甘藍(lán)黑腐病致病菌分離與種質(zhì)資源抗性鑒定

許園園 邢苗苗 嚴(yán)繼勇 宋立曉 盧昱宇 曾愛松

摘要：黑腐病是影響甘藍(lán)生產(chǎn)的主要病害之一，為了更好地研究該致病菌的致病機(jī)制，本研究在全國各地發(fā)病田間采集具有典型癥狀的病害樣本，對(duì)病原菌進(jìn)行分離、純化，并對(duì)其形態(tài)特征、理化特性和致病性進(jìn)行分析，同時(shí)測(cè)定了來源不同的該菌株基因序列，分析其同源性并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹;以Xcc8004為接種菌，采用噴霧法對(duì)11份甘藍(lán)種質(zhì)資源進(jìn)行黑腐病苗期人工接種抗性鑒定。結(jié)果表明：不同來源的黑腐病菌DNA序列存在堿基差異，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示相近地區(qū)黑腐病菌聚為一類，親緣關(guān)系較近;致病力測(cè)試初步表明長江中下游地區(qū)收集到的黑腐病菌致病力較強(qiáng);供試材料均未表現(xiàn)免疫和高抗反應(yīng)，不同材料的抗病性有明顯差異，其中篩選到抗病材料3份，耐病材料3份，感病材料3份，高感材料2份。建立一套有效的黑腐病生理小種劃分鑒定方法并篩選高抗黑腐病材料是今后黑腐病抗病育種的重要工作。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán);黑腐病;致病菌;系統(tǒng)進(jìn)化;抗性鑒定;病菌分離鑒定

中圖分類號(hào)：S436.35 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）10-0098-06

結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea L. var. capitata）簡稱甘藍(lán)，為十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種，在世界各地廣泛栽培，我國每年種植面積約90萬hm2，占世界甘藍(lán)類蔬菜收獲面積的1/3以上，在蔬菜周年供應(yīng)和出口創(chuàng)匯中發(fā)揮重要作用[1-2]。

甘藍(lán)黑腐病是威脅甘藍(lán)生產(chǎn)的主要病害，是由野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（Xanthomonas campestris pv. campestris）引起的一種毀滅性細(xì)菌病害[3]，該菌主要通過水孔、氣孔、傷口以及根部等多種方式侵染寄主植物，病原菌侵入植株后快速進(jìn)入維管束，在寄主細(xì)胞壁迅速增殖，合成大量的多糖、黃原膠堵塞木質(zhì)部導(dǎo)管，限制了導(dǎo)管中的水分流動(dòng)，導(dǎo)致“V”字形病斑，隨后，子葉感病時(shí)脫綠萎蔫，而后迅速枯死，真葉感病則出現(xiàn)小黑點(diǎn)，沿維管束蔓延、擴(kuò)展，病斑不斷擴(kuò)大，葉脈逐漸變黑，葉肉組織最終枯黃或者壞死，在葉子中沿著葉脈形成“V”形病斑。受近年來栽培面積的逐漸增加及高密度、連作等不合理栽培方式的影響，甘藍(lán)黑腐病的發(fā)生已蔓延至我國各地，嚴(yán)重時(shí)可使甘藍(lán)減產(chǎn)70%，對(duì)甘藍(lán)及其他十字花科蔬菜的品質(zhì)和產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p失[4-5]。

黑腐病病原菌鑒別研究仍處于相對(duì)落后狀態(tài)，目前尚未發(fā)現(xiàn)覆蓋全部生理小種的黑腐病病原菌收集、鑒別研究體系，也沒有統(tǒng)一的接種方法，尤其是缺乏利用分子生物學(xué)快速鑒定的技術(shù)，對(duì)生理小種分化演變以及遺傳規(guī)律尚不完全清楚。黑腐病抗性遺傳較為復(fù)雜，不同抗源材料可能存在不同抗性遺傳機(jī)制[6]。

目前，黑腐病防治措施主要為輪作換茬、加強(qiáng)生產(chǎn)管理及噴藥防護(hù);但農(nóng)業(yè)防治效果有限，化學(xué)防治又容易產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染問題，使用抗病品種是最為經(jīng)濟(jì)有效的方法，優(yōu)異抗黑腐病種質(zhì)是發(fā)掘抗性基因的材料基礎(chǔ)，由于免疫和高抗黑腐病甘藍(lán)資源匱乏，使得抗黑腐病育種一直未取得有效突破[7]。因此，擴(kuò)大篩選范圍，快速、準(zhǔn)確尋找高抗種質(zhì)資源極為迫切。前人在甘藍(lán)黑腐病抗源篩選研究中做了大量工作，但截至目前僅有極少數(shù)抗源被鑒定[8-9]，導(dǎo)致生產(chǎn)中嚴(yán)重缺乏商品性優(yōu)良的抗黑腐病甘藍(lán)品種，因此，抗黑腐病甘藍(lán)品種培育與改良是目前甘藍(lán)生產(chǎn)上亟待解決的迫切問題。本研究基于收集到的危害甘藍(lán)生產(chǎn)的具有典型癥狀的病害樣本，對(duì)各病原菌進(jìn)行分離、純化，并對(duì)其形態(tài)特征、理化特性和致病性進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)來源不同的菌株基因進(jìn)行測(cè)序與序列比對(duì)，分析其同源性并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析;以Xcc8004為接種菌，采用噴霧法對(duì)11份國內(nèi)外甘藍(lán)種質(zhì)資源進(jìn)行黑腐病苗期人工接種抗性鑒定，研究結(jié)果旨在為該致病菌的準(zhǔn)確、快速、有效鑒定，高抗品種選育以及抗性遺傳規(guī)律解析和抗性基因挖掘提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黑腐病菌菌株見表1，保存于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar medium，NAM），配方：蛋白胨 10 g/L、牛肉粉3 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂15 g/L，pH值7.3。

參試11份甘藍(lán)材料均由筆者所在研究所甘藍(lán)課題組提供，其中包含6份課題組保存的高代自交系材料和5份雜種F1代，京豐和慶豐作為抗感對(duì)照。Xcc8004為標(biāo)準(zhǔn)菌株，由西南大學(xué)友情提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離純化 收集病樣時(shí)選擇典型的黑腐病發(fā)病初期葉片，病葉干凈無蟲食，病樣采集后于取樣袋中帶回，4 ℃存放，24 h內(nèi)進(jìn)行分離、純化，純化后的菌株保存于肉湯培養(yǎng)基中，-80 ℃保存，每次使用在肉湯培養(yǎng)基上劃線以恢復(fù)細(xì)菌活性，然后回接于甘藍(lán)葉片上使其恢復(fù)致病能力，重新分離純化后用于接種試驗(yàn)。

1.2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 對(duì)分離的單菌落，稀釋后涂布于肉湯固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)72 h，對(duì)長出的菌落進(jìn)行形態(tài)、色澤等方面的觀察。

1.2.3 病原菌的回接鑒定 根據(jù)科赫法則，為進(jìn)一步確定所得的病原菌為甘藍(lán)黑腐病的致病菌，將病原菌稀釋成1×108 CFU/mL的懸浮液，噴霧法回接到甘藍(lán)感病品系上，以接種無菌水的甘藍(lán)為對(duì)照，接種后24 h保持90%以上的相對(duì)濕度，14 d后觀察發(fā)病情況。

1.2.4 病原菌的分子鑒定 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法分別提取病原菌的基因組DNA，根據(jù)GenBank提供的植物病原菌序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)各目的片段進(jìn)行回收，Pmd18-T載體連接，感受態(tài)細(xì)胞制備，目的片段轉(zhuǎn)化，挑取熱激轉(zhuǎn)化后的白色菌落，在LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將轉(zhuǎn)入目的片段的Escherichia coli菌液送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序所得的序列NCBI在線比對(duì)，比較其同源性。0F42E0FD-5CE0-4789-8969-FED884934AB0

1.2.5 黑腐病抗性鑒定 所有參試材料均于2019年9月進(jìn)行第1次人工接種鑒定試驗(yàn)，并于2020年9月進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)地點(diǎn)為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所智能溫室與六合試驗(yàn)基地。

采用苗期噴霧法接種，具體參考李永鎬等的方法[10]，稍作改動(dòng)。

育苗：將所用基質(zhì)高溫高壓滅菌，甘藍(lán)種子在50 ℃溫水中浸泡10 min，用吸水紙吸干種子表面水分;營養(yǎng)缽（8 cm×8 cm）在1%福爾馬林溶液中浸泡24 h，用清水沖洗數(shù)次，每缽1粒，在溫室內(nèi)育苗，幼苗生長至4～6張真葉（約30 d）苗齡時(shí)，選擇生長健壯、一致的幼苗進(jìn)行接種鑒定。

接種：將黑腐病菌菌株移至肉湯培養(yǎng)基中，在28 ℃、200 r/min條件下?lián)u培24 h，用適量無菌水調(diào)節(jié)濃度至1.0×108 CFU/mL（D600 nm=0.2）細(xì)菌懸浮液，備用，接種前將幼苗移入鑒定室內(nèi)，澆透水并蓋塑料膜保濕12～24 h（15～20 ℃），使其葉緣出現(xiàn)露珠，次日用噴霧器將菌液均勻噴灑到植株葉片上，以葉片無菌液滴落為止，接種后繼續(xù)保濕24 h，除去薄膜后幼苗于20～25 ℃室溫下培養(yǎng)。

病情調(diào)查和分級(jí)：每份甘藍(lán)材料設(shè)3組重復(fù)，每組重復(fù)10株幼苗，接種后12～15 d調(diào)查發(fā)病情況，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：接種葉片無任何癥狀;1級(jí)，接種葉片水孔處有黑色枯死，無擴(kuò)展;3級(jí)，接種葉片病斑從水孔向外擴(kuò)展，占葉面積5%以下;5級(jí)，接種葉片病斑從水孔向外擴(kuò)展，占葉面積5%～<25%;7級(jí)，接種葉片病斑從水孔向外擴(kuò)展，占葉面積25%～<50%;9級(jí)，接種葉片病斑從水孔向外擴(kuò)展，占葉面積50%及以上。

根據(jù)病情指數(shù)計(jì)算抗性水平：

病情指數(shù)（disease index，DI）=∑（病級(jí)指數(shù)×該病極值）調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高病級(jí)×100。

抗性水平劃分：根據(jù)甘藍(lán)葉片病情級(jí)別，分別計(jì)算出DI平均值，進(jìn)而確定其抗性水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)參考李錫香（2008）的方法[11]，并稍作改動(dòng)。劃分標(biāo)準(zhǔn)：高抗（HR），0≤DI≤11.11;抗?。≧），11.112 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的菌落特征和形態(tài)

黑腐病病原菌菌落近圓形，邊緣完整，略凸起，薄或者平滑，具光澤，有黏性（圖1）。

2.2 病原菌的回接鑒定

將采集的黑腐病病樣分別經(jīng)分離純化后，按照科赫法則回接到甘藍(lán)感病系，14 d后所有接種植株的發(fā)病率為100%，葉片接種部位出現(xiàn)典型的“V”字形病斑，而對(duì)照無菌水接種區(qū)域（CK）沒有出現(xiàn)病變。以上說明所分離的病原菌為甘藍(lán)黑腐病致病菌（圖2）。

2.3 病原菌的分子鑒定

提取黑腐病全基因組DNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到較完整的黑腐病病菌的全基因組DNA，電泳片段顯示約22 kb。用細(xì)菌通用引物，對(duì)黑腐病菌16S rDNA全序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增得到 1.5 kb 大小的片段，這與細(xì)菌16S rDNA序列大小吻合，該片段為目的片段。將目的片段回收，pMD18-T載體連接，感受態(tài)細(xì)胞制備，目的片段進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，PCR擴(kuò)增后選取陽性克隆送置南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序所得的序列進(jìn)行序列比對(duì)（圖3）和系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4），發(fā)現(xiàn)不同來源的黑腐病病菌DNA序列存在差異，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示相近地區(qū)黑腐病病菌聚為一類，親緣關(guān)系較近。

2.4 黑腐病病菌致病力測(cè)試

根據(jù)圖4顯示的不同來源的黑腐病系統(tǒng)發(fā)育聚類分析結(jié)果，挑取代表性地區(qū)（北方地區(qū)Xcc-HEB;西南地區(qū)XccCD;長三角地區(qū)Xcc-HZ;西北地區(qū)Xcc-SX）的黑腐病病菌菌樣進(jìn)行黑腐病致病力測(cè)試，采用噴霧法，菌液濃度1.0×108 CFU/mL，材料選擇耐病材料JX60，京豐作為抗病對(duì)照，實(shí)驗(yàn)室鑒定結(jié)果顯示長三角地區(qū)的代表性菌種 Xcc-HZ 感染能力強(qiáng)于其他地區(qū)，而北方地區(qū)收集的黑腐病病菌Xcc-HEB致病力較弱（圖5）。

2.5 甘藍(lán)材料對(duì)黑腐病抗性鑒定

采用噴霧法對(duì)所有4～5葉期的甘藍(lán)試驗(yàn)材料進(jìn)行黑腐病試驗(yàn)，黑腐病菌濃度為1.0×108 CFU/mL，表2結(jié)果顯示，對(duì)照京豐和慶豐抗性穩(wěn)定，病情指數(shù)區(qū)分度大，抗病類型明顯，因此所篩選的病情具有可信度，在11份甘藍(lán)材料中，篩選到抗病材料3份，耐病材料3份，感病材料3份，高感材料2份，無高抗和免疫材料。

3 討論與結(jié)論

甘藍(lán)黑腐病發(fā)生嚴(yán)重時(shí)危害甘藍(lán)生產(chǎn)，甘藍(lán)黑腐病的防治首先是選用抗病品種，選用豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)抗病的品種是最經(jīng)濟(jì)、有效的防病途徑。甘藍(lán)不同品種對(duì)黑腐病的抗性有很大差異，應(yīng)通過抗病性鑒定篩選獲得高抗品種。而由于黑腐病生理小種的分化較為復(fù)雜，Kamoun利用十字花科植物中的一些品種作為鑒別寄主將黑腐病病原菌劃分為5個(gè)生理小種[12];Vicente等利用7個(gè)十字花科蔬菜品種作為鑒別寄主將黑腐病病原菌劃分為6個(gè)生理小種[13];Jensen等采用rep-PCR技術(shù)將44個(gè)致病菌菌株劃分為5個(gè)生理小種[14];Fargier等在Vicente鑒定得到的6個(gè)生理小種的基礎(chǔ)上又鑒定出3個(gè)不同類型的野生類型，進(jìn)而將其劃分為9個(gè)不同類型的生理小種[15];Cruz等在2017年又鑒定出2個(gè)不同類型的野生油菜黃單胞菌[16]。因此目前共鑒定得到11個(gè)不同類型的黑腐病菌生理小種，說明黑腐病病原菌會(huì)存在分化現(xiàn)象，或者有其他存在的生理小種尚未被發(fā)現(xiàn)，其實(shí)很長時(shí)間以來，國際上比較常用的是Vicente等的劃分標(biāo)準(zhǔn)。

鑒于黑腐病生理小種鑒定工作量大，篩選過程復(fù)雜，耗時(shí)長，因此，目前國內(nèi)關(guān)于甘藍(lán)黑腐病生理小種的分化和致病力的研究報(bào)道較少。李經(jīng)略等研究了北京、哈爾濱、重慶、陜西4地的甘藍(lán)黑腐病菌，結(jié)果表明不同生態(tài)環(huán)境形成的菌系對(duì)甘藍(lán)苗期的致病力存在明顯的分化現(xiàn)象，其中在陜西分離的病原菌致病力最強(qiáng)[17]。程伯瑛等研究了來自山西和陜西的2個(gè)菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2個(gè)菌株在同一甘藍(lán)品種上的致病力表現(xiàn)也存在差異[18]。本研究中，筆者所在課題組收集了1份標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及4個(gè)地區(qū)共10份黑腐病致病菌，挑選代表菌株對(duì)其進(jìn)行致病力測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長江中下游地區(qū)的Xcc-HZ致病力強(qiáng)于其他地區(qū)，而北方地區(qū)收集的黑腐病菌致病力較弱，但是由于本試驗(yàn)一個(gè)代表性地區(qū)僅選擇了一個(gè)樣本，且取樣菌株數(shù)量有限，并未開展系統(tǒng)的生理小種鑒定研究，在今后的研究工作中，應(yīng)加大對(duì)其生理小種分化的鑒定方法研究，找到一套高效、穩(wěn)定的甘藍(lán)黑腐病生理小種鑒別方法，以更好地解析我國甘藍(lán)黑腐病菌生理小種的分布情況，結(jié)合生理小種劃分對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前，甘藍(lán)黑腐病抗病性的鑒定主要依賴于接種鑒定后觀察發(fā)病，而外觀表現(xiàn)是受基因控制的，所以通過分子輔助選擇來檢測(cè)材料是否具備抗病基因是最可靠、最直接的鑒定材料抗病性的方法，根據(jù)正向遺傳學(xué)研究思路，想找到抗病基因，首先要篩選到高抗病材料，才能配置雜交組合，找到與黑腐病緊密連鎖的基因，從而完善甘藍(lán)黑腐病抗性鑒定方法，為甘藍(lán)抗黑腐病育種提供依據(jù)。本研究篩選了筆者所在研究室保存的高代自交系和商品種共11份材料，遺憾的是并未篩選到高抗病材料，推測(cè)是由于使用的材料數(shù)量較少，后期應(yīng)加大篩選數(shù)量，多年重復(fù)試驗(yàn)，采取實(shí)驗(yàn)室和田間表型鑒定相結(jié)合的方法，爭取篩選到能穩(wěn)定遺傳的高抗黑腐病材料，為后期抗黑腐病甘藍(lán)育種奠定研究基礎(chǔ)。

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