鄭乾明，王小柯，馬玉華

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)科學(xué)研究所，貴陽(yáng) 550006)

【研究意義】火龍果(Hylocereusspp.)是仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereus)多年生果樹(shù)，近年來(lái)在我國(guó)臺(tái)灣、廣西、廣東、貴州、云南和海南等省種植，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益?；瘕埞饕芗仔途€(xiàn)狀病毒科(Alphaflexiviridae)馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)病毒[1-5]及近期發(fā)現(xiàn)的花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)桿狀DNA病毒屬(Badnavirus)病毒侵染[6]。分離和分析病毒基因組全長(zhǎng)序列，有助于了解其遺傳變異和多樣性，為病毒檢測(cè)和防控奠定理論基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】侵染火龍果的馬鈴薯X病毒屬病毒主要包括仙人掌X病毒(CactusvirusX，CVX)[1-2,4-5,7-10]、蟹爪蘭X病毒(ZygocactusvirusX，ZyVX)[3-5,11]、仙人指X病毒(SchlumbergeravirusX，SchVX)[3-5, 12]和火龍果X病毒(PitayavirusX，PiVX)[5]。CVX在我國(guó)臺(tái)灣[1-2]、貴州[4-5]和海南[7,10]等省以及韓國(guó)[8]和美國(guó)[9]均有報(bào)道，但對(duì)ZyVX和PiVX侵染火龍果的研究較少。ZyVX最早于2004年在蟹爪蘭(Zygocactusspp.)中分離獲得B1分離物基因組全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào)：AY366208)[13]，此后于2008年在巴西火龍果中檢測(cè)到[3]，后來(lái)在臺(tái)灣火龍果中報(bào)道P39分離物基因組全長(zhǎng)(GenBank登錄號(hào)：JF930326)，在貴州火龍果中報(bào)道GZ分離物基因組近全長(zhǎng)序列[11]。ZyVX為單分體正義單鏈RNA病毒，含有5個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)[11]，ORF1編碼依賴(lài)RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)，ORF2-4分別編碼TGB1-3蛋白(Trige gene block 1-3)，ORF5編碼外殼蛋白(Coat protein，CP)。PiVX于2011年在我國(guó)臺(tái)灣省首次報(bào)道P37分離物基因組序列(GenBank登錄號(hào)：JF930327)，此后僅在仙人掌科錦繡玉屬(Parodia)金晃(P.leninghausii)報(bào)道NI分離物編碼CP的ORF序列(GenBank登錄號(hào)：KY581589)[14]。近期，在貴州省61份火龍果樣品中檢測(cè)PiVX發(fā)生率為96.72%[5]。由此可見(jiàn)，ZyVX和PiVX均普遍侵染火龍果。【本研究切入點(diǎn)】目前報(bào)道的ZyVX和PiVX基因組全長(zhǎng)序列較少，無(wú)法開(kāi)展病毒基因組序列差異和和系統(tǒng)進(jìn)化分析，不清楚其遺傳變異和多樣性。因此，采用RNA-seq對(duì)病毒感染火龍果樣品進(jìn)行高通量測(cè)序和分析，組裝獲得ZyVX和PiVX基因組序列?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】獲得ZyVX和PiVX基因組序列全長(zhǎng)，開(kāi)展序列變異、基因重組和系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品于2017年8月采集自貴州省羅甸縣和鎮(zhèn)寧縣火龍果果園。于火龍果盛果期采集莖表面表現(xiàn)黃化褪綠、斑駁和畸形等疑似病毒病癥狀的樣品，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。用無(wú)菌水清洗后晾干，切取莖組織在液氮中速凍。所有樣品均在-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 RT-PCR檢測(cè)

檢測(cè)ZyVX和PiVX的引物，總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR、RT-PCR擴(kuò)增和電泳等步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]和[5]中的方法。

1.3 RNA-seq分析

篩選獲得6份含有ZyVX和PiVX的樣品，使用去核糖體RNA試劑Ribo-ZeroTMrRNA Removal Kit(Epicentre公司)去除樣品中的寄主核糖體RNA。剩余的總RNA片段化，然后合成第一鏈和第二鏈cDNA。經(jīng)產(chǎn)物末端修復(fù)，連接測(cè)序接頭，片段大小選擇和PCR擴(kuò)增等步驟完成測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建。利用Illumina HiSeq 4000進(jìn)行雙末端各150 bp測(cè)序，每份樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量約15～20 Gb。測(cè)序獲得的raw read進(jìn)行過(guò)濾，每份樣品產(chǎn)生的clean read利用Trinity軟件單獨(dú)組裝[15]，獲得的contig序列使用Blast程序在NCBI非冗余核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和注釋。

1.4 序列分析

ORF預(yù)測(cè)使用ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)，核苷酸序列翻譯成氨基酸使用在線(xiàn)ExPASy程序(https://web.expasy.org/translate/)，核苷酸及氨基酸的序列一致性計(jì)算使用Lasergene軟件(DNASTAR，USA)中的MegAlign程序。

1.5 重組和系統(tǒng)進(jìn)化分析

基因重組分析使用RDP4程序，首先利用ClustalW進(jìn)行序列的多重比對(duì)，然后使用RDP、GENBCONV、BootScan、Maxchi、Chimaera和SiScan等6種算法共同分析。在有4種以上算法支持的情況下，同時(shí)P<10-6時(shí)，認(rèn)為存在明顯的重組。

從NCBI下載CVX(GenBank登錄號(hào)：AF308158)，CVX-NTU(GenBank登錄號(hào)：JF937699)，SchVX-K11(GenBank登錄號(hào)：AY366207)，OpVX(GenBank登錄號(hào)：AY366209)基因組序列，連同ZyVX和PiVX各分離物序列，利用ClustalW程序進(jìn)行多重序列比對(duì)。在MEGA 7.0軟件中利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap檢驗(yàn)設(shè)置為1000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZyVX和PiVX貴州分離物的相關(guān)序列

對(duì)6份樣品產(chǎn)生的clean read分別組裝，產(chǎn)生的contig序列在NCBI網(wǎng)站中利用BLAST程序檢索和注釋(表1)，共獲得ZyVX相關(guān)貴州分離物序列4條，分別命名為ZyVX-GZ-RF、ZyVX-GZ-ZNF、ZyVX-GZ-ZNS和ZyVX-GZ-ZYP，去除poly A后，長(zhǎng)度為6570～6600 bp，在其基因組5′末端缺失24～34 bp，3′末端缺失12～20 bp，覆蓋參考基因組ZyVX-P39分離物基因組序列的99.2%～99.6%。共獲得PiVX相關(guān)貴州分離物序列3條，分別命名為PiVX-GZ-RF、PiVX-GZ-ZNS和PiVX-GZ-ZYP，去除poly A后，長(zhǎng)度分別為6649～6657 bp，在其基因組5′末端缺少14～22 bp，3′末端均完整，覆蓋參考基因組PiVX-P37分離物序列的99.3%～99.8%。

表1 基于RNA-seq獲得的ZyVX和PiVX貴州分離物基因組序列

2.2 基因組序列差異

將獲得的ZyVX和PiVX貴州分離物與基因序列全長(zhǎng)的分離物ZyVX-P39、ZyVX-B1、ZyVX-GZ[11]、PiVX-P37以及侵染火龍果的馬鈴薯X病毒屬病毒CVX、CVX-NTU和SchVX-K11共同計(jì)算序列一致性結(jié)果(表2)表明，4條ZyVX貴州分離物之間的基因組序列一致性為96.7%～99.5%，與ZyVX-P39及ZyVX-B1一致性為95.2%～96.9%，與ZyVX-GZ一致性為91.4%～92.2%，與CVX、CVX-NTU和SchVX一致性為68.0%～73.6%。3條PiVX貴州分離物之間的基因組序列一致性為98.2%～98.5%，與PiVX-P37一致性為98.0%～99.1%。PiVX貴州分離物和ZyVX貴州分離物之間的序列一致性為68.6%～69.1%，與CVX、CVX-NTU及SchVX-K11序列一致性為68.9%～71.1%。

表2 ZyVX和PiVX貴州分離物及其他病毒的基因組序列一致性

2.3 ORF編碼的氨基酸序列差異

從表3看出，ZyVX貴州分離物之間RdRP、TGB1、TGB2、TGB3和CP編碼的氨基酸序列一致性分別為98.5%～99.8%、97.4%～98.7%、96.5%～100.0%、93.8%～100.0%和97.3%～100.0%。ZyVX貴州分離物與P39、GZ分離物RdRP編碼的氨基酸序列一致性分別為98.1%～98.4%和97.0%～97.1%，低于ZyVX貴州分離物之間的序列一致性；與B1分離物RdRP和TGB1編碼的氨基酸序列一致性較低，分別為97.2%～97.5%和93.9%～95.2%。PiVX貴州分離物之間RdRP、TGB1、TGB2、TGB3和CP編碼的氨基酸序列一致性分別為98.5%～98.7%、99.6%～100.0%、98.2%～99.1%、100.0%和97.8%～99.1%，其與P37分離物各ORF編碼的氨基酸序列一致性分別為98.2%～99.3%、99.6%～100.0%、98.2%～100.0%、100.0%和97.3%～99.6%。

表3 ZyVX和PiVX貴州分離物ORF編碼的氨基酸序列一致性

2.4 重組與系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)ZyVX貴州分離物、P39、B1和GZ，PiVX貴州分離物和P37分別進(jìn)行基因重組分析，均未發(fā)現(xiàn)明顯的重組事件。將上述分離物基因組序列與CVX、CVX-NTU、SchVX-K11和OpVX共同進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(圖1)表明，ZyVXs、PiVXs均與CVX、CVX-NTU、SchVX-K11和OpVX等明顯分開(kāi)；4條ZyVX貴州分離物與P39親緣關(guān)系最近，然后與B1和GZ聚為一類(lèi)，未見(jiàn)明顯的遺傳分化。3條PiVX貴州分離物與P37聚為一類(lèi)，也未見(jiàn)明顯的遺傳分化。

圖1 基于基因組序列的ZyVX和PiVX貴州分離物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討 論

基于Illumina平臺(tái)的RNA-seq廣泛用于侵染園藝作物的病毒挖掘和鑒定，其具有讀長(zhǎng)較短、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)[16]。測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方式對(duì)后續(xù)結(jié)果至關(guān)重要，目前普遍采取富集mRNA、提取病毒雙鏈RNA、提取小RNA和去除寄主核糖體RNA等方式構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)[17-21]。其中，通過(guò)提取總RNA并去除寄主核糖體RNA后構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，近年來(lái)成功應(yīng)用于油桃[22]、甜櫻桃[23]、蘋(píng)果[24]和茶樹(shù)[25]等多年生木本園藝作物中的病毒鑒定。本研究對(duì)含有ZyVX和PiVX的火龍果樣品進(jìn)行RNA-seq分析，分別獲得4條ZyVX和3條PiVX貴州分離物基因組近全長(zhǎng)序列。相比于使用RT-PCR分段擴(kuò)增的策略，使用RNA-seq分析能夠快速獲得大量分離物基因組近全長(zhǎng)序列。盡管在其基因組5′和3′末端缺失若干核苷酸，但仍覆蓋參考基因組全長(zhǎng)的99.3%～99.8%。這些分離物基因組近全長(zhǎng)序列均包含5個(gè)完整的ORF序列，能夠開(kāi)展ZyVX和PiVX群體的遺傳變異分析。

本研究獲得的4條ZyVX分離物之間基因組序列一致性為96.7%～99.5%，其與B1和P39分離物的序列一致性明顯高于與GZ分離物。B1分離物于2004年在蟹爪蘭(Zygocactusspp.)中分離獲得基因組全長(zhǎng)[13]，蟹爪蘭與火龍果屬仙人掌科不同屬植物。P39分離物于2014年在我國(guó)臺(tái)灣省火龍果植株中分離獲得基因組全長(zhǎng)。GZ分離物于2017年利用RT-PCR分段擴(kuò)增的策略，從貴州火龍果獲得基因組近全長(zhǎng)序列[11]。系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明本研究獲得的ZyVX分離物與B1和P39分離物的親緣關(guān)系較GZ分離物更近。研究表明，基因突變和重組是RNA病毒產(chǎn)生變異，從而適應(yīng)寄主和環(huán)境的主要途徑[26]。上述分離物均未發(fā)生明顯的遺傳重組，其基因組變異均為單核苷酸變異。這說(shuō)明自2004 年首次報(bào)道ZyVX以來(lái)，其基因組序列在同科不同屬種寄主中未發(fā)生明顯的單核苷酸變異，但在近幾年來(lái)發(fā)生一定程度的基因組單核苷酸變異。這可能與近年來(lái)火龍果大規(guī)模種植，同時(shí)獲得的病毒群體數(shù)量較多有關(guān)。不過(guò)，從ORF編碼的氨基酸序列一致性來(lái)看，其氨基酸水平上未出現(xiàn)明顯的變異。

2015年來(lái)多次報(bào)道我國(guó)東南沿海地區(qū)進(jìn)境火龍果種苗中檢測(cè)到攜帶PiVX。最近利用RT-PCR檢測(cè)多份貴州火龍果樣品，PiVX檢出率為96.7%[5]。PiVX普遍侵染火龍果，目前尚不了解其基因組序列的遺傳變異。本研究獲得的3條PiVX分離物基因組與首次報(bào)道的P37分離物間未發(fā)生明顯的重組和遺傳分化，變異均為單核苷酸變異。3條PiVX分離物與P37分離物基因組序列一致性為98.0%～99.1%，ORF編碼的氨基酸序列一致性為97.3%～100%，說(shuō)明目前PiVX分離物群體的遺傳變異較小。

4 結(jié) 論

本研究分離4條ZyVX和3條PiVX貴州分離物基因組近全長(zhǎng)序列，豐富了ZyVX和PiVX的群體數(shù)量。ZyVX和PiVX貴州分離物之間的基因組序列一致性分別為96.7%～99.5%和98.2%～98.5%。其變異均為單核苷酸變異，未發(fā)現(xiàn)基因重組和明顯的遺傳分化。因此，ZyVX和PiVX群體的基因組序列變異較小，有利于快速建立病毒檢測(cè)體系，為研究病毒的流行、傳播途徑和防控奠定理論基礎(chǔ)。