黃連解毒湯治療膿毒癥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

董青青 章怡祎 叢億蕾 陳偉

摘要 目的：探索黃連解毒湯治療膿毒癥的核心作用靶點(diǎn)、主要活性成分及作用機(jī)制。方法：在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）以黃連、黃芩、黃柏、梔子為關(guān)鍵詞分別檢索，按照口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18的條件篩選，獲得黃連解毒湯各中藥的活性成分及其作用靶點(diǎn);通過在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM）、GeneCards、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD）檢索膿毒癥的疾病靶點(diǎn);將預(yù)測(cè)到的成分及其疾病靶點(diǎn)運(yùn)用Cytoscape軟件進(jìn)行中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，篩選核心靶點(diǎn)及主要活性成分，通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合Cytoscape軟件繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，通過R語(yǔ)言運(yùn)行后對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路注釋分析，設(shè)定閾值 P <0.05， Q <0.05，篩選具有顯著性差異的生物過程及信號(hào)通路。結(jié)果：篩選出黃連解毒湯78個(gè)成分和841個(gè)藥物靶點(diǎn);這些共同靶點(diǎn)涉及147條生物過程包括TNF信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路等代謝通路，內(nèi)分泌抵抗等與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的通路。結(jié)論：黃連解毒湯中小檗堿、槲皮素、山柰酚等多種成分協(xié)同作用于AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等，初步揭示了其在治療膿毒癥時(shí)的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的復(fù)雜機(jī)制過程，為未來實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 黃連解毒湯;膿毒癥;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);作用機(jī)制

Mechanism of Huanglian Jiedu Decoction in the Treatment of Sepsis Based on Network Pharmacology

DONG Qingqing1，ZHANG Yiyi1，CONG Yilei2，CHEN Wei1

（1 Department of Intensive Care Medicine，LongHua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China; 2 Department of Endocrinology，LongHua Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China）

AbstractObjective： To explore the core targets，main active components and mechanism of Huanglian Jiedu Decoction in the treatment of sepsis. Methods： The Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） was searched，with 黃連（Rhizoma Coptidis），黃芩（Radix Scutellariae），黃柏（Cortex Phellodendri），and梔子（Fructus Gardeniae） as keywords.According to bioavailability（OB）≥30% and drug-likeness（DL）≥0.18，the active components and targets of each Chinese medicinal material in Huanglian Jiedu Decoction were obtained.Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM），GeneCards，and Therapeutic Target Database（TTD） were used to screen the targets of sepsis.Then the obtained predicted components and disease targets were input in Cytoscape to construct the network of Chinese medicinal material-components-disease-targets，and the core targets and main active components were screened.The protein protein interaction（PPI） network was plotted via STRING combined with Cytoscape and topological analysis was performed.After R language running，GO analysis and KEGG pathway annotation analysis were conducted on the core targets，with the thresholds of ?P <0.05 and Q<0.05，to screen the biological processes and signaling pathways with significant differences. Results： A total of 78 components and 841 targets of Huanglian Jiedu Decoction were screened，and 147 biological pathways were involved，including metabolic pathways such as tumor necrosis factor（TNF），chemokine，hypoxia-inducible factor 1（HIF-1），and apoptosis signaling pathways，and pathways related to the endocrine system such as AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications and endocrine resistance. Conclusion： Berberine，quercetin，kaempferol and other components in Huanglian Jiedu Decoction synergistically acted on the AGE-RAGE signaling pathway，TNF signaling pathway，etc.，which preliminarily revealed the complex multi-component，multi-pathway and multi-target synergistic mechanism of Huanglian Jiedu Decoction in the treatment of sepsis，and laid a theoretical foundation for future experimental verification.E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

Keywords Huanglian Jiedu Decoction; Sepsis; Network pharmacology; Mechanism

中圖分類號(hào)：R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ?doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2022.09.012

膿毒癥（Sepsis）是嚴(yán)重感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、外科手術(shù)后常見的并發(fā)癥，可導(dǎo)致膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征（Multiple Organ Dysfunction Syndrome，MODS）。以其在重癥監(jiān)護(hù)室中的高發(fā)病率、高病死率、高治療費(fèi)用而聞名，若并發(fā)感染性休克，病死率可高達(dá)80%[1-3]。因此結(jié)合中西醫(yī)療法的各自優(yōu)勢(shì)，提高治療效果，縮短住院天數(shù)，降低其病死率，是當(dāng)前迫切需要解決的科學(xué)問題。

膿毒癥這一病名在中醫(yī)學(xué)中并未記載，中醫(yī)學(xué)者們以《傷寒論》和溫病學(xué)說作為理論基礎(chǔ)提出了膿毒癥的病機(jī)體現(xiàn)在本虛和標(biāo)實(shí)2個(gè)方面。由于發(fā)病原因和人體體質(zhì)的不同，根據(jù)正邪兩方面在疾病表現(xiàn)中所處地位，區(qū)別主次、先后，采取以扶正為主，兼顧祛邪，或以祛邪為主，兼顧扶正，隨機(jī)應(yīng)變，掌握機(jī)宜，達(dá)到有效改善預(yù)后的目的，為臨床提供參考[4-5]?，F(xiàn)代學(xué)者將膿毒癥的證型及治法概括為“三證三法”，即毒熱證與清熱解毒法，瘀血證與活血化瘀法，急性虛證與扶正固本法[6]。

黃連解毒湯最早載于葛洪所著的《肘后備急方》，由黃連、黃芩、黃柏以及梔子按照3∶ 2∶ 2∶ 3的比例配伍而成。黃連解毒湯具有清熱解毒之功效，用于治療三焦火毒所致的熱甚發(fā)斑、熱病吐血、衄血、濕熱黃疸或外科的癰瘍疔毒等疾病。臨床常用于治療膿毒癥、痢疾、肺炎等熱毒癥患者[7]。研究發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯具有顯著的抗炎、抑菌、抗氧化、抗血栓及免疫調(diào)節(jié)的作用[8-10]。由此可見黃連解毒湯對(duì)膿毒癥的治療有著舉足輕重的作用，但該中藥復(fù)方的有效活性成分及其作用靶點(diǎn)和機(jī)制仍須進(jìn)一步研究。本研究依托于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)黃連解毒湯治療膿毒癥的潛在作用靶點(diǎn)及其機(jī)制，為臨床干預(yù)治療提供新的思路。

1資料與方法

1.1藥物成分及靶點(diǎn)篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）中檢索黃連解毒湯中各藥物的成分作為潛在活性成分[11]，并根據(jù)口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18進(jìn)行篩選[12]，使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得上述成分的SDF格式化學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/），取預(yù)測(cè)得分大于0的靶點(diǎn)作為藥物靶點(diǎn)[13]。

1.2膿毒癥作用靶點(diǎn)篩選

使用在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org/）、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（Therapeutic Target Database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）以“Sepsis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將上述3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)匯總，去重后獲得疾病作用靶點(diǎn)。

1.3藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選

在Venny 2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）上輸入藥物靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。

1.4中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

使用Cytoscape 3.7.2軟件（http：//www.cytoscape.org），構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)（Node）表示黃連解毒湯的4味中藥、活性成分及潛在靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)之間則以邊（Edge）相連。使用Network Analyzer工具計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality）及緊密度中心性（Closeness Centrality）對(duì)黃連解毒湯的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[14-16]。

1.5蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相關(guān)作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述139個(gè)共同靶點(diǎn)輸入到Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins數(shù)據(jù)庫(kù)（STRING，http：//string-db.org/）[17]中進(jìn)行檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo Sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，獲取靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cystoscap 3.7.2軟件，繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6基于拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)篩選

將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap 3.7.2中，通過NetworkAnalyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，以Degree，Betweenness Centrality，Average Shortest Path Length和Closeness Centrality這4個(gè)參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)[18]，通過Degree排序，選取分值大于平均分的基因作為核心靶點(diǎn)，將前30個(gè)靶點(diǎn)使用R3.6.0繪制條形圖。

1.7基于聚類分析的核心靶點(diǎn)篩選

將已經(jīng)構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2中，使用MCODE模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點(diǎn)的篩選[19-20]。E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

1.8靶點(diǎn)的生物功能及通路富集分析

利用R語(yǔ)言的clusterProfiler工具包[21]將基因Symbol轉(zhuǎn)為基因ID，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）生物過程富集和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，保存結(jié)果，設(shè)定閾值 P <0.05， Q <0.05，篩選具有顯著性差異的生物過程及信號(hào)通路。

2結(jié)果

2.1黃連解毒湯的潛在活性成分

查找出黃柏、黃連、黃芩、梔子的化學(xué)成分分別為黃柏37個(gè)、黃連14個(gè)、黃芩36個(gè)、梔子15個(gè)，合并后刪除重復(fù)成分共得到潛在活性成分85個(gè)。使用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出黃連成分作用靶點(diǎn)448個(gè)、黃柏成分作用靶點(diǎn)699個(gè)、黃芩成分442個(gè)、梔子成分373個(gè)，最后排除重復(fù)作用靶點(diǎn)和非人體作用靶點(diǎn)得到841個(gè)藥物靶點(diǎn)。見表1。

2.2膿毒癥的潛在作用靶點(diǎn)

將OMIM、GeneCards、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的膿毒癥相關(guān)藥物靶點(diǎn)去重，共獲得疾病靶點(diǎn)816個(gè)。將841個(gè)藥物靶點(diǎn)、816個(gè)疾病靶點(diǎn)繪制韋恩圖，二者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)139個(gè)。見圖1。

2.3疾病-成分-靶點(diǎn)核心網(wǎng)絡(luò)

將黃連解毒湯中85個(gè)潛在活性成分與139個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入Cytoscape軟件中，刪除7個(gè)與疾病靶點(diǎn)無交集的活性成分，并繪制出“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。圖中紫色長(zhǎng)方形代表藥物，藍(lán)色三角形代表各活性分子，綠色圓形代表靶點(diǎn)，紅色菱形代表疾病。見圖2。對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治隹梢钥闯?，一個(gè)活性成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，作用靶點(diǎn)數(shù)量前5位的化合物分別為：5，2′-二羥基-6，7，8-三甲氧基黃酮（5，2′-Dihydroxy-6，7，8-Trimethoxyflavone），5-羥基-7，8-二甲氧基黃酮（Moslosooflavone），黃芩酮Ⅱ（SkullcapflavoneⅡ），5，7，2，5-四羥基-8，6-二甲氧基黃酮（5，7，2，5-Tetrahydroxy-8，6-Dimethoxyflavone），半枝蓮種素（Rivularin），這些化合物有可能在治療膿毒癥過程中起著重要的作用。見表2。

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

PPI網(wǎng)絡(luò)圖共有78個(gè)靶點(diǎn)可發(fā)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，有2 324條相互作用連接線，平均度值為33.4。根據(jù)Degree值大小進(jìn)行排序，Degree值越大，說明該節(jié)點(diǎn)很可能就是關(guān)鍵成分或關(guān)鍵靶點(diǎn)。見圖3～4。

2.5PPI網(wǎng)絡(luò)聚類結(jié)果

使用MCODE插件將黃連解毒湯靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，總共得到5個(gè)基因簇和4個(gè)核心基因，核心基因?yàn)門NFRSF1A、AGTR1、F2、CYP2C19。見表3，圖5。

2.6靶點(diǎn)蛋白GO分析

將139個(gè)共同靶點(diǎn)經(jīng)R語(yǔ)言運(yùn)行，GO結(jié)果顯示，黃連解毒湯治療膿毒癥共涉及2 256條生物過程（Biological Process，BP）通路，其中主要包括白細(xì)胞遷移（Leukocyte Migration）、對(duì)外界刺激的積極調(diào)節(jié)反應(yīng)（Positive Regulation of Response to External Stimulus）、肽基酪氨酸磷酸化（Peptidyl-Tyrosine Phosphorylation）等。共有74條細(xì)胞組分（Cell Component，CC）表達(dá)過程，主要涉及膜筏（Membrane Raft）、膜區(qū)（Membrane Region）、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔（Cytoplasmic Vesicle Lumen）、肥大細(xì)胞顆粒（Mast Cell Granule）、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)（Collagen-Containing Extracellular Matrix）等。141個(gè)與分子功能（Molecular Function，MF）相關(guān)的過程，主要集中于非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性（Non-Membrane Spanning Protein Tyrosine Kinase Activity）、磷酸酶結(jié)合（Phosphatase Binding）、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性（Protein Tyrosine Kinase Activity）、絲氨酸水解酶活性（Serine Hydrolase Activity）、蛋白磷酸酶結(jié)合（Protein Phosphatase Binding）。見圖6～8。

2.7KEGG通路富集分析篩選出147條KEGG通路，將前20的結(jié)果繪制成條形圖。這些通路包括了卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi Sarcoma-Associated Herpesvirus Infection）、TNF信號(hào)通路（TNF Signaling Pathway）、人巨細(xì)胞病毒感染通路（Human Cytomegalovirus Infection）。見圖9。

3討論

3.1組方分析

黃連解毒湯主治三焦積熱，邪火妄行，故用黃芩瀉肺火于上焦，黃連瀉脾火于中焦，黃柏瀉腎火于下焦，梔子通瀉三焦之火，從膀胱而出。蓋陽(yáng)盛則陰衰，火盛則水衰，故用大苦大寒之藥，抑陽(yáng)而扶陰，瀉其亢盛之火，而救其欲絕之水，然非實(shí)熱，不可輕投[7]。根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯具有抑制耐藥性、抗氧化、抗血栓形成、降糖、調(diào)脂、保護(hù)心肌、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)，最重要的是可以抗炎，抑菌，抗內(nèi)毒素及保護(hù)腦功能[22]。在現(xiàn)代臨床研究中，黃連解毒湯被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療中，尤其是在急性感染性疾病方面，如膿毒癥、急性感染性心內(nèi)膜炎、重癥肛周膿腫、急性百草枯中毒、急性盆腔炎等[23]。E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

3.2成分分析

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯潛在活性成分的口服生物利用度高，作用靶點(diǎn)廣泛。根據(jù)已有文獻(xiàn)進(jìn)一步分析，小檗堿作為黃連和黃柏的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其能夠改善學(xué)習(xí)記憶能力、保護(hù)心肌缺血的再灌注損傷、抗糖尿病、抗炎、降脂。鹽酸巴馬汀具有和小檗堿相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能有效抗炎、抗菌、抗病毒和降血糖等[24-25]。羅煜等[26]的研究表明，鹽酸巴馬汀可同時(shí)作用于核因子κB/p38MAPK信號(hào)通路和NLKP3炎癥小體信號(hào)通路上，最終減少炎癥介質(zhì)的釋放，起到良好的抗炎功效。黃芩中的黃芩苷通過對(duì)icaA和cida基因表達(dá)的降低，影響細(xì)胞間多糖黏附素（PIA）的合成和細(xì)胞外DNA（eDNA）的釋放，從而對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成產(chǎn)生抑制作用[27]。此外黃芩苷還有顯著的抗炎[28]、抗病毒[29]、清除自由基[30]、抗氧化[31]、保護(hù)腎臟[32]、抑制心肌缺血[33]和免疫調(diào)節(jié)作用[34]。山柰酚為梔子中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病原微生物和心血管系統(tǒng)保護(hù)的作用[35]。槲皮素（Quercetin），又名櫟精，是一種黃酮類化合物，具有抗氧化應(yīng)激、抑菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫及抗血小板聚集等藥理作用[36-39]。

3.3靶點(diǎn)分析

根據(jù)Degree值大小排序，對(duì)排名前30位靶點(diǎn)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步分析。其中血清白蛋白（Serum Albumin，ALB）是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)。該蛋白在調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓中起作用，并充當(dāng)多種內(nèi)源性分子（包括激素，脂肪酸和代謝產(chǎn)物）以及外源性藥物的載體蛋白，具有抗氧化和抗炎特性，可作為活性氧[40-41]和氮[42]的清除劑，并且可作為酸堿平衡的緩沖分子[43]。感染性休克患者的特點(diǎn)是內(nèi)皮屏障滲漏增加，ALB和高密度脂蛋白（High Density Lipoprotein，HDL）顯著丟失[44-45]。一磷酸鞘氨醇（Sphingosine Monophosphate，S1P）是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，負(fù)責(zé)淋巴細(xì)胞的發(fā)育、T細(xì)胞和B細(xì)胞的定位和遷移以及細(xì)胞因子的分泌等生理細(xì)胞反應(yīng)[46]。ALB和HDL等S1P載體分子參與了S1P效應(yīng)的調(diào)控[47]。因此，膿毒癥患者的S1P濃度也會(huì)降低，特別是在感染性休克患者中。

同時(shí)，一個(gè)靶分子可被不同活性成分靶向作用，如MAPK14、MPO、TLR8等。MAPK14可以參與炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子的產(chǎn)生，正向調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，在膿毒癥的發(fā)病過程中起到關(guān)鍵作用[48]。髓過氧化物酶是嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的標(biāo)志，是氧化應(yīng)激的標(biāo)志[49]。在膿毒癥早期，髓過氧化物酶的產(chǎn)生超過人體的抗氧化防御能力，這種不平衡可以導(dǎo)致直接的線粒體損害，甚至能夠?qū)е缕鞴偎ソ遊50-51]。此外，其他的研究表明，降低膿毒癥的氧化應(yīng)激可以作為一種線粒體保障策略[52-53]。因此，髓過氧化物酶可能是膿毒癥的潛在治療靶點(diǎn)。TLR8是Toll樣受體（TLR）家族的成員，因其能夠識(shí)別來自乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV），人免疫缺陷病毒（HIV）和流感病毒的單鏈RNA（ssRNA）的能力而聞名。最近，一些研究證實(shí)，TLR8介導(dǎo)的RNA識(shí)別在金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌和萊姆病螺旋體感染的檢測(cè)中起著至關(guān)重要的作用[54-56]。影響TLR8活性的溶酶體功能抑制對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌感染均具有抗炎作用，這意味著TLR8的抑制可作為膿毒癥的一種潛在治療手段[55]。

此外，本研究通過對(duì)黃連解毒湯PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析得出了其中顯著性較強(qiáng)的4個(gè)模塊，其中模塊1中包含TNFRSF1A、IL-2、TNF、TLR8、TLR7等炎癥相關(guān)因子。當(dāng)病原微生物入侵機(jī)體時(shí)，激活細(xì)胞因子釋放炎癥介質(zhì)，這表明黃連解毒湯能夠通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮治療作用。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin Angiotensin System，RAS）在膿毒癥中被激活，不僅與膿毒癥中的微血管功能障礙有關(guān)，還貫穿臟器功能紊亂的始終[57]。最近，Zhang等[58]已證明RAS的低表達(dá)與嚴(yán)重膿毒癥患者的不良預(yù)后相關(guān)。血管緊張素作為RAS的重要環(huán)節(jié)，其中腎素血管緊張素Ⅱ（Renin Angiotensin Ⅱ，Ang-2）與膿毒癥的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、血管滲漏等病理過程密切相關(guān)。目前相關(guān)研究表明，嚴(yán)重膿毒癥患者的Ang-2和腎素水平升高，而升高的程度與反應(yīng)性充血期間的微血管復(fù)氧率負(fù)相關(guān)[57]。模塊2中的核心基因?yàn)锳GTR1（AT1），AT1作為Ang-2的主要受體，大多數(shù)已知的Ang-2的作用是由AT1介導(dǎo)的。AT1具有調(diào)節(jié)血管收縮作用，并參與Ang-2調(diào)控炎癥，研究表明AT1在膿毒癥患者體內(nèi)下調(diào)[59]。

通過此網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證了黃連解毒湯治療膿毒癥是通過多成分、多靶點(diǎn)、共同調(diào)節(jié)的方式發(fā)揮作用的。

3.4通路結(jié)果分析

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯治療膿毒癥的78個(gè)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的主要生物過程涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子的分泌調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡調(diào)控等。分子功能包括蛋白激酶結(jié)合、受體活性、細(xì)胞因子活性、激酶活性調(diào)控等方面;細(xì)胞組分則主要富集在細(xì)胞區(qū)域、細(xì)胞質(zhì)膜和線粒體等方面。

黃連解毒湯的KEGG通路富集結(jié)果表明，其絕大部分基因富集在TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、EB病毒感染、趨化因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、甲型流感等炎癥通路，破骨細(xì)胞分化通路、細(xì)胞凋亡通路等代謝通路，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗等與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的通路。

眾所周知，核因子κB是炎癥反應(yīng)中的主要轉(zhuǎn)錄因子，廣泛的細(xì)胞外刺激如病毒、細(xì)菌和酵母產(chǎn)物與不同的Toll樣受體（TLR）相互作用，以及TNF、IL-1分別與TNF受體1（TNFR1）和IL-1受體（IL-1R）結(jié)合均能激活核因子κB通路，以響應(yīng)各種刺激[60]。E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

研究表明，糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）能結(jié)合細(xì)胞膜上RAGE，上調(diào)炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致組織細(xì)胞的破壞[61]，并且能夠?qū)е卵趸瘧?yīng)激和細(xì)胞功能不良，自由基產(chǎn)生以及核因子κB的活化[62]。核因子κB則能夠誘導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-α等的釋放，從而引起炎癥反應(yīng)[63]。蔡紅蝶等[64]的實(shí)驗(yàn)表明AGEs作用于腸道L細(xì)胞（GLUTag），通過上調(diào)細(xì)胞RAGE表達(dá)，從而激活NADPH氧化酶，升高p38MAPK磷酸化水平，促使核因子κB表達(dá)，釋放炎癥介質(zhì)，其發(fā)病機(jī)制與本研究預(yù)測(cè)具有一致性，而黃酮類成分能顯著調(diào)節(jié)GLUTag細(xì)胞中AGEs/RAGE/p38MAPK/核因子κB信號(hào)通路。但AGE-RAGE軸在導(dǎo)致多器官衰竭和死亡的過度炎癥反應(yīng)中的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究較少，本研究可為黃連解毒湯治療膿毒癥的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

綜上所述，本研究依托網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)黃連解毒湯治療膿毒癥的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行系統(tǒng)分析和探討，預(yù)測(cè)了黃連解毒湯中小檗堿、槲皮素、山柰酚等多種成分協(xié)同作用于AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等，初步揭示了其在治療膿毒癥時(shí)的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的復(fù)雜機(jī)制過程，為未來實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證奠定了理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Singer M，Deutschman CS，Seymour CW，et al.The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock（Sepsis-3）[J].JAMA，2016，315（8）：801-810.

[2]Fay KT，F(xiàn)ord ML，Coopersmith CM.The intestinal microenvironment in sepsis[J].Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis，2017，1863（10 Pt B）：2574-2583.

[3]Galley HF.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in sepsis[J].Br J Anaesth，2011，107（1）：57-64.

[4]羅洋.中醫(yī)藥治療膿毒血癥研究進(jìn)展[J].湖北中醫(yī)雜志，2014，36（2）：77-79.

[5]陳林靜，江艷芬.膿毒血癥診治進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，25（11）：1244-1247.

[6]李銀平.從“三證三法”看中西醫(yī)結(jié)合治療危重病的研究思路——王今達(dá)教授學(xué)術(shù)思想探討[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2004，11（1）：7-9.

[7] 許濟(jì)群.方劑學(xué)[M].5版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1985：58-59.

[8]房康，吳高榮，王輝，等.黃連解毒湯自沉淀化學(xué)成分及其抗PC12細(xì)胞損傷研究[J].中草藥，2017，48（18）：3714-3719.

[9]崔曉娟，盧卓，肖思萌，等.黃連解毒湯對(duì)UC小鼠的抗炎作用、入血成分測(cè)定及其作用靶點(diǎn)的虛擬篩選[J].中國(guó)中藥雜志，2021，46（1）：206-213.

[10] 董靜，尤凱，郭星，等.黃連解毒湯的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，16（1）：51-53.

[11]Ru J，Li P，Wang J，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].J Cheminform，2014，6：13.

[12]Liu J，Pei T，Mu J，et al.Systems Pharmacology Uncovers the Multiple Mechanisms of Xijiao Dihuang Decoction for the Treatment of Viral Hemorrhagic Fever[J].Evid Based Complement Alternat Med，2016，2016：9025036.

[13] 李鑫琦，高耀，李愛平，等.含黃芪方劑組方規(guī)律及核心藥對(duì)“黃芪-當(dāng)歸”分子機(jī)制的研究[J].中草藥，2019，50（21）：5273-5281.

[14]姚瑤.基于系統(tǒng)藥理學(xué)的中藥復(fù)方配伍及作用機(jī)制研究[D].咸陽(yáng)：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.

[15]劉惠.基于系統(tǒng)藥理學(xué)的甘草作用機(jī)制和新藥發(fā)現(xiàn)研究[D].咸陽(yáng)：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[16]張新莊，蕭偉，徐筱杰，等.利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究熱毒寧注射液抗流感病毒的分子作用機(jī)制[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29（7）：1415-1420.

[17]Szklarczyk D，F(xiàn)ranceschini A，Wyder S，et al.STRING v10：protein-protein interaction networks，integrated over the tree of life[J].Nucleic Acids Res，2015，43（Database issue）：D447-452.

[18]Zhang X，Gu J，Cao L，et al.Network pharmacology study on the mechanism of traditional Chinese medicine for upper respiratory tract infection[J].Mol Biosyst，2014，10（10）：2517-2525.E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

[19]黃秀芳，高運(yùn)吉，廖鋼，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索射麻止喘液治療哮喘的作用機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（23）：187-195.

[20]世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì).網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南[J].世界中醫(yī)藥，2021，16（4）：527-532.

[21]Yu G，Wang LG，Han Y，et al.clusterProfiler：an R package for comparing biological themes among gene clusters[J].OMICS，2012，16（5）：284-287.

[22]張保國(guó)，程鐵峰，郝錦錦.黃連解毒湯藥效學(xué)研究概況[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2009，44（16）：1204-1208.

[23]李雅.黃連解毒湯的現(xiàn)代臨床研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2018，16（24）：158-160.

[24]周鑫疊.巴馬汀抗骨關(guān)節(jié)炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2014.

[25] Long J，Song J，Zhong L，et al.Palmatine：A review of its pharmacology，toxicity and pharmacokinetics[J].Biochimie，2019，162：176-184.

[26]羅煜，吳嘉思，朱正文，等.鹽酸巴馬汀抑制NF-κB/p38 MAPK信號(hào)通路及NLRP3炎癥小體抗炎機(jī)制研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2020，31（7）：762-768.

[27]張洺嘉，謝明杰.黃芩素抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2018，34（3）：334-340.

[28]白琳，楊雨欣，萬巧鳳，等.黃芩苷經(jīng)TLR2/NF-κB途徑減輕類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜炎[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2017，33（11）：1569-1573.

[29]Nayak MK，Agrawal AS，Bose S，et al.Antiviral activity of baicalin against influenza virus H1N1-pdm09 is due to modulation of NS1-mediated cellular innate immune responses[J].J Antimicrob Chemother，2014，69（5）：1298-1310.

[30]劉淵宏，宋龍.液質(zhì)聯(lián)用法篩選黃芩中清除自由基的活性物質(zhì)[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2015，21（9）：1156-1159.

[31]Wen YF，Zhao JQ，Bhadauria M，et al.Baicalin prevents cadmium induced hepatic cytotoxicity，oxidative stress and histomorphometric alterations[J].Exp Toxicol Pathol，2013，65（1-2）：189-196.

[32]孫潔，任建功，羅暉，等.黃芩苷對(duì)2型糖尿病腎病大鼠survivin表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2019，30（1）：59-61.

[33]陳玲玲，方侃，姜敏，等.黃芩甙預(yù)處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷大鼠血流動(dòng)力學(xué)及肌鈣蛋白I濃度的影響[J].海南醫(yī)學(xué)，2018，29（14）：1931-1934.

[34]劉曉婷.黃芩苷對(duì)流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞的作用及免疫調(diào)控機(jī)制的研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[35]孔令希.山柰酚抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)理探討及其藥代動(dòng)力學(xué)研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2014.

[36]湯海波，楊萍.槲皮素對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠的作用機(jī)制[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（4）：531-534.

[37]Zaplatic E，Bule M，Shah S，et al.Molecular mechanisms underlying protective role of quercetin in attenuating Alzheimer′s disease[J].Life Sci，2019，224：109-119.

[38]Patel RV，Mistry BM，Shinde SK，et al.Therapeutic potential of quercetin as a cardiovascular agent[J].Eur J Med Chem，2018，155：889-904.

[39]黎敏，楊武斌，米本中，等.槲皮素抗癌作用機(jī)制相關(guān)研究報(bào)道[J].中藥藥理與臨床，2018，34（2）：129-132，24.

[40]King TP.On the sulfhydryl group of human plasma albumin[J].J Biol Chem，1961，236：PC5.

[41]Quinlan GJ，Margarson MP，Mumby S，et al.Administration of albumin to patients with sepsis syndrome：a possible beneficial role in plasma thiol repletion[J].Clin Sci（Lond），1998，95（4）：459-465.

[42]Stamler JS，Jaraki O，Osborne J，et al.Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1992，89（16）：7674-7677.E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

[43]Reeves RB.Temperature-induced changes in blood acid-base status：Donnan rCl and red cell volume[J].J Appl Physiol，1976，40（5）：762-767.

[44]D.C.Angus，T.van der Poll，Severe sepsis and septic shock，N.Engl[J]J Med，2013，369（9）：840-851.

[45]Winkler MS，Nierhaus A，Holzmann M，et al.Decreased serum concentrations of sphingosine-1-phosphate in sepsis[J].Crit Care，2015，19：372.

[46]Raza Z，Saleem U，Naureen Z.Sphingosine 1-phosphate signaling in ischemia and reperfusion injury[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat，2020，149：106436.

[47]Winkler MS，Nierhaus A，Poppe A，et al.Sphingosine-1-Phosphate：A Potential Biomarker and Therapeutic Target for Endothelial Dysfunction and Sepsis？[J].Shock，2017，47（6）：666-672.

[48]Dakal TC，Kala D，Dhiman G，et al.Predicting the functional consequences of non-synonymous single nucleotide polymorphisms in IL8 gene[J].Sci Rep，2017，7（1）：6525.

[49]Yu G，Liang Y，Zheng S，et al.Inhibition of Myeloperoxidase by N-Acetyl Lysyltyrosylcysteine Amide Reduces Oxidative Stress-Mediated Inflammation，Neuronal Damage，and Neural Stem Cell Injury in a Murine Model of Stroke[J].J Pharmacol Exp Ther，2018，364（2）：311-322.

[50]Liu CH，Zhang WD，Wang JJ，et al.Senegenin Ameliorate Acute Lung Injury Through Reduction of Oxidative Stress and Inhibition of Inflammation in Cecal Ligation and Puncture-Induced Sepsis Rats[J].Inflammation，2016，39（2）：900-906.

[51]Cherruault Y.New deterministic methods for global optimization and applications to biomedicine[J].Int J Biomed Comput，1991，27（3-4）：215-229.

[52]Florentino D，Giustina AD，Goldim M，et al.Early life neuroimmune challenge protects the brain after sepsis in adult rats[J].Neurochem Int，2020，135：104712.

[53]Giustina AD，Goldim MP，Danielski LG，et al.Fish oil-rich lipid emulsion modulates neuroinflammation and prevents long-term cognitive dysfunction after sepsis[J].Nutrition，2020，70：110417.

[54]Bergstrm B，Aune MH，Awuh JA，et al.TLR8 Senses Staphylococcus aureus RNA in Human Primary Monocytes and Macrophages and Induces IFN-β Production via a TAK1-IKKβ-IRF5 Signaling Pathway[J].J Immunol，2015，195（3）：1100-1111.

[55]Krüger A，Oldenburg M，Chebrolu C，et al.Human TLR8 senses UR/URR motifs in bacterial and mitochondrial RNA[J].EMBO Rep，2015，16（12）：1656-1663.

[56]Cervantes JL，La Vake CJ，Weinerman B，et al.Human TLR8 is activated upon recognition of Borrelia burgdorferi RNA in the phagosome of human monocytes[J].J Leukoc Biol，2013，94（6）：1231-1241.E252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1

[57] Doerschug KC，Delsing AS，Schmidt GA，et al.Renin-angiotensin system activation correlates with microvascular dysfunction in a prospective cohort study of clinical sepsis[J].Crit Care，2010，14（1）：R24.

[58]Zhang W，Chen X，Huang L，et al.Severe sepsis：Low expression of the renin-angiotensin system is associated with poor prognosis[J].Exp Ther Med，2014，7（5）：1342-1348.

[59]Bucher M，Ittner KP，Hobbhahn J，et al.Downregulation of angiotensin Ⅱ type 1 receptors during sepsis[J].Hypertension，2001，38（2）：177-182.

[60]Yu XH，Zheng XL，Tang CK.Nuclear Factor-κB Activation as a Pathological Mechanism of Lipid Metabolism and Atherosclerosis[J].Adv Clin Chem，2015，70：1-30.

[61]Yan SF，D′Agati V，Schmidt AM，et a1.Receptor for Advanced Glycation Endproducts（RAGE）：a fomidable force in the pathogenesis of the cardiovascular complications of diabetes & aging[J].Curr Mol Med，2007，7（8）：699-7l0.

[62]Bierhaus A，Hofmann MA，Ziegler R，et a1.AGEs and their interaction with AGE-receptors in Vascular disease and diabetes mellitus.I.The AGE concept[J].CardioVasc Res，1998，37（3）：586-600.

[63]王悅，申潔，何倩，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)探討黃芩茶防治結(jié)直腸癌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制[J].中國(guó)中藥雜志，2021，46（23）：6251-6260.

[64]蔡紅蝶，宿樹蘭，陶偉偉，等.黃蜀葵花中5種黃酮類化合物對(duì)腸道L細(xì)胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2017，33（6）：798-805.

（2021-03-03收稿本文編輯：魏慶雙）

基金項(xiàng)目：上海市重大危重醫(yī)療事件中西醫(yī)協(xié)同響應(yīng)與干預(yù)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（ZY2018-2020-FWTX-7004）作者簡(jiǎn)介：董青青（1994.07—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療急危重癥，E-mail：sixi16602152267@163.com通信作者：陳偉（1962.07—），男，博士研究生，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：心血管和危重病的中西醫(yī)結(jié)合防治，E-mail：cwdoctor@163.comE252CE8C-1804-4876-88BA-9A8218C9F1C1