芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究與實驗驗證

鄒陶媛 寧云紅 郭承偉

摘要 目的：通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測芍藥甘草湯主要活性成分治療葡萄膜炎的作用機(jī)制，并選擇T細(xì)胞受體信號通路所介導(dǎo)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化后的效應(yīng)分子γ干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素（IL）-10進(jìn)行驗證。方法：檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具庫（BATMAN-TCM），篩選芍藥甘草湯成分、靶點(diǎn)和葡萄膜炎靶點(diǎn)。使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、成分疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)、靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。拓?fù)浞治龊Y選關(guān)鍵靶點(diǎn)后使用軟件插件ClueGO進(jìn)行基因本體（GO）、京都基因和基因組百科全書（KEGG）分析。采用光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白混合完全弗氏佐劑及結(jié)核桿菌皮下注射復(fù)制實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型，HE染色檢測視網(wǎng)膜炎癥變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清IFN-γ、IL-10含量。結(jié)果：芍藥甘草湯中47種候選成分（白芍35種、炙甘草12種），涉及治療葡萄膜炎作用靶點(diǎn)164個，拓?fù)浞治鲫P(guān)鍵靶點(diǎn)33個。富集分析結(jié)果表明，芍藥甘草湯治療葡萄膜炎可能與細(xì)胞對活性氧的反應(yīng)、多種細(xì)胞增殖與分化、一氧化氮與神經(jīng)遞質(zhì)等分子的代謝調(diào)節(jié)、IL-6的細(xì)胞反應(yīng)等生物過程有關(guān)，涉及IL-17信號通路、TNF信號途徑、Th17細(xì)胞分化、T細(xì)胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路等。芍藥甘草湯可緩解大鼠視網(wǎng)膜炎癥，降低炎癥評分（P<0.01），減少IFN-γ和增加IL-10的含量（均P<0.01）。結(jié)論：芍藥甘草湯治療葡萄膜炎過程涉及多個重要炎癥與免疫通路，這將成為研究其作用機(jī)制的重要參考。

關(guān)鍵詞 芍藥甘草湯;葡萄膜炎;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);炎癥;免疫;實驗性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型;γ干擾素;白細(xì)胞介素-10

Mechanism of Shaoyao Gancao Decoction against Uveitis：Based on Network Pharmacology and Experimental Verification

ZOU Taoyuan1，NING Yunhong2，GUO Chengwei1，2

（1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250355，China; 2 Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250011，China）

Abstract Objective：This study predicted the targets of the active compounds of Shaoyao Gancao Decoction（SGD） through network pharmacology，to explore the mechanism of SGD against uveitis.Moreover，the effectors interferon（IFN）-γ and interleukin（IL）-10 after T cell receptor signaling pathway-mediated T cell transformation were selected for the verification.Methods：The components and targets of SGD and the targets of uveitis were searched from databases.The component-target network，component-disease target network，and protein-protein interaction network were constructed with Cytoscape 3.7.2.The key targets were screened by topological analysis，followed by Gene Ontology（GO） term and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment of the targets with Cytoscape 3.7.2 plug-in ClueGO.Autoimmune uveitis was induced in rats through subcutaneous injection of the mixture of inter-photoreceptor retinoid-binding protein and complete Freund′s adjuvant，and tubercle bacillus.The changes of retinal inflammation were detected based on hematoxylin and eosin（HE） staining and the content of IFN-γ and IL-10 in serum was measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：A total of 47 candidate components（35 from Radix Paeoniae Alba and 12 from Radix Glycyrrhizae Preparata） of SGD，164 targets against uveitis，and 33 key targets were screened out.The key targets were mainly involved in the biological processes such as cell response to reactive oxygen species，proliferation and differentiation of various cells，metabolic regulation of nitric oxide and neurotransmitters，and cellular response of IL-6，and the pathways of IL-17 signaling pathway，tumor necrosis factor（TNF） signaling pathway，Th17 cell differentiation，T cell receptor signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B（PI3K-AKT） signaling pathway，etc.SGD can relieve retina inflammation，decrease inflammation score（P<0.01），lower IFN-γ level，and raise IL-10 content（Ps<0.01），which validated part of the prediction results of network pharmacology.Conclusion：SGD exerts therapeutic effect on uveitis through multiple important immune and inflammatory pathways，which can serve as a reference for exploring the mechanism.641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

Keywords Network pharmacology; Shaoyao Gancao Decoction; Uveitis; Inflammation; Immune; Experimental autoimmune uveitis; IFN-γ; IL-10

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.08.005

葡萄膜炎是眼科常見疾病，也是主要致盲眼病之一。研究表明，各種類型葡萄膜炎的總體致盲率高達(dá)18.76%，其中白塞綜合征的致盲率甚至超過30.00%，與青光眼致盲率相近[1]。葡萄膜炎以青壯年患者為主，導(dǎo)致患者過早喪失勞動能力[2]。研究表明，自身免疫反應(yīng)是除感染因素外導(dǎo)致葡萄膜炎發(fā)生的最重要原因[3]。中醫(yī)中藥在葡萄膜炎的治療和后期康復(fù)的過程中被廣泛應(yīng)用，可以通過調(diào)節(jié)人體免疫功能以達(dá)到抗炎的作用，并取得良好成效[1]。

葡萄膜炎中醫(yī)稱為“瞳神緊小”病，是瞳神持續(xù)性縮小，展縮失靈的病理狀態(tài)。芍藥甘草湯最早見于《傷寒論》，為柔肝緩急的代表方劑，主治筋脈痙攣疼痛。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該病的潛在病因與肝失濡養(yǎng)，陰虛而致虛火上炎有關(guān)[4]，故以芍藥甘草湯治療葡萄膜炎，病證相合。同時，課題組也開展相應(yīng)臨床試驗，結(jié)果顯示芍藥甘草湯治療葡萄膜炎效果顯著，可提高患者視力，降低中醫(yī)證候積分[5]。

鑒于芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的機(jī)制尚未充分闡明，故選擇網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，篩選芍藥甘草湯的主要活性化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)，收集葡萄膜炎已知的疾病靶點(diǎn)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾癈ytoscape 3.7.2軟件ClueGO插件富集分析結(jié)果，挖掘芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的多成分、多靶點(diǎn)作用機(jī)制，并通過復(fù)制實驗性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveitis，EAU）大鼠模型，使用芍藥甘草湯治療后驗證相關(guān)結(jié)果，為芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的炎癥機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

5～8周齡SD大鼠，雄性，30只，體質(zhì)量為（180±20）g，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司[動物許可證號：SCXK（魯）20130009]。行常規(guī)檢查，排除眼部疾患后于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物實驗中心屏障環(huán)境設(shè)施適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，光照交替12 h環(huán)境，自由獲得飲水及飼料。

1.1.2 藥物

白芍、炙甘草由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

1.1.3 試劑與儀器

完全弗氏佐劑（Complete Freund′s Adjuvant，CFA）（sigma公司，美國，貨號：F5881）;光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白（Interphotoreceptor Retinoid-binding Protein，IRBP）（上海生工生物有限公司，批號：P21622）;結(jié)核分枝桿菌H37RA（BD Difco公司，美國，貨號：M4537）;γ干擾素（Interferon，IFN-γ）、白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）-10 ELISA Kit（eBioscience公司，美國，貨號：BMS621、BMS629）;蘇木精-伊紅（HE，天津市北連精細(xì)化學(xué)有限公司，批號：20160801）。

光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本，型號：BX51-DP20）;冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國，型號：5424R）;Multiskan GO酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司，美國，型號：1510）。

1.2 方法

1.2.1 芍藥甘草湯所含主要化學(xué)成分的收集與篩選

本研究使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmspsearch.php）[6]，中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具庫（Bioinformatics Analysis Tool of Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsd.org/batman-tcm）[7]，以“白芍”“炙甘草”為關(guān)鍵詞檢索2味中藥的主要化學(xué)成分。其中，TCMSP數(shù)據(jù)庫選擇化合物的篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18，BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫設(shè)置相似性模型閾值Score cutoff≥20，P≤0.05[8]。另外，結(jié)合芍藥甘草湯相關(guān)化學(xué)成分的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，以主要化學(xué)成分具有生物活性和藥理作用為標(biāo)準(zhǔn)，補(bǔ)充上述數(shù)據(jù)庫的不足。最后，使用有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[9]對主要化學(xué)成分進(jìn)行查詢，獲取化合物SMILES等信息，建立“中藥-化學(xué)成分”數(shù)據(jù)集。

1.2.2 化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)的收集與篩選

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫收集芍藥甘草湯候選化學(xué)成分的同時，記錄數(shù)據(jù)庫收錄的潛在靶點(diǎn)。另外使用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch）[10]檢索，以配體預(yù)測方法預(yù)測相關(guān)化合物的潛在靶點(diǎn)。對所收集靶點(diǎn)使用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）[11]剔除非人源靶點(diǎn)，并校正所有蛋白名稱為官方名稱，建立“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)集，使用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

1.2.3 葡萄膜炎的疾病靶點(diǎn)收集與篩選

本研究使用治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd）[12]、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca）[13]、DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/home/）[14]、比較毒物遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http：//ctdbase.org）[15]、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）[16]、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http：//www.omim.org）[17]、GAD數(shù)據(jù)庫（https：//geneticassociationdb.nih.gov）[18]，以“uveitis”為關(guān)鍵詞檢索，收集相關(guān)的靶點(diǎn)基因，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫校正，去除重復(fù)項，建立“疾病-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)集。

1.2.4 “中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”和“疾病-靶點(diǎn)”交集網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將所得“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)集與“疾病-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)集進(jìn)行韋恩分析，建立“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”數(shù)據(jù)集，構(gòu)建數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)，初步挖掘芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的作用靶點(diǎn)。

將“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”數(shù)據(jù)集中靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）[19]，限定物種為“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape 3.7.2軟件插件CytoNCA[20]對所得PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，分析?nèi)容包括中心性（Degree Centrality，DC）、介度中心性（Betweenness Centrality，BC）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality，EC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC），并計算相應(yīng)的中位數(shù)值。關(guān)鍵靶點(diǎn)為DC值大于2倍DC中位數(shù)值，且BC、EC、CC指標(biāo)大于所有節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)。

1.2.5 富集分析

采用Cytoscape 3.7.2軟件插件ClueGO[21]進(jìn)行芍藥甘草湯活性成分治療葡萄膜炎關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能注釋富集分析。富集分析內(nèi)容包括生物過程和信號通路，分析芍藥甘草湯治療葡萄膜炎可能的作用機(jī)制。計算富集結(jié)果的每個P值，以P<0.05為篩選條件，P<0.01被認(rèn)為是顯著富集，獲得顯著富集的生物學(xué)過程和信號通路。

1.2.6 溶液制備

稱取白芍400 g、炙甘草400 g，浸泡30 min，煎煮2次，一煎加5.5倍量的水，二煎加4倍量水，過濾，合并水煎液，減壓濃縮得到芍藥甘草湯水提液800 mL，濃度為1 g/mL（按生藥量計算），備用。大鼠臨床等效劑量為1.2 g/100 g，則芍藥甘草湯水提液按1.2 mL/100 g灌胃給藥，1次/d，連續(xù)14 d。

1.2.7 實驗分組與造模

30只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、芍藥甘草湯組，每組10只。實驗采用大鼠皮下注射IRBP的方法建立EAU動物模型。于超凈臺內(nèi)配制含IRBP的磷酸鹽緩沖液（Phosphate-buffered Saline，PBS）0.6 mL，與結(jié)核分枝桿菌H37RA粉劑10 mg，PBS 1.4 mL，CFA 2 mL，充分混合，得乳劑4 mL。分別自大鼠足墊中部皮下進(jìn)針，向上潛行至腔骨上端皮下處，每側(cè)緩慢推注混合乳劑0.1 mL。

1.2.8 HE檢測大鼠視網(wǎng)膜病理變化

灌胃2周后10%水合氯醛腹腔注射麻醉，處死動物摘取眼球后，置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜。石蠟包埋，經(jīng)瞳孔視乳頭軸作矢狀切面切片（4 μm）。對組織切片進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變及炎癥細(xì)胞浸潤情況，依據(jù)Caspi眼部組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)評級[22]。

1.2.9 ELISA檢測大鼠血清IFN-γ及IL-10的含量

大鼠灌胃2周后收集心臟血，4 ℃離心（3 000×g，15 min）后取上清，采用ELISA測定血清中IFN-γ、IL-10含量。依據(jù)說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀在450 nm下測定吸光度，計算各組大鼠血清中IFN-γ、IL-10的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)一用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥甘草湯的“中藥-化學(xué)成分”數(shù)據(jù)集

對白芍與炙甘草進(jìn)行化學(xué)成分檢索后篩選，刪除重復(fù)項，記錄SMILES信息[Paeoniflorin_qt（芍藥苷元）在PubChem中未檢索到]，共得到化合物44個，包括白芍35個和炙甘草9個。而文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示，甘草中甘草苷、甘草素與甘草查爾酮A在炮制后含量明顯升高，且具有明顯的抗炎、抗腫瘤等活性[23]。見表1。

2.2 芍藥甘草湯的“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫與Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲得芍藥甘草湯候選化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫校正，獲得白芍候選成分治療靶點(diǎn)600個，炙甘草323個，刪除重復(fù)項后獲得芍藥甘草湯候選成分潛在靶點(diǎn)712個?！爸兴?化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)由761個節(jié)點(diǎn)和1 975個邊組成。見圖1。641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

2.3 葡萄膜炎的“疾病-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)集

使用TTD數(shù)據(jù)庫、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、CTD數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、GAD數(shù)據(jù)庫，分別收集葡萄膜炎相關(guān)靶點(diǎn)基因2、160、10、25、994、12、18個，校正刪除重復(fù)項后獲得靶點(diǎn)995個。

2.4 “中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”數(shù)據(jù)集與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)集與“疾病-靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)集中靶點(diǎn)進(jìn)行韋恩分析，建立“中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病”數(shù)據(jù)集，構(gòu)建數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)。見圖2。獲得芍藥甘草湯27個候選治療葡萄膜炎的潛在靶點(diǎn)基因164個，該網(wǎng)絡(luò)由193個節(jié)點(diǎn)和468個邊組成。見圖2。

將芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的潛在靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)由163個點(diǎn)，2 164個邊組成。使用CytoNCA對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯嬎憔W(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)DC中位數(shù)為20、BC中位數(shù)為51.619 110、EC中位數(shù)為0.045 793、CC中位數(shù)為0.490 909。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選方法，選擇DC>40并綜合BC>51.619 110、EC>0.045 793、CC>0.490 909的節(jié)點(diǎn)，得到33個關(guān)鍵靶點(diǎn)，同時獲得芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI圖。見表2，圖3。

2.5 富集分析

GO富集分析結(jié)果涉及95個生物過程（P<0.05），主要包括細(xì)胞對活性氧的反應(yīng)、多種細(xì)胞的增殖與分化、一氧化氮與神經(jīng)遞質(zhì)等分子的代謝調(diào)節(jié)、IL-6的細(xì)胞反應(yīng)等（P<0.01）。見圖4（前20位）。KEGG信號通路富集分析的結(jié)果涉及117個信號通路（P<0.05），主要包括TNF信號途徑、IL-17信號通路、Th17細(xì)胞的分化、T細(xì)胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路等（P<0.01），同時，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、乙型肝炎、前列腺癌、弓形蟲病等也被顯著富集。見圖5（前20位）。

2.6 芍藥甘草湯對EAU大鼠視網(wǎng)膜病理的影響

HE染色結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列明顯紊亂、迂曲，內(nèi)、外核層細(xì)胞大小較一致，部分細(xì)胞空泡變性;叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層及內(nèi)核狀層、外核層出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤。經(jīng)芍藥甘草湯治療后，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為輕度迂曲;神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層及內(nèi)核狀層出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖6。相應(yīng)炎癥評分顯示，模型組大鼠炎癥評分高于對照組，而芍藥甘草湯治療后炎癥評分顯著下降（P<0.01）。見表3。

2.7 芍藥甘草湯對EAU大鼠血清IFN-γ、IL-10的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IFN-γ、IL-10的含量升高（P<0.01），與已報道EAU動物模型的表達(dá)趨勢一致[24]。經(jīng)芍藥甘草湯治療后，大鼠血清中炎癥介質(zhì)IFN-γ含量顯著下降（P<0.01），抗炎因子IL-10含量進(jìn)一步升高（P<0.01）。見圖7。

3 討論

目前，我國治療葡萄膜炎的藥物主要是散瞳劑和睫狀肌麻痹劑、糖皮質(zhì)激素、非甾體抗炎藥和免疫抑制劑等[25]。但臨床應(yīng)用時存在有藥物不良反應(yīng)、患者依從性較差等局限性，不同程度上影響疾病的治療。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)討論芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的理論機(jī)制。結(jié)果顯示，芍藥甘草湯中47種候選成分，包括芍藥35種和炙甘草12種，涉及治療葡萄膜炎的作用靶點(diǎn)164個，經(jīng)拓?fù)浞治龊螳@得關(guān)鍵靶點(diǎn)33個。富集分析研究結(jié)果表明，芍藥甘草湯治療葡萄膜炎可能與細(xì)胞對活性氧的反應(yīng)、多種細(xì)胞的增殖與分化、一氧化氮與神經(jīng)遞質(zhì)等分子的代謝調(diào)節(jié)、IL-6的細(xì)胞反應(yīng)等生物過程有關(guān)，涉及到IL-17信號通路、TNF信號途徑、Th17細(xì)胞的分化、T細(xì)胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、PI3K-AKT信號通路等。KEGG結(jié)果表明，芍藥甘草湯治療葡萄膜炎可能與IL-17信號通路、Th17細(xì)胞的分化有關(guān)。研究顯示，葡萄膜炎患者活動期Th17細(xì)胞比例及相關(guān)細(xì)胞因子水平升高，而Treg細(xì)胞出現(xiàn)相應(yīng)水平下降[26]。本課題組前期已通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，在實驗性免疫性葡萄膜炎大鼠模型中，芍藥甘草湯能夠下調(diào)IL-17表達(dá)而減大鼠眼部炎性病變[4]，這證實了本研究預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本研究還預(yù)測芍藥甘草湯治療葡萄膜炎可通過影響T細(xì)胞信號受體通路實現(xiàn)。研究表明，初始CD4+T細(xì)胞在T細(xì)胞受體介導(dǎo)下活化，可分化為Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞而參與不同類型的免疫應(yīng)答。葡萄膜炎被認(rèn)為是由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，主要侵犯視網(wǎng)膜和葡萄膜[27]。在EAU模型中，引起趨化單核細(xì)胞聚集至眼的IFN-γ增加[28]，IFN-γ是一種炎癥介質(zhì);而抗炎因子IL-10可通過抑制T細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的活化等對抗EAU[29-30]。本研究通過復(fù)制EAU大鼠模型，使用芍藥甘草湯治療后發(fā)現(xiàn)，EAU大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)明顯下降，可能與IFN-γ的減少和IL-10的增加有關(guān)，實驗結(jié)果進(jìn)一步證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的準(zhǔn)確性。此外，Mizuki等[31]通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，EAU的發(fā)病期外周血液中TNF-α水平急劇上升，在緩解期外周血液中TNF-α水平有所下降。給實驗動物皮下注射TNF-α后，可使EAU的發(fā)病率與相關(guān)病情顯著增加[32]。而本研究結(jié)果預(yù)測，芍藥甘草湯可能通過干預(yù)TNF信號途徑治療葡萄膜炎，這可成為未來進(jìn)一步的實驗研究方向的基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測了芍藥甘草湯治療葡萄膜炎的主要機(jī)制，涉及多種有效成分、靶點(diǎn)和通路，并在課題組已有的臨床與實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測芍藥甘草湯對EAU的IFN-γ、IL-10的影響。為研究芍藥甘草湯活性成分的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制提供思路和依據(jù)，也為該方的臨床應(yīng)用與藥物開發(fā)提供參考。641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

參考文獻(xiàn)

[1]畢宏生，解孝鋒，吳建峰.中醫(yī)藥綜合治療葡萄膜炎臨床評價分析[J].國際眼科雜志，2009，9（4）：749-751.

[2]楊培增.臨床葡萄膜炎[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：68.

[3]趙堪興.眼科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2018：163-169.

[4]呂璐，寧云紅，郭承偉.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)理念指導(dǎo)下的芍藥甘草湯對實驗性免疫性葡萄膜炎模型大鼠作用機(jī)制研究[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，42（3）：255-258.

[5]寧云紅，郭承偉，呂璐.芍藥甘草湯治療葡萄膜炎[J].中醫(yī)學(xué)報，2019，34（2）：384-387.

[6]Ru J，Li P，Wang J，et al.TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].J Cheminform，2014，6：13.

[7]Liu Z，Du J，Yan X，et al.TCMAnalyzer：A Chemo-and Bioinformatics Web Service for Analyzing Traditional Chinese Medicine[J].J Chem Inf Model，2018，58（3）：550-555.

[8]世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南[J].世界中醫(yī)藥，2021，16（4）：527-532.

[9]Wang Y，Xiao J，Suzek TO，et al.PubChem：a public information system for analyzing bioactivities of small molecules[J].Nucleic Acids Res，2009，37（Web Server issue）：W623-633.

[10]Daina A，Michielin O，Zoete V.SwissTargetPrediction：updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules[J].Nucleic Acids Res，2019，47（W1）：W357-W364.

[11]Ke H，Liu Y，Zhou X，et al.Anterior fissureless uniport vs.posterior intra-fissure triple-port thoracoscopic right upper lobectomy：a propensity-matched study[J].J Thorac Dis，2017，9（10）：3866-3874.

[12]Wang Y，Zhang S，Li F，et al.Therapeutic target database 2020：enriched resource for facilitating research and early development of targeted therapeutics[J].Nucleic Acids Res，2020，48（D1）：D1031-D1041.

[13]Wishart DS，F(xiàn)eunang YD，Guo AC，et al.DrugBank 5.0：a major update to the DrugBank database for 2018[J].Nucleic Acids Res，2018，46（D1）：D1074-D1082.

[14]Piero J，Ramírez-Anguita JM，Saüch-Pitarch J，et al.The DisGeNET knowledge platform for disease genomics：2019 update[J].Nucleic Acids Res，2020，48（D1）：D845-D855.

[15]Davis AP，Grondin CJ，Johnson RJ，et al.The Comparative Toxicogenomics Database：update 2019[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D948-D954.

[16]Rappaport N，F(xiàn)ishilevich S，Nudel R，et al.Rational confederation of genes and diseases：NGS interpretation via GeneCards，MalaCards and VarElect[J].Biomed Eng Online，2017，16（Suppl 1）：72.

[17]Amberger JS，Bocchini CA，Scott AF，et al.OMIM.org：leveraging knowledge across phenotype-gene relationships[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D1038-D1043.

[18]Becker KG，Barnes KC，Bright TJ，et al.The genetic association database[J].Nat Genet，2004，36（5）：431-432.

[19]Jensen LJ，Kuhn M，Stark M，et al.STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms[J].Nucleic Acids Res，2009，37（Database issue）：D412-416.641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0

[20]Mallik MK.An attempt to understand glioma stem cell biology through centrality analysis of a protein interaction network[J].J Theor Biol，2018，438：78-91.

[21]Mlecnik B，Galon J，Bindea G.Comprehensive functional analysis of large lists of genes and proteins[J].J Proteomics，2018，171：2-10.

[22]Caspi RR.Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse[J].Curr Protoc Immunol，2003，Chapter 15：Unit 15.6.

[23]張燕麗，孟凡佳，田園，等.炙甘草的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].化學(xué)工程師，2019，33（8）：60-63，66.

[24]Tian QM，Bi HS，Cui Y，et al.Influence of Yanyankang Powder on Th1/Th2 in rats with experimental autoimmune uveitis[J].Chin J Integr Med，2016，22（3）：214-218.

[25]劉雪霞.葡萄膜炎的病因及治療進(jìn)展[J].中華眼科醫(yī)學(xué)雜志（連續(xù)型電子期刊），2014，4（1）：39-42.

[26]張蓮.自身免疫性葡萄膜炎發(fā)病過程中Th17/Treg細(xì)胞及其相關(guān)炎性因子的動態(tài)表達(dá)研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[27]Corcione A，Benvenuto F，F(xiàn)erretti E，et al.Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions[J].Blood，2006，107（1）：367-372.

[28]Liblau RS，Singer SM，McDevitt HO.Thl and Th2 CD4+T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases[J].Immunol Today，1995，16（1）：34-38.

[29]Gonzalez-Rey E，Gonzalez MA，Varela N，et al.Human adipose-derived mesenchymal stem cells reduce inflammatory and T cell responses and induce regulatory T cells in vitro in rheumatoid arthritis[J].Ann RheumDis，2010，69（1）：241-248.

[30]Su SB，Grajewski RS，Luger D，et al.Altered chemokine profile associated with exacerbated autoimmune pathology under conditions of genetic interferon-gamma deficiency[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48（10）：4616-4625.

[31]Mizuki N，Meguro A，Tohnai I，et al.Association of Major Histocompatibility Complex Class I Chain-Related Gene A and HLA-B Alleles with Behcet′s Disease in Turkey[J].Jpn J Ophthalmol，2007，51（6）：431-436.

[32]羅毅.腫瘤壞死因子與葡萄膜炎發(fā)病相關(guān)性的探討[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（17）：211-213.

（2021-03-24收稿 本文編輯：張樂杰）

基金項目：山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目（2019-0086）作者簡介：鄒陶媛（1995.11—），女，碩士研究生在讀，研究方向：眼底病與炎癥性眼病的研究，E-mail：940032160@qq.com通信作者：郭承偉（1964.11—），男，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：眼底病的理論與臨床研究，E-mail：guocw12009@163.com641289AB-9C86-4E67-A787-82E4208CA8E0