Ir(Ⅲ)配位中心采取畸變的正八面體結(jié)構(gòu)，其中的Ir—N鍵長(zhǎng)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的結(jié)果接近。

a 配體的單晶衍射結(jié)構(gòu)

2.2 配體與配合物的吸收光譜

配體和配合物的紫外-可見吸收光譜見圖3。配體PhbpyOH在250～400 nm范圍內(nèi)呈現(xiàn)出3個(gè)吸收帶，分別是不同共軛體系之間的π→π*躍遷所致。配合物中n→π躍遷的吸收帶的強(qiáng)度明顯增加且發(fā)生了一定的紅移。與Ir(Ⅲ)配位后，配體PhbpyOH中的π→π*躍遷強(qiáng)度顯著降低，且配合物在415 nm處新出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)吸收峰，可歸屬為金屬到配體的荷移躍遷(MLCT)。

圖3 配體和配合物的紫外-可見吸收光譜

為了進(jìn)一步明確配體和配合物中激發(fā)態(tài)的能級(jí)與結(jié)構(gòu)，采用TDDFT進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化和分子軌道能量計(jì)算，結(jié)果如圖4所示。PhbpyOH的HOMO軌道電子云主要集中在N,N-(2羥乙基)氨基、苯基、多聯(lián)吡啶基團(tuán)的中心吡啶環(huán)區(qū)域內(nèi)，LUMO軌道電子云主要集中在聯(lián)吡啶部位，分子中的N,N-(2羥乙基)氨基是強(qiáng)給電子基團(tuán)，而聯(lián)吡啶基團(tuán)起到吸電子的作用，這種D-π-A結(jié)構(gòu)有利于分子內(nèi)的電荷轉(zhuǎn)移。結(jié)合上述紫外-可見吸收光譜圖可知，261 nm處的吸收帶可歸屬于多吡啶基團(tuán)的π→π*的躍遷吸收(HOMO-1→LUMO)，而345 nm處的吸收帶則歸屬于配體整個(gè)分子的π→π*躍遷吸收(HOMO→LUMO)。在配合物Ir-NNC中，HOMO軌道電子云主要集中在PhbpyOH的聯(lián)吡啶區(qū)域上，HOMO-2軌道電子云主要集中在PhbpyOH的N,N-(2羥乙基)氨基、苯基基團(tuán)上，而LUMO軌道電子云主要集中在苯基吡啶Ir(Ⅲ)配位單元上，HOMO→LUMO表現(xiàn)出明顯的MLCT特性。

圖4 配體和銥配合物的分子軌道

2.3 配體與配合物的單、雙光子發(fā)射光譜

配體PhbpyOH和配合物Ir-NNC在多種溶劑中都呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光發(fā)射，如圖5所示。對(duì)比化合物在不同極性的溶劑中的熒光發(fā)射峰，發(fā)現(xiàn)它們都呈現(xiàn)明顯的溶致變色現(xiàn)象，表明配體和配合物的激發(fā)態(tài)都具有一定的極性且都呈現(xiàn)出電荷轉(zhuǎn)移發(fā)光。溶劑極性的增加促使溶劑分子與溶質(zhì)分子的偶極—偶極相互作用增強(qiáng)，使激發(fā)態(tài)的能量降低，造成熒光光譜發(fā)生紅移。與配體PhbpyOH(λem=518 nm，DMSO)比較，在同一溶劑中配合物Ir-NNC(λem=621 nm，DMSO)的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了明顯的紅移，而且熒光發(fā)射強(qiáng)度降低約1/2。表明Ir(Ⅲ)的配位對(duì)配體的電子云結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了巨大的影響。

a 配體

不僅如此，配體和配合物在760 nm的飛秒激光激發(fā)下，還表現(xiàn)出雙光子激發(fā)熒光效應(yīng)(TPEF)，如圖6所示。相同的測(cè)試條件下，配合物Ir-NNC在DMSO溶液中的雙光子激發(fā)熒光相較配體PhbpyOH的峰值紅移約40 nm，但發(fā)光強(qiáng)度要明顯弱于PhbpyOH。配體PhbpyOH在DMSO中的最大TPEF發(fā)射波長(zhǎng)位于528 nm，與其在DMSO中的單光子激發(fā)熒光(OPEF)相比，紅移了約10 nm，這主要是由于在TPEF測(cè)量時(shí)樣品濃度遠(yuǎn)大于OPEF的(約為150倍)，造成了熒光的再吸收作用所致[25]。配合物Ir-NNC的TPEF峰位于567 nm處，其相對(duì)于OPEF譜帶的峰藍(lán)移了50 nm，說明單光子激發(fā)與雙光子激發(fā)具有不同的激發(fā)態(tài)能級(jí)和結(jié)構(gòu)。TPEF來(lái)源于能級(jí)更高的單線態(tài)激發(fā)態(tài)1MLCT，而OPEF則源自低能級(jí)的三線態(tài)激發(fā)態(tài)3MLCT。

a 配體

2.4 與DNA和BSA的相互作用

研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)銥配合物的抗腫瘤作用都是通過光誘導(dǎo)產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的1O2，從而殺死腫瘤細(xì)胞[17]。使用ABDA作為1O2指示劑并以Ru(bpy)3Cl2為參照，測(cè)試了配合物Ir-NNC的相對(duì)1O2量子產(chǎn)率。隨著光照時(shí)間的增加，含有Ir-NNC的ABDA溶液的吸光度呈現(xiàn)出一定的下降趨勢(shì)，這表明在體外銥配合物Ir-NNC可在光照下誘導(dǎo)生成1O2，其量子產(chǎn)率約為0.1。

臨床使用的許多抗癌藥物都以DNA為作用靶點(diǎn)，它們與DNA的相互結(jié)合可引起DNA復(fù)制障礙，從而抑制癌細(xì)胞的分裂[26]。研究銥配合物與DNA分子的相互作用，對(duì)于明確其抗腫瘤的生物靶分子具有重要意義。由圖7a可以看出，隨著ct-DNA濃度逐漸增加，Ir-NNC的紫外-可見吸收光譜表現(xiàn)出明顯的減色效應(yīng)，但并無(wú)明顯的紅移效應(yīng)，說明配合物不是通過嵌入作用與DNA結(jié)合[27]。而當(dāng)配合物結(jié)合到DNA的溝區(qū)時(shí)，僅出現(xiàn)減色效應(yīng)，可能是配合物的發(fā)色團(tuán)被DNA的堿基覆蓋所導(dǎo)致[28]。

血清白蛋白是血漿中含量最為豐富的載體蛋白，能與進(jìn)入血液中的大多數(shù)內(nèi)源性和外源性化合物結(jié)合，從而在體內(nèi)起到存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。研究銥配合物與血清蛋白之間的相互作用[29]，有助于了解配合物在體內(nèi)的運(yùn)輸和分布情況，對(duì)于闡明銥配合物抗腫瘤的作用機(jī)制具有重要意義。由圖7b可知，隨著BSA濃度逐漸增加，275 nm處的吸收峰出現(xiàn)增色效應(yīng)，這是BSA分子中色氨酸和酪氨酸的特征吸收峰所致。在300 nm和425 nm處配合物的紫外-可見光譜吸收峰均表現(xiàn)出明顯的減色和紅移現(xiàn)象，并在297 nm出現(xiàn)等吸收點(diǎn)，表明配合物Ir-NNC可結(jié)合到BSA上并形成Ir-NNC-BSA復(fù)合物。

a DNA

Dock分子建模法是用于探索小分子與生物大分子的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合能的一項(xiàng)重要技術(shù)[30-31]。為了進(jìn)一步明確Ir-NNC與DNA和BSA的結(jié)合位點(diǎn)，本文利用Autodock模擬了配合物與DNA和BSA之間的相互作用。對(duì)接結(jié)果表明，銥(Ⅲ)配合物Ir-NNC進(jìn)入DNA的小溝區(qū)而不是插入DNA堿基對(duì)之間(這與紫外滴定的結(jié)果一致)，結(jié)合自由能為-20.75 J/mol。如圖8a所示，Ir-NNC的2個(gè)羥乙基與DNA行成4個(gè)氫鍵，分別是H92與DNA的DC-15(0.21 nm)，H97與DT-8(0.24 nm)，DG-16(0.20 nm)，O56與DC-9(0.24 nm)。由圖8b可以看出，Ir-NNC在BSA中的結(jié)合位置為ⅠB亞結(jié)構(gòu)域，該結(jié)合自由能為-14.98 J/mol。圖8c可知，Ir-NNC的H97和H92分別與氨基酸殘基ASP-118(0.25 nm)和GLU-125(0.19 nm,0.27 nm)形成了3個(gè)氫鍵。氫鍵的存在可以穩(wěn)定復(fù)合物Ir-NNC-BSA的結(jié)構(gòu)。

a 與雙螺旋DNA的對(duì)接(單位：?)

3 結(jié)論