基于ADH3基因的野生大麥系統(tǒng)進(jìn)化分析

王夢(mèng)薇，周羽，王樹杰，沈輝，任喜峰

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.河南省駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，駐馬店 463000；3.湖北省襄陽(yáng)市原種繁殖場(chǎng)，襄陽(yáng) 441004

大麥?zhǔn)鞘澜缟献钤绫获Z化的作物［1］。因其具有早熟、豐產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)和適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，成為世界廣泛栽培的作物之一［2］。野生大麥作為栽培大麥的祖先，其在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中，積累了大量抗病蟲害、抗旱、耐鹽、耐貧瘠等優(yōu)良基因［3］，是大麥進(jìn)行遺傳育種和品種改良的重要基因資源［2］。然而，野生大麥的系統(tǒng)演化機(jī)制尚存在很大的分歧，一些研究者認(rèn)為近東新月沃地是大麥的唯一起源地［1，4-9］，也有學(xué)者支持近東、中國(guó)西藏、中亞、埃及、利比亞和埃塞俄比亞等大麥多起源理論［10-15］。目前，大量的分子證據(jù)證實(shí)，除了近東新月沃地，中亞和中國(guó)西藏是大麥的潛在馴化中心［12，15-16］。也有學(xué)者證實(shí)西藏是大麥的多樣性中心而非起源中心，因?yàn)檎也坏揭吧郝涞拇嬖?，西藏野生大麥?shí)際上是以雜草的形式存在于田埂的半野生大麥［6］。另?yè)?jù)報(bào)道，西藏的大麥?zhǔn)墙鼥|野生大麥向東擴(kuò)散到中亞后，繼續(xù)向東由巴基斯坦、印度擴(kuò)散到中國(guó)西藏［1，6］，也有學(xué)者認(rèn)為西藏大麥?zhǔn)怯山鼥|通過(guò)青藏高原以北地區(qū)進(jìn)入東亞，再到達(dá)東南部青藏高原［17-18］。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因和基因組重測(cè)序等分子手段可更高效地研究大麥的進(jìn)化及馴化，乙醇脫氫酶基因（ADH）具有催化乙醇分解的生物學(xué)功能，在禾本科植物遺傳研究中被廣泛應(yīng)用，研究表明該基因在大麥中含有3 個(gè)拷貝［19］；乙醇脫氫酶Ⅲ基因（ADH3）可揭示大麥種群的地理分布格局，也可用于檢測(cè)大麥屬植物在進(jìn)化中曾發(fā)生的重組和漸滲事件［20］。本研究基于ADH3基因?qū)?1份來(lái)自近東、中亞和中國(guó)西藏的野生大麥進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，明確不同地理區(qū)域野生大麥的遺傳進(jìn)化關(guān)系，旨在為研究栽培大麥的起源提供參考，為野生大麥的優(yōu)異種質(zhì)資源的收集和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料為91份野生大麥，按地理來(lái)源分為3個(gè)群體，其中近東野生大麥48份，西藏野生大麥20份，中亞野生大麥23份（表1）。這些野生大麥種質(zhì)資源均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)麥作課題組提供。所有材料種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)田，每份材料1 行，行長(zhǎng)1.5 m，行距20 cm。每份材料在3 葉期取10 株葉片混樣提取DNA。

表1 91份野生大麥種質(zhì)信息Table 1 91 germplasm information of wild barley

1.2 DNA擴(kuò)增和測(cè)序

乙醇脫氫酶Ⅲ基因（ADH3）的引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增均按Lin 等［19］的方法，該基因擴(kuò)增片段為810 bp，PCR 產(chǎn)物經(jīng)QIAquickTM PCR 純化試劑盒（Qiagen 公司）進(jìn)行純化后，送泰和生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序。為了提高測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量，每個(gè)樣本獨(dú)立擴(kuò)增3 次并測(cè)序，且正向和反向鏈均獨(dú)立測(cè)序，分析序列長(zhǎng)度為736 bp。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用軟件MAFFT 對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，將比對(duì)后的nex 格式文件導(dǎo)入 PAUP4 中，再?gòu)?Modeltest 軟件中選56個(gè)模型放入PAUP4中搜索最佳模型，根據(jù)最佳模型運(yùn)用MrBayes 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。一直增加‘mcmc ngen’的值，使其達(dá)到30 000 000，此時(shí)的‘a(chǎn)verage standard deviation of split frequencies’小 于0.01，即已構(gòu)建出能收斂的系統(tǒng)發(fā)育樹。之后將‘sump burnin’與‘sumt burnin=’均設(shè)置為500，構(gòu)建出的共識(shí)樹最后利用Treeview 軟件進(jìn)行可視化；使用STRUCTURE v.2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析；在混合模型下，首先對(duì)K從2到4分別進(jìn)行10次獨(dú)立模擬運(yùn)算，每次模擬進(jìn)行500 000 次預(yù)迭代（length of burn-in period）和1 000 000 次基于馬爾可夫鏈蒙特卡羅迭代（Markov Chain Monte Carlo，MCMC）。之后利用Structure Harvester與Clumpak對(duì)群體結(jié)構(gòu)的結(jié)果計(jì)算后驗(yàn)概率值（LnP（D））以及K為2～4 時(shí)計(jì)算每份種質(zhì)的遺傳成分。對(duì)比后的序列用DnaSP6軟件進(jìn)行單倍型分析，最后在PopART 軟件中制作單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生大麥ADH3基因序列的遺傳分析

將本研究的91份不同來(lái)源野生大麥材料基于ADH3基因序列的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（S）、單倍型個(gè)數(shù)（H）、單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（π）以及沃特森估計(jì)值（θW）等指標(biāo)進(jìn)行遺傳差異分析（表2）。結(jié)果顯示，3 個(gè)不同來(lái)源野生大麥群體的核苷酸多態(tài)性突變位點(diǎn)總數(shù)為48 個(gè)，其中近東野生大麥具有最多的多態(tài)性位點(diǎn)個(gè)數(shù)（S=46），幾乎涵蓋了所有多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)；而中亞與西藏野生大麥的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量較少，分別為35 個(gè)和31 個(gè)。從單倍型個(gè)數(shù)看，3 個(gè)野生大麥群體總的單倍型個(gè)數(shù)為26，近東野生大麥的單倍型個(gè)數(shù)最多（H=22），中亞與西藏野生大麥的單倍型個(gè)數(shù)分別為8 和5。從單倍型多樣性看，近東野生大麥群體的單倍型多樣性最高，為0.914；而中亞與西藏野生大麥的單倍型多樣性較低，分別為0.810 和0.753。從核苷酸多樣性看，近東野生大麥群體的π值最高，為0.012 65±0.002 47；其次是西藏野生大麥，為0.012 16±0.004 38；中亞野生大麥最低，為0.011 10±0.004 19。從沃特森估計(jì)值結(jié)果看，近東野生大麥θW值最高，為0.014 40；而西藏野生大麥的θW值最低，為0.012 14。綜上，近東野生大麥的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、單倍型個(gè)數(shù)及遺傳多樣性均遠(yuǎn)高于中亞和西藏野生大麥。

表2 野生大麥ADH3基因的遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity of ADH3 gene in wild barley

2.2 野生大麥ADH3基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了研究3 個(gè)不同來(lái)源野生大麥群體單倍型之間的關(guān)聯(lián)性，對(duì)26 個(gè)不同的單倍型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析（圖1）。結(jié)果顯示，3 個(gè)群體的不同單倍型以近東和西藏野生大麥共有的單倍型Hap9 為一個(gè)大的多樣性中心點(diǎn)，向周圍進(jìn)行點(diǎn)狀發(fā)散，推斷Hap9 可能是一個(gè)古老單倍型。其次是近東和中亞野生大麥共有的單倍型Hap1 和3 個(gè)地區(qū)野生大麥共有的單倍型Hap10也各自形成一個(gè)小的多樣性中心。此外，近東野生大麥存在特有的單倍型共15 個(gè)，而中亞和西藏野生大麥特有的單倍型分別只有2 個(gè)（Hap3 和Hap5）和1 個(gè)（Hap24）。這更進(jìn)一步奠定了近東作為大麥起源中心的地位，同時(shí)，由于中亞和西藏獨(dú)特的地理環(huán)境增加了新的單倍型出現(xiàn)。另外，近東野生大麥與西藏野生大麥群體的單倍型相距較近，推測(cè)西藏野生大麥可能來(lái)源于近東野生大麥。

圖1 野生大麥ADH3基因序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Haplotype network of ADH3 gene sequences in wild barley

為進(jìn)一步探究3 個(gè)不同野生大麥群體之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，基于ADH3基因序列對(duì)91份不同來(lái)源野生大麥材料構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果顯示，91份不同來(lái)源野生大麥材料主要被分成2 個(gè)大的類群（Ⅰ和Ⅱ），每個(gè)類群又分成3～4 個(gè)亞群。且81%的近東野生大麥和80%的西藏野生大麥聚類于Ⅰ類群，91%的中亞野生大麥與少部分近東和西藏野生大麥混合聚類于Ⅱ類群，從各材料間進(jìn)化樹的聚類情況來(lái)看，ADH3基因在野生大麥的種系發(fā)育上存在較明顯的分化。其中，近東野生大麥與西藏野生大麥的親緣關(guān)系更近，而中亞野生大麥與西藏野生大麥的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

群體結(jié)構(gòu)分析有助于進(jìn)一步明確不同地理區(qū)域野生大麥之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系，對(duì)91份野生大麥的SNP 進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析（圖3）。設(shè)置其群體結(jié)構(gòu)值（K值）為2～4，當(dāng)K=2 時(shí)，91份野生大麥被分為紅色和藍(lán)色2個(gè)亞群，其中近東和西藏野生大麥以藍(lán)色亞群為主，中亞野生大麥以紅色亞群為主；當(dāng)K=3時(shí)，91份野生大麥被分為紅色、藍(lán)色和綠色3個(gè)亞群，近東野生大麥和西藏野生大麥種質(zhì)仍以藍(lán)色亞群為主，同時(shí)增加了大量綠色亞群的成分，中亞野生大麥仍以紅色亞群為主；當(dāng)K=4 時(shí)，91份野生大麥被分為紅色、藍(lán)色、綠色和黃色4個(gè)亞群，近東野生大麥和西藏野生大麥仍保持相似的群體結(jié)構(gòu)，而中亞野生大麥仍以紅色亞群為主。這說(shuō)明一方面西藏野生大麥的遺傳成分與近東野生大麥相近，與系統(tǒng)進(jìn)化分析得到的結(jié)果相一致（圖1，2）；另一方面也可能是西藏野生大麥和近東野生大麥之間存在互相傳播導(dǎo)致基因交流的可能。

圖3 野生大麥群體的群體結(jié)構(gòu)（K=2、3、4）Fig.3 Population structure of wild barley populations（K=2，3，4）

3 討 論

大麥在馴化過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷遺傳瓶頸［21-22］和人為干擾［23］等現(xiàn)象，致使其丟失大量的遺傳多樣性［24］，而起源地的野生大麥群體通常表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性［25］。本研究對(duì)91份不同來(lái)源的野生大麥基于ADH3基因序列的遺傳差異分析結(jié)果表明，近東野生大麥不僅具有最多的多態(tài)性位點(diǎn)個(gè)數(shù)（S=46）和單倍型個(gè)數(shù)（H=22），而且近東野生大麥群體的單倍型多樣性（Hd=0.914）和核苷酸多樣性（π=0.012 65±0.002 47）均明顯高于中亞與西藏野生大麥。推測(cè)近東野生大麥?zhǔn)窃耘啻篼湹钠鹪粗行?，而中亞和西藏野生大麥可能是由近東野生大麥擴(kuò)散后形成的新的多樣性馴化中心，所得結(jié)論支持近東單起源假說(shuō)［1，4-9］。

其次，進(jìn)化和群體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果表明3個(gè)群體的不同單倍型以近東和西藏野生大麥共有的單倍型Hap9 為中心形成一個(gè)大的多樣性中心點(diǎn)，且81%的近東野生大麥和80%的西藏野生大麥聚類于Ⅰ類群，91%的中亞大麥與少部分近東和西藏野生大麥混合聚類于Ⅱ類群。群體結(jié)構(gòu)分析也表明西藏野生大麥的遺傳成分與近東野生大麥非常相近，表明近東野生大麥和西藏野生大麥群體之間有更近的親緣關(guān)系。推測(cè)可能是西藏野生大麥和近東野生大麥之間存在互相傳播導(dǎo)致基因交流的可能。這不同于大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為的近東野生大麥先擴(kuò)散到中亞后，繼續(xù)向東由巴基斯坦、印度擴(kuò)散到中國(guó)西藏的路徑［1，6］，而支持由考古證實(shí)的西藏大麥?zhǔn)怯山鼥|通過(guò)青藏高原以北地區(qū)進(jìn)入東亞，再到達(dá)東南部青藏高原的傳播途徑［17-18］。

本研究通過(guò)對(duì)不同來(lái)源野生大麥材料進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，有助于進(jìn)一步了解野生大麥的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，明確3 個(gè)潛在的大麥起源地近東、西藏、中亞野生大麥的遺傳進(jìn)化關(guān)系，可為探究大麥的起源提供分子依據(jù)，為大麥育種家對(duì)種質(zhì)資源收集、抗性遺傳改良等方面的育種工作打下基礎(chǔ)。