王軍乾，趙 凌，潘陽陽，王 萌，龍亞麗，高澤川，馬文斌，鐘董蘭，余四九，王立斌*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730070)

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高寒低氧環(huán)境下的一種特有畜種，也是當(dāng)?shù)啬撩裰匾纳钯Y料和經(jīng)濟(jì)來源[1]。其生活環(huán)境十分惡劣，生產(chǎn)性能差，性成熟期晚，繁殖率很低。因此，研究牦牛生殖生理活動(dòng)對(duì)提高牦牛繁殖率和增加牧民經(jīng)濟(jì)收入非常重要。

促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)和促黃體素(luteinizing hormone,LH)在卵巢的生長(zhǎng)發(fā)育和成熟排卵過程中發(fā)揮著重要的作用。發(fā)情前，F(xiàn)SH分泌逐漸增多，在促進(jìn)卵巢增重和卵泡生長(zhǎng)發(fā)育中起主導(dǎo)作用[2]；發(fā)情期，LH水平不斷升高，臨近排卵時(shí)達(dá)到最高水平，并促進(jìn)卵泡成熟和排卵，繼而形成黃體；排卵后，F(xiàn)SH和LH又降至較低水平[3]。因此，提高FSH和LH濃度對(duì)促進(jìn)卵泡的發(fā)育和提高動(dòng)物的繁殖力發(fā)揮著重要作用。然而，在生理狀態(tài)下，抑制素(inhibine,INH)通常抑制垂體FSH和LH的合成和分泌，并對(duì)抗FSH和LH的生理作用，對(duì)動(dòng)物的繁殖活動(dòng)起到明顯的抑制作用[4]。激素通過和靶細(xì)胞中相應(yīng)的受體結(jié)合而發(fā)揮其生理作用，F(xiàn)SH和LH對(duì)卵巢的調(diào)節(jié)作用就是通過與卵巢皮質(zhì)和卵泡中存在FSHR和LHR結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的[5]，而INH與INHβB的結(jié)合來抑制垂體細(xì)胞分泌FSH，進(jìn)而抑制卵泡的發(fā)育和成熟[6]。

牦牛卵巢在生長(zhǎng)發(fā)育過程中血清INH、FSH和LH濃度的變化模式及其相互作用未見相關(guān)報(bào)道，研究INH的分泌和作用特點(diǎn)，掌握這3種激素在卵巢發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)作用對(duì)提高牦牛的繁殖率具有一定的價(jià)值。本試驗(yàn)通過檢測(cè)INHβB、FSHR和LHR在牦牛發(fā)情期、間情期、妊娠期卵巢中的表達(dá)和定位，研究抑制素(INH)、FSH和LH在牦牛不同生理時(shí)期對(duì)卵巢的生理作用，在提高牦牛繁殖率及促進(jìn)牦牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 INH Beta B抗體(bs-1825R)、FSHR抗體(bs-20658R)、LHR抗體(bs-6431R)、Goat Anti-Rabbit IgG和免疫組化染色試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；β-actin Rabbit Ab，Cell Signaling公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒，北京Omega公司產(chǎn)品；GoscriptTMReverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Promega公司產(chǎn)品；DAB顯色液，美國Invitro-gen Zymed公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 PCR儀，Biorad公司產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，Roche生物科技公司產(chǎn)品；顯微照相系統(tǒng)(DP71)，日本Olympus公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光儀，上海Roche生物公司產(chǎn)品。

1.1.3 樣品處理 樣品取自青海省西寧市某屠宰場(chǎng)，4歲～8歲雌性牦牛，體況良好，無明顯臨床疾病。動(dòng)物禁食8 h～10 h 后，頸動(dòng)脈放血屠宰，30 min內(nèi)分別采集處于發(fā)情期(有明顯的發(fā)情癥狀)、間情期(排卵后有周期黃體生成)和妊娠期(妊娠2月～3月)的卵巢組織，樣品分別保存于液氮中用于提取RNA與蛋白質(zhì),以及固定于40 mg/mL的多聚甲醛溶液中用于免疫組化檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)四對(duì)引物(表1)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 RNA提取及基因表達(dá)水平檢測(cè) 用TransZol試劑盒提取不同生殖階段卵巢組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后置于-20 ℃保存。PCR反應(yīng)體系如下：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶 10 μL，H2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，72 ℃ 5 min，共40個(gè)循環(huán)。RT-qPCR反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL、cDNA 2 μL、上、下游引物各0.5 μL、H2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，72 ℃ 5 min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，利用2-ΔΔct法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 蛋白質(zhì)提取和Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量 取出卵巢組織，研磨后加入RIPA裂解緩沖液和PMSF冰浴3 h，組織完全裂解后，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心，棄去沉淀。蛋白變性：蛋白原液與4×蛋白上樣緩沖液按 3∶1 混合，100 ℃變性15 min，變性后的蛋白-20 ℃保存。配制50 g/L濃縮膠和100 g/L分離膠，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)；電泳結(jié)束后切膠、轉(zhuǎn)膜，再封閉，孵育一抗(稀釋比例1∶1 000)、二抗(稀釋比例1∶3 000)，后用化學(xué)發(fā)光儀曝光，利用Image J軟件分析INHβB、FSHR和LHR蛋白在卵巢組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 免疫組織化學(xué)技術(shù) 用40 mg/mL多聚甲醛固定的卵巢組織樣品制作石蠟切片。切片進(jìn)行脫蠟，在pH 6.0的檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L)中進(jìn)行抗原修復(fù)，液體加熱沸騰后持續(xù)15 min，再冷卻至常溫；免疫組化試劑盒(抗兔)孵育二抗；以二氨基聯(lián)苯胺染色法用DAB顯色液進(jìn)行顯色，然后蘇木精復(fù)染、酒精脫水、二甲苯透明、樹脂封片，晾干。用IHC方法檢測(cè)相關(guān)受體的分布。

表2 牦牛不同生殖生理階段卵巢組織中INHβB、FSHR和LHR基因表達(dá)量

表3 牦牛不同生殖生理階段卵巢組織中INHβB、FSHR和LHR蛋白灰度分析數(shù)值

2 結(jié)果

2.1 牦牛卵巢組織INHβB、FSHR和LHR mRNA表達(dá)

PCR結(jié)果如圖所示(圖1a～圖1c)，條帶單一，結(jié)果與預(yù)期大小相符。INHβB在妊娠期牦牛卵巢組織中表達(dá)量顯著高于發(fā)情期和間情期(P<0.05)，且發(fā)情期高于間情期(P<0.05)(圖1d)；FSHR基因的表達(dá)量在發(fā)情期顯著地高于間情期和妊娠期(P<0.05)，后兩個(gè)時(shí)期差異不顯著(圖1e)(P>0.05)；而LHR在間情期表達(dá)量最高(P<0.05)，發(fā)情期和妊娠期差異不顯著(圖1f)(P>0.05)。

a、b、c.PCR結(jié)果;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.發(fā)情期卵巢組織；2.間情期卵巢組織；3.妊娠期卵巢組織；d.INHβB基因；e.FSHR基因；f.LHR基因；相同大寫字母之間表示差異不顯著(P>0.05)；不相同大寫字母之間表示差異顯著(P<0.05)

2.2 牦牛卵巢組織INHβB、FSHR和LHR蛋白表達(dá)

INHβB、FSHR和LHR蛋白在牦牛卵巢的表達(dá)存在明顯差異(圖2a)。INHβB蛋白在牦牛妊娠期卵巢組織中表達(dá)量極顯著高于發(fā)情期和間情期(P<0.05)，發(fā)情期和間情期表達(dá)量差異不顯著(圖2b)(P>0.05)；FSHR在發(fā)情期表達(dá)量最高，間情期次之，妊娠期最低(P<0.05)(圖2c)；LHR在間情期的表達(dá)量最高，妊娠期次之(P<0.05)，發(fā)情期最低(P<0.05)(圖2d)。

a.Western blot 結(jié)果；1.發(fā)情期卵巢組織；2.間情期卵巢組織；3.妊娠期卵巢組織；b.INHβB蛋白相對(duì)表達(dá)分析；c.FSHR蛋白相對(duì)表達(dá)分析；d.LHR蛋白相對(duì)表達(dá)分析；相同大寫字母之間表示差異不顯著(P>0.05)；不相同大寫字母之間表示差異顯著(P<0.05)

2.3 INHβB、FSHR和LHR在牦牛卵巢組織中的分布

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，INHβB、FSHR和LHR在牦牛不同生殖階段卵巢均為陽性表達(dá)(圖3A、B、C、D、E、F、G、H、I)。其中，INHβB、FSHR和LHR在發(fā)情期主要分布在卵泡膜、顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞上(圖3A、D、G)，而在間情期和妊娠期主要分布于黃體細(xì)胞(圖3B、C、E、F、H、I)。

CC.卵丘細(xì)胞；SG.顆粒細(xì)胞；TF.卵泡膜；CL.黃體細(xì)胞

3 討論

INH是一種主要由性腺分泌的糖蛋白激素[7]，具有強(qiáng)烈抑制FSH合成和分泌的作用，而對(duì)LH的合成和分泌有輕微的抑制作用[8]。INH在妊娠前期主要由黃體細(xì)胞產(chǎn)生，在妊娠后期INH主要由胎盤產(chǎn)生，產(chǎn)生的INH主要貯存在細(xì)胞漿中，可通過與細(xì)胞表面的INHβB結(jié)合發(fā)揮作用，以旁分泌和自分泌方式參與妊娠期間的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)[9-10]。同時(shí)，INH與顆粒細(xì)胞上的INHβB結(jié)合后作用于垂體促性腺激素分泌細(xì)胞，抑制FSH的合成與釋放，破壞FSHRmRNA的穩(wěn)定性[11-13]，使FSH對(duì)妊娠期卵巢的作用減弱。本研究發(fā)現(xiàn)INHβB在妊娠期牦牛卵巢組織中的表達(dá)量顯著高于間情期和發(fā)情期，而發(fā)情期又略高于間情期的表達(dá)量，說明妊娠期牦牛卵巢INHβB與配體結(jié)合度高，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用強(qiáng)，推測(cè)機(jī)體需要INH維持妊娠過程。

FSH主要由垂體細(xì)胞分泌，能刺激卵巢生長(zhǎng)[14]。下丘腦產(chǎn)生促性腺激素釋放激素作用于垂體，促使垂體釋放促性腺激素，從而使FSH的含量升高，同時(shí)FSHR在卵巢組織中的表達(dá)水平升高[15-17]。FSHR在顆粒細(xì)胞中呈現(xiàn)高水平表達(dá)，它與FSH結(jié)合調(diào)節(jié)卵泡的成熟，顆粒細(xì)胞增殖和雌激素的產(chǎn)生[18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR在發(fā)情期牦牛卵巢組織中表達(dá)量顯著高于間情期和妊娠期，而間情期又略高于妊娠期，說明發(fā)情期牦牛卵巢對(duì)FSH具有功能需求，證實(shí)FSH能促進(jìn)牦牛發(fā)情，并對(duì)卵巢的增重和卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮主要作用。

LH在生理狀態(tài)下與FSH協(xié)同對(duì)卵巢發(fā)揮作用，二者的作用機(jī)制相似。LH對(duì)黃體期卵巢作用顯著，促進(jìn)黃體的形成，LH通過作用于周圍的顆粒細(xì)胞，使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，并導(dǎo)致排卵[19-21]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示LHR在牦牛間情期卵巢組織中的表達(dá)量高于發(fā)情期和妊娠期，而妊娠期又略高于發(fā)情期的表達(dá)量，說明牦牛間情期卵巢對(duì)LH的功能需求，LH對(duì)牦牛卵泡排卵起到重要作用。

在卵巢的皮質(zhì)和卵泡中有INHβB、FSHR和LHR，這3個(gè)受體是由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和相應(yīng)的受體結(jié)合蛋白構(gòu)成的共受體，INH、FSH和LH通過與共受體結(jié)合對(duì)卵巢發(fā)揮調(diào)控作用[22]，受體能特異性結(jié)合相應(yīng)的激素刺激靶細(xì)胞發(fā)揮效應(yīng)，配體主要有傳導(dǎo)信號(hào)的作用，能誘導(dǎo)激素和受體結(jié)合[23-24]。從而發(fā)揮對(duì)牦牛生殖功能的調(diào)控。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，INHβB、FSHR和LHR在牦牛發(fā)情期、間情期、妊娠期卵巢組織中均有表達(dá)，但其表達(dá)量存在明顯的差異，說明這3種激素在卵巢的發(fā)育、卵泡成熟和排卵以及妊娠過程中發(fā)揮不同的作用。研究3個(gè)受體在牦牛卵巢的表達(dá)情況為探索INH、FSH和LH調(diào)控牦牛卵巢活動(dòng)的分子機(jī)制提供了科學(xué)突破點(diǎn)，為了對(duì)本研究結(jié)果做進(jìn)一步驗(yàn)證，可推進(jìn)牦牛卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的驗(yàn)證試驗(yàn)。參考文獻(xiàn):

[1] 王 可,祝超智,趙改名,等.中國牦牛的品種與分布[J].中國畜牧雜志,2019,55(10):168-171.

[2] RONG M,LIU J X,LI Y,et al.Novel functional recombinant human follicle-stimulating hormone acquired from goat milk[J].J Agric Food Chem,2021,69:2793-2804.

[3] CLARKE I J,FINDLAY J K,CUMMINS J T,et al.Effects of ovine follicular fluid on plasma LH and FSH secretion in ovariectomized ewes to indicate the site of action of inhibin[J].Reprod Fert,1986,77:75-85.

[4] XIA Y,WANG Q,HE X D,et al.Cloning and expression analysis of the follicle-stimulating hormone receptor(FSHR)gene in the reproductive axis of female yaks(Bosgrunniens)[J].Domest Anim Endocrinol,2020,70:106383.

[5] UTOMO B,PUTRANTO E D,FADHOLLY A,et al.Profile of follicle-stimulating hormone and polymorphism of follicle-stimulating hormone receptor in Madrasin cattle with ovarian hypofunction[J].Vet World,2020,13:879-883.

[6] GAO Y T,DU Q,LIU L Y,et al.Serum inhibin B for differentiating between congenital hypogonadotropic hypogonadism and constitutional delay of growth and puberty:a systematic review and meta-analysis[J].Endocrine,2021,10:22-28.

[7] 張 超,羅艷梅,張家驊,等.激活素、抑制素及其受體與動(dòng)物生殖作用的研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(2):115-119.

[8] KUMAR T R,WANG Y,LU N,et al.Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility[J].Nat Genet,1997,15(2):1-4.

[9] 陽美霞,張虹亮,張羽芳,等.抑制素免疫對(duì)動(dòng)物卵泡發(fā)育的影響[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2018,37(1):32-34.

[10] GONEY M P,WILCE M C J,WILCE J A,et al.Engineering the ovarian hormones inhibin A and inhibin B to enhance synthesis and activity[J].Endocrinology,2020,161:38-46.

[11] SPOSINI S,PASCALI F D,RICHARDSON R,et al.Pharmacological programming of endosomal signaling activated by small molecule ligands of the follicle stimulating hormone receptor[J].Front Pharmacol,2020,11:62-70.

[12] BRADEN T D,FAMWORTH P G,BURGER H G,et al.Regulation of the synthetic rate of gonadotropin-releasing hormone receptors in rat pituitary cell cultures by inhibin[J].Endocrinology,1990,127(5):87-92.

[13] CANDELARIA J I,RABAGLINO M B,DENICOL A C,et al.Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development[J].Endocrinology,2020,247(2):153-168.

[14] 胡 斐,呂慎金,金 一,等.綿羊FSHR基因生物信息學(xué)分析及其器官表達(dá)規(guī)律研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2019(3):24-27.

[15] CHEN S J,LIU W J,YANG C,et al.Gonadotropin inhibitory hormone downregulates steroid hormone secretion and genes expressions in duck granulosa cells[J].Anim Reprod,2021,18:128-136.

[16] EGBERT J R,ROBINSON J W,ULIASZ T F,et al.Cyclic AMP links luteinizing hormone signaling to dephosphorylation and inactivation of the NPR2 guanylyl cyclase in ovarian follicles[J].Biol Reprod,2021,27:78-84.

[17] YANG J,GONG Z D,SHEN X Y,et al.FSH receptor binding inhibitor depresses carcinogenesis of ovarian cancer via decreasing levels of K-Ras,c-Myc and FSHR[J].Anim Biotechnol,2021,32:84-91.

[18] WANG N,SI C C,XIA N,et al.TRIB3 regulates FSHR expression in human granulosa cells under high levels of free fatty acids[J].Reprod Biol Endocrinol,2021,19:129-139.

[19] JONAS K C,RIVERO M A,ODUWOLE O,et al.The luteinizing hormone receptor knockout mouse as a tool to probe theinvivoactions of gonadotropic hormones/Receptors in females[J].Endocrinology,2021,162:70-77.

[20] WOODRUFF T K,LYON R J,HANSEN S E,et al.Inhibin and activin locally regulate rat ovarian folliculogenesis[J].Endocrinology,1990,127:196-205.

[21] 許丹寧,田允波,黃運(yùn)茂,等.卵泡大小和顆粒細(xì)胞對(duì)山羊卵泡卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,31(7):1066-1069.

[22] STEWART J L,STELLA S,CUNHA L,et al.Administration of nerve growth factor-β to heifers with a pre-ovulatory follicle enhanced luteal formation and function and promoted LH release[J].Theriogenology,2020,148:37-47.

[23] 楊燦鋒,楊利國.抑制素受體的研究進(jìn)展[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2011,19(6):3-4.

[24] CHEN H,CUI Y,YU S,et al.Expression and localisation of FSHR,GHR and LHR in different tissues and reproductive organs of female yaks[J].Folia Morphol(Warsz),2018,77:301-309.