劉建洪，黃 宇，劉貴喜，胡 旭，李 響

膀胱癌是泌尿系常見(jiàn)惡性腫瘤，具有較高的進(jìn)展、復(fù)發(fā)率。血管新生在膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。血小板因子4(PF4)對(duì)血管生成具有抑制作用[2]。腫瘤細(xì)胞需更多的水分子參與快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，以滿足快速增殖的需要[3]。研究顯示，水通道蛋白(AQP)在多種腫瘤組織中高表達(dá)，且AQP抑制劑可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。本研究旨在探討膀胱癌患者PF4水平及AQP1、AQP3表達(dá)與疾病進(jìn)展、預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2016年1月—2018年1月我院92例膀胱癌作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合膀胱癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；入組前未行任何抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴其他部位惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病或嚴(yán)重肝腎功能損害者。另選擇我院同期體檢健康者50例作為對(duì)照組。2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2隨訪 以手術(shù)開始為隨訪起點(diǎn)，按照《中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南》[5]膀胱癌隨訪要求，以腫瘤復(fù)發(fā)和(或)因膀胱癌死亡視為預(yù)后不良。

1.3研究方法 比較2組血清PF4水平及觀察組癌、癌旁組織AQP1、AQP3表達(dá)情況；分析觀察組臨床病理特征與血清PF4及癌組織AQP1、AQP3的關(guān)系；采用Pearson相關(guān)性分析探討血清PF4水平與癌組織AQP1、AQP3表達(dá)量的相關(guān)性；比較預(yù)后不佳與預(yù)后良好患者血清PF4水平與癌組織AQP1、AQP3表達(dá)量；采用受試者工作特征(ROC)曲線分析血清PF4及癌組織AQP1、AQP3表達(dá)對(duì)膀胱癌不良預(yù)后的預(yù)測(cè)效能。

1.4檢測(cè)方法

1.4.1血清PF4檢測(cè)：采集2組靜脈血，3000 r/min離心15 min分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清PF4水平。

1.4.2AQP1、AQP3檢測(cè)：手術(shù)獲取癌及癌旁組織用多聚甲醛浸泡固定，石蠟包埋，獲取5 μm厚連續(xù)切片；石蠟切片脫蠟脫水，PBS液沖洗3次，每次5 min；3%過(guò)氧化氫滴加于玻片上，室溫放置10 min；PBS液沖洗3次，每次5 min；加枸櫞酸鹽緩沖液10 min(95 ℃)，室溫冷卻30 min，PBS液沖洗3次，每次5 min；滴加封閉液，室溫放置20 min后用濾紙吸除多余液體；滴加一抗AQP抗體50 μl，4 ℃放置過(guò)夜；37 ℃復(fù)溫45 min；PBS液沖洗3次，每次5 min，滴加生物素標(biāo)記的兔二抗，37 ℃放置60 min；PBS液沖洗3次，每次5 min，滴加新配制DAB，避光顯色10 min，10%蘇木精復(fù)染2 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。低倍鏡下找陽(yáng)性細(xì)胞密集區(qū)，圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)AQP1、AQP3陽(yáng)性面積及強(qiáng)度灰度值，用陽(yáng)性指數(shù)表示AQP1、AQP3陽(yáng)性表達(dá)量，陽(yáng)性指數(shù)=陽(yáng)性面積/所測(cè)組織面積×陽(yáng)性強(qiáng)度灰度值。

2 結(jié)果

2.12組血清PF4比較 觀察組血清PF4水平為(0.58±0.19)ng/ml，對(duì)照組為(0.22±0.07)ng/ml，觀察組高于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2觀察組癌及癌旁組織AQP1、AQP3表達(dá)比較 觀察組癌組織AQP1、AQP3表達(dá)均高于癌旁組織(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.3不同臨床病理特征膀胱癌患者血清PF4及癌組織AQP1、AQP3表達(dá) TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤最大徑>2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清PF4水平與癌組織AQP1、AQP3表達(dá)分別高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤最大徑≤2 cm、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表1 膀胱癌患者癌及癌旁組織AQP1、AQP3表達(dá)情況比較

表2 不同臨床病理特征膀胱癌患者血清PF4及癌組織AQP1、AQP3表達(dá)情況

2.4膀胱癌患者血清PF4與癌組織AQP1、AQP3相關(guān)性分析 膀胱癌患者血清PF4水平與癌組織AQP1、AQP3表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.721、0.709，P<0.01)。

2.5不同預(yù)后膀胱癌患者血清PF4及癌組織AQP1、AQP3表達(dá)比較 預(yù)后不良患者血清PF4水平與癌組織AQP1、AQP3表達(dá)量均高于預(yù)后良好患者(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)后膀胱癌患者血清PF4及癌組織AQP1、AQP3表達(dá)比較

2.6血清PF4及癌組織AQP1、AQP3表達(dá)對(duì)膀胱癌不良預(yù)后的預(yù)測(cè)效能分析 血清PF4水平與癌組織AQP1、AQP3表達(dá)單獨(dú)及聯(lián)合預(yù)測(cè)膀胱癌不良預(yù)后的最佳截?cái)嘀捣謩e為0.620 ng/ml、190.395、182.555、18.353，敏感度/特異度分別為0.885/0.833、0.654/0.864、0.962/0.742、0.923/0.955，曲線下面積分別為0.924、0.822、0.948、0.975。

3 討論

血管新生是膀胱癌發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[6]。PF4為內(nèi)源性血管抑制因子，可通過(guò)多種途徑抑制腫瘤血管生成。既往報(bào)道證實(shí)，肝癌患者血清PF4顯著升高，且隨臨床分期的升高而升高，可將其作為肝癌診斷、分期的依據(jù)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組血清PF4水平高于對(duì)照組，且TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤最大徑>2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清PF4水平分別高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤最大徑≤2 cm、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，證實(shí)PF4與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

機(jī)體諸多活動(dòng)存在水分子跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。AQP介導(dǎo)的被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是水進(jìn)出細(xì)胞重要途徑[8]。細(xì)胞內(nèi)水經(jīng)水通道外溢是細(xì)胞凋亡的開始，推測(cè)AQP表達(dá)可通過(guò)影響水分子運(yùn)輸而影響細(xì)胞周期[9]。本研究顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤最大徑>2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織AQP1、AQP3表達(dá)分別高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤最大徑≤2 cm、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示AQP1、AQP3與膀胱癌的發(fā)生及臨床病理特征密切相關(guān)。另外還發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者血清PF4水平與癌組織AQP1、AQP3表達(dá)呈正相關(guān)，提示PF4與AQP1、AQP3共同參與膀胱癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移。

有研究表明，膀胱癌具有較高的組織間隙液壓，新生血管對(duì)許多高分子物質(zhì)具有高通透性，這在惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用[10]。本研究證實(shí)血清PF4水平及癌組織AQP1、AQP3表達(dá)與膀胱癌患者上述臨床病理特征密切相關(guān)，故推測(cè)三者與患者預(yù)后有關(guān)。本研究顯示，預(yù)后不良患者血清PF4水平與癌組織AQP1、AQP3表達(dá)均高于預(yù)后良好患者，ROC曲線顯示，血清PF4水平與癌組織AQP1、AQP3表達(dá)聯(lián)合預(yù)測(cè)膀胱癌不良預(yù)后的敏感度、特異度分別為0.923、0.955，曲線下面積為0.975，提示聯(lián)合檢測(cè)對(duì)膀胱癌不良預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上，膀胱癌患者血清PF4水平及癌組織AQP1、AQP3表達(dá)與臨床病理特征密切相關(guān)，可將三者聯(lián)合檢測(cè)作為預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。