甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和表達(dá)分析*

李 玲，劉新軍，張保蓮，張斯羽，歐陽(yáng)智剛，?

(1. 贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；2. 國(guó)家臍橙工程技術(shù)研究中心，江西 贛州 341000)

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中一直遭受干旱、高鹽、低溫及病蟲害等各種生物和非生物脅迫的影響[1].在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化中，植物形成了一個(gè)復(fù)雜、有效的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，以抵抗外界不利環(huán)境[2].轉(zhuǎn)錄因子作為反式作用元件，通過與靶標(biāo)基因上游的順式作用元件特異性結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控方式來(lái)精確地應(yīng)答脅迫反應(yīng)[3].近年來(lái)研究顯示AP2/ERF(APETALA 2/ethylene-responsive element bindingfactor)、bZIP(Basic-domain leucine-zipper)、WRKY、MYB、NAC(NAM、ATAF1/2 和CUC2)、bHLH(Basic helix-loop-helix)、NF-Y(Nuclear Factor Y)和CAMTA (CaM-binding transcription activator)等轉(zhuǎn)錄因子參與了調(diào)控植物多種逆境脅迫反應(yīng)[4-11].其中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子是最大的家族之一.

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白含有高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域.AP2結(jié)構(gòu)域包含58個(gè)或59個(gè)氨基酸，與靶標(biāo)DNA序列具有高親和力.根據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和特征，AP2/ERF家族可分為四個(gè)亞家族，包括AP2(APETALA2)、RAV(related to ABI3/VP1)、REB(脫水反應(yīng)性元素結(jié)合蛋白, dehydration-responsive element binding protein)和ERF(乙烯反應(yīng)因子, ethylene-responsive factor)[12].AP2家族含2個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，ERF和DREB家族僅含1個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，這兩個(gè)家族均又進(jìn)一步細(xì)分為6或7個(gè)亞組 (A1-A6;B1-B6或-B7).RAV家族除含有一個(gè)AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域外，還包含1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域[13-14].ERF家族是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子大家族中的一個(gè)主要亞家族，ERF蛋白可以與許多乙烯調(diào)節(jié)的防御基因啟動(dòng)子區(qū)域GCC框(AGCCGCC)的順式元件特異性結(jié)合，起轉(zhuǎn)錄激活因子或阻遏物的作用[15].ERF轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于植物中，Nakano等(2006)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)基因組中分別鑒定了65和77個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子[16-17].最近幾年隨著多種植物基因組測(cè)序完成，相繼在鳳梨(Ananascomosus)、芹菜(Apiumgraveolens)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)、棉花(Gosssypiumraimondii)、蘋果(Malus×domestica)、甘蔗(Saccharumspontaneum)、番茄(Solanumlycopersicum)、綠豆(Vignaradiata)、葡萄(Vitisvinifera)和玉米(Zeamays)等中篩選和鑒定了ERF轉(zhuǎn)錄因子[18-28].

ERF亞家族不同亞組中的成員具有不同的功能.研究表明ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子在植物防御病菌的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用.本文根據(jù)ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在甜橙基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選和鑒定了21個(gè)ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步分析了甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子受黃龍病菌和外源激素的誘導(dǎo)表達(dá)情況.同時(shí)研究了甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活活性.本文的研究可以為甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的功能分析提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料和前處理

本試驗(yàn)所用柑橘材料為贛南早(CitrussinensisOsbeck cv. Gannanzao)幼苗，均由贛南師范大學(xué)國(guó)家臍橙工程與技術(shù)研究中心提供.激素誘導(dǎo)處理：分別用1 mM SA，100 μMJA，100 μM ABA噴霧處理贛南早幼苗，對(duì)照為等量噴無(wú)菌水，恒溫保濕培養(yǎng)[29].分別于0 h、24 h和48 h后采集樣品葉片，-80 ℃下保存.

1.2 植物葉片總RNA提取

將植物葉片置于液氮中磨碎，每0.5 g葉片加入1 mL Trizol，震蕩混勻，并室溫放置5 min，4 ℃ 10 000 g離心10 min，取上清，每使用1 mL Trizol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，于室溫放置5 min.4 ℃ 10 000 g離心10 min，取上清，重復(fù)加入0.2 mL和0.5 mL氯仿萃取2次.離心后把水相轉(zhuǎn)移到新管中，等體積加入異丙醇，于室溫放置10 min.4 ℃ 10 000 g離心10 min，棄上清.用75%乙醇洗滌RNA沉淀.每使用1 mL Trizol至少加1 mL 75%乙醇.4 ℃不超過5 000 g離心5 min，棄上清.室溫放置干燥5 min，再加入20 μL～30 μL無(wú)RNase的水溶解RNA，置于-80 ℃下保存.

1.3 柑橘ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)篩選

從柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.citrusgenomedb.org/)下載甜橙全基因組1.0(ftp://ftp.bioinfo.wsu.edu/www.citrusgenomedb.org/Citrus_sinensis/C.sinensis_Hzau_v1.0_genome/annotation/)蛋白組數(shù)據(jù). 利用HMMER 3.1b2軟件包中的hmmbuild程序?qū)RF結(jié)構(gòu)域種子序列(PF04404)建立隱馬爾可夫模型，利用hmmsearch程序在甜橙蛋白組數(shù)據(jù)中進(jìn)行搜索(E-value<10-3)，獲得含ERF結(jié)構(gòu)域蛋白. 將挖掘出的所有含ERF結(jié)構(gòu)域蛋白和已報(bào)道的893條真核及原核生物中的含ERF結(jié)構(gòu)域蛋白序列一起利用hmmalign程序基于PF04404的隱馬爾可夫模型進(jìn)行多重序列比對(duì)，得到比對(duì)序列. 利用MEGA7軟件打開比對(duì)文件，并人工調(diào)整. 利用Smart model selection軟件對(duì)比對(duì)序列最適的最大似然法建樹模型進(jìn)行檢測(cè). 根據(jù)最適建樹模型，利用PhyML3.0對(duì)比對(duì)文件建立系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，利用外群法確定樹根. 系統(tǒng)發(fā)生樹上，與植物含ERF結(jié)構(gòu)域序列形成單系群的甜橙含ERF結(jié)構(gòu)域序列為甜橙的ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子.

1.4 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位

以甜橙cDNA為模板，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)序列設(shè)計(jì)引物，特異性擴(kuò)增目的基因全長(zhǎng)序列(引物見附表1)，將PCR產(chǎn)物插入瞬時(shí)表達(dá)載體pGR106中，分別命名為pGR106:CsERF B3-9/10/13/20/21并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中. 將攜帶pGR106:CsERF B3-9/10/13/20/21的農(nóng)桿菌在含有50 mg/L卡那霉素(Kan)、50 mg/L氯霉素(Chol)和25 mg/L慶大霉素(Gen)的YEP平板上劃線，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，并采用菌落PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化結(jié)果. 按1:50～1:100的比例接種于10 mL含相同抗生素的YEP中，28 ℃、220 rpm培養(yǎng)8 h～12 h擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.8～1.2，4 000 rpm，4 ℃離心10 min收集菌體，棄上清，用含有乙酰丁香酮(50 mmol/L, AS)的侵染液(1 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L MES, pH 5.6)懸浮菌體，使其OD600=1.0～1.5，室溫放置3 h后，以攜帶pGR106:GFP載體的GV3101為陰性對(duì)照，用不帶針頭的1 mL針管抵住煙草葉片的背面，注入葉片，48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白定位.

1.5 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性分析

以甜橙cDNA為模板，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)序列設(shè)計(jì)CsERFB3-9/10/13/20/21引物特異性PCR擴(kuò)增其全長(zhǎng)序列(引物見附表1)，將PCR產(chǎn)物酶切插入載體pGBKT7中.將重組質(zhì)粒和pGBKT7空白載體分別轉(zhuǎn)入酵母菌株YRG-2中.酵母轉(zhuǎn)化方法：用YPDA固體培養(yǎng)基(10 g/L Yeast extract,20 g/L Tpyptone,20 g/L Agar,2% dextrose glucose)培養(yǎng)酵母菌株2 d～3 d后，刮取25 μL酵母菌落懸于1 mL ddH2O中，高速離心5 s后，用1 mL 100 mM LiAc懸浮沉淀；30 ℃水浴中溫育5 min，高速離心5 s，棄上清；在沉淀物中按順序分別加入以下液體：240 μL PEG(50% w/v,重量/體積)，36 μL LiAc(1.0 M)、50 μL ssDNA(2.0 mg/mL)、5 μL plasmid DNA(100 ng至5 μg)、20 μL ddH2O；渦旋1 min，42 ℃溫育40 min后；12 000 rpm離心10 s，棄去上清，用200 μL～400 μL ddH2O 重懸沉淀，取適量涂于SD/-Trp培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 d.挑單菌落分別劃線于SD/-Trp/-His培養(yǎng)基上，2 d后觀察轉(zhuǎn)錄因子活性結(jié)果.

1.6 RT-qPCR

按SuperScript III Kit(Invitrogen, 中國(guó)上海)方法對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的序列設(shè)計(jì)RT-qPCR特異性引物(引物見附表1)，以基因CitEF1作為內(nèi)參.每個(gè)RT-qPCR反應(yīng)體系包含12.5 μL SYBR? Premix Ex TaqTM、1 μL正反向引物(10 μmol/L)、1 μL cDNA模板和9.5 μL RNAse-free水.反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，34個(gè)循環(huán).

圖1 甜橙(C. sinensis)、擬南芥(A. thaliana)、番茄(S. lycopersicum)、甘蔗(S. spontaneum)、玉米(Z. mays ssp)和葡萄(V. vinifera)ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進(jìn)化分析

本文在柑橘數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選和鑒定了21個(gè)甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子. 根據(jù)染色體上的位置，我們將其分別命名為CsERFB3-1～21(對(duì)應(yīng)的Gene ID分別為：Cs1g03250_1、Cs1g03260_1、Cs1g03270_1、Cs1g03280_1、Cs1g03290_1、Cs1g03300_1、Cs1g03310_1、Cs2g05270_1、Cs2g05280_1、Cs5g08360_1、Cs5g23980_1、Cs5g24010_1、Cs5g29870_1、Cs5g29880_1、Cs5g29890_1、Cs5g29900_1、Cs8g12780_1、Cs9g10680_1、Cs9g13610_1、Cs9g13620_1、Cs9g13630_1).將CsERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列與擬南芥、甘蔗、番茄、玉米和葡萄共149個(gè)ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列構(gòu)建親緣關(guān)系進(jìn)化樹(如圖1所示).ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子被分為4組，其中第1組中包括12個(gè)甜橙、4個(gè)擬南芥、5個(gè)甘蔗、12個(gè)番茄、5個(gè)玉米和6個(gè)葡萄ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子；第2組包括1個(gè)甜橙、1個(gè)甘蔗、1個(gè)番茄、1個(gè)玉米和1個(gè)葡萄ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子；第3組分別包括4個(gè)甜橙、10個(gè)擬南芥、5個(gè)甘蔗、11個(gè)番茄、2個(gè)玉米和20個(gè)葡萄ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子；第4組4個(gè)甜橙、3個(gè)擬南芥、5個(gè)番茄、12個(gè)甘蔗、10個(gè)玉米和14個(gè)葡萄ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子.此外我們發(fā)現(xiàn)幾個(gè)甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子與番茄已報(bào)道的具有抗病功能的轉(zhuǎn)錄因子聚類關(guān)系比較近，比如CsERFB3-10和番茄SlERF.A1、CsERFB3-17和番茄SlERF.C3、CsERFB3-19與CsERFB3-20和SlERF.B4、CsERFB3-21和SlERF.A4以及CsERFB3-13和擬南芥AtERF93/94等.

圖2 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中的表達(dá)分析

2.2 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中的表達(dá)特征

我們?cè)诟涕倩蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)中下載甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子在愈傷組織、花、葉和果實(shí)中的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中的表達(dá)模式不一樣(如圖2所示.Callus：愈傷組織；Flower：花；Leaf：葉；Fruit：果實(shí)).CsERFB3-3/7/8/11/12/14/15/16/17/18在愈傷組織、花、葉和果實(shí)這四個(gè)組織中表達(dá)均很低.在其余的CsERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子中，除了CsERFB3-19之外，其他CsERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子均在果實(shí)中表達(dá)最高，葉片中的表達(dá)量次之.

2.3 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子在感染黃龍病不同柑橘品種的表達(dá)特征

甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子對(duì)黃龍病菌有著不同的響應(yīng)，相同基因在不同的品種中也存在差異表達(dá).我們根據(jù)不同品種感染黃龍病的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[30]，分析了柑橘ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子在道縣野橘(C.daoxianensis)、宜昌橙(C.ichangensis)和甜橙中應(yīng)答黃龍病侵染的表達(dá)特征(如圖3所示.FPKM.CD-HLB：道縣野橘黃龍病患病植株FPKM值；FPKM.CD-MOCK：健康道縣野橘FPKM值；FPKM.CI-HLB：宜昌橙黃龍病患病植株FPKM值；FPKM.CD-MOCK：健康宜昌橙FPKM值；FPKM.CS_HLB：甜橙黃龍病患病植株FPKM值；FPKM.CD_MOCK：健康甜橙FPKM值).

圖3 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子受HLB病原菌誘導(dǎo)的表達(dá)分析

該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，CsERFB3-1/2/3/7/8/11/12/14/15/16/17/18這12個(gè)基因的表達(dá)豐度在3個(gè)品種中表達(dá)都非常低，F(xiàn)PKM (Fragments Per Kilobase Million)值大部分為0或接近于0，這與柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)情況相似(圖2).在道縣野橘中，CsERFB3-2/5/6/21這四個(gè)基因在感染黃龍病后上調(diào)表達(dá)顯著，相反CsERFB3-10和CsERFB3-13兩個(gè)基因下調(diào)表達(dá)顯著；在宜昌橙中，CsERFB3-5和B3-6兩個(gè)基因是上調(diào)表達(dá)，CsERFB3-19/20/21為下調(diào)表達(dá)；在甜橙中，CsERFB3-5/6/9/19/20/21六個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)，只有CsERFB3-1一個(gè)基因下調(diào)表達(dá).同時(shí)還發(fā)現(xiàn)CsERFB3-5和B3-6這兩個(gè)基因在3個(gè)品種中均呈上調(diào)表達(dá)，但CsERFB3-21在道縣野橘和甜橙中上調(diào)表達(dá)顯著，而在宜昌橙中則為下調(diào)表達(dá)顯著.

2.4 激素誘導(dǎo)ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)特征

根據(jù)柑橘感染黃龍病菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們挑選了表達(dá)相對(duì)較高的CsERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子(CsERFB3-4/5/6/9/10/13/19/20/21)進(jìn)行外源激素誘導(dǎo)表達(dá)分析(如圖4所示).通過熒光定量PCR技術(shù)分析激素處理后甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況，結(jié)果顯示CsERFB3-9/10/13/20/21基因在12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)受SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)顯著，而CsERFB3-4顯著下調(diào)表達(dá).受JA誘導(dǎo)12 h或/和24 h后CsERFB3-10/13/20/21四個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)，同樣CsERFB3-4基因下調(diào)表達(dá)顯著.ABA誘導(dǎo)對(duì)CsERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)影響較小，只有在24 h時(shí)，CsERFB3-4和CsERFB3-21分別下調(diào)和上調(diào)表達(dá)顯著.另外CsERFB3-5/6/19這三個(gè)基因在3種激素誘導(dǎo)下表達(dá)均無(wú)差異.

圖4 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子受激素誘導(dǎo)的表達(dá)分析

2.5 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位

為了明確甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位，根據(jù)ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答黃龍病病原菌的表達(dá)情況，我們挑選了CsERFB3-9/10/13/20/21五個(gè)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究.結(jié)果顯示：在對(duì)照組中，本氏煙細(xì)胞核和細(xì)胞膜上均可觀察到GFP信號(hào)，而CsERF B3-9/10/13/20/21-GFP融合蛋白則只定位在細(xì)胞核上(如圖5所示)，表明CsERF B3-9/10/13/20/21-GFP為核定位蛋白.

圖5 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位

圖6 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)

2.6 甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性分析

在攜帶對(duì)照載體pGBKT7的酵母細(xì)胞中，載體上酵母轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4 DNA結(jié)合域(DNA binding domain, BD)可以和上游激活序列結(jié)合，但不能引起報(bào)告基因LacZ轉(zhuǎn)錄.如將一段具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建到pGBKT7載體上，其表達(dá)產(chǎn)生的BD與上游激活序列結(jié)合，同時(shí)引起下游報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而水解培養(yǎng)基上的x-α-Gal，使菌落產(chǎn)生藍(lán)斑.利用這一原理，我們對(duì)CsERFB3-9/10/13/20/21進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄活性驗(yàn)證.結(jié)果表明(如圖6所示)，攜帶pGBKT7:CsERF B3-9/10/13/20/21的酵母均能在雙缺培養(yǎng)基SD/-Trp/-His上正常生長(zhǎng)，并且雙缺培養(yǎng)基中加入x-α-gal 后顯示藍(lán)色反應(yīng)，說(shuō)明CsERFB3-9/10/13/20/21均具有轉(zhuǎn)錄激活活性.

3 討論

ERF轉(zhuǎn)錄因子是植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中最大的亞家族之一，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)又進(jìn)一步分為6～7個(gè)亞組(B1～B7)不等，比如在擬南芥、水稻、番茄、葡萄和玉米等植物中分為6個(gè)亞組[16-17,25,27-28]，而在二穗短柄草和棉花等植物中則分為7個(gè)亞組[20,22].在ERF亞家族中，ERF B3亞組成員相對(duì)較多.比如在小麥中有22個(gè)，在擬南芥中有18個(gè)，葡萄有37個(gè)[16,27-28].本文在柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選鑒定了21個(gè)ERF B3亞組成員.我們進(jìn)一步對(duì)植物ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子與番茄和擬南芥中已報(bào)道的具有抗病功能的轉(zhuǎn)錄因子聚類關(guān)系比較近，比如CsERFB3-10和番茄SlERF.A1、CsERFB3-17和番茄SlERF.C3、CsERFB3-19與CsERFB3-20和SlERF.B4、CsERFB3-21和SlERF.A4以及CsERFB3-13和擬南芥AtERF93/94等.聚類關(guān)系較近的基因在功能上具有相似性，我們推測(cè)與報(bào)道的具有抗病功能的轉(zhuǎn)錄因子聚類關(guān)系較近的甜橙CsERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子可能在抗病反應(yīng)中也發(fā)揮作用.

植物ERF蛋白可以作為轉(zhuǎn)錄激活物或抑制因子發(fā)揮作用[31].順式作用元件GCC盒是ERF轉(zhuǎn)錄因子的主要靶位點(diǎn)，ERF轉(zhuǎn)錄因子能結(jié)合啟動(dòng)子中GCC盒調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá).研究表明擬南芥AtERF15(AtERF93)、TERF1、番茄SlERF.A1、SlERF.B4和SlERF.C3在酵母細(xì)胞中均具有轉(zhuǎn)錄激活活性[29,32-33].此外擬南芥ERF1和ORA59可以和JA/ET響應(yīng)的病原相關(guān)基因PDF1.2和b-CHI上的CGG box結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)其表達(dá)[34-35].本文中，CsERFB3-9/10/13/20/21等5個(gè)甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子也均有轉(zhuǎn)錄激活作用，并且位于細(xì)胞核內(nèi)，因此我們推測(cè)該5個(gè)甜橙ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子也具有誘導(dǎo)含有CGG box基因表達(dá)的能力.

植物激素水楊酸、茉莉酸和乙烯在抗生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)中起主要作用.這種調(diào)節(jié)是通過連接不同途徑的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，從而使每個(gè)途徑根據(jù)需要協(xié)助或拮抗其他途徑來(lái)微調(diào)對(duì)單個(gè)病原體的防御反應(yīng).一般認(rèn)為SA在激活對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)性病原菌的防御中起主要作用，而JA和ET則對(duì)壞死性病原菌攻擊的防御相關(guān)，此外SA抗病信號(hào)途徑和JA/ET抗病信號(hào)途徑間存在相互拮抗的關(guān)系.比如SA可以通過下調(diào)ORA59的表達(dá)擬制JA應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá).EFR B3亞組轉(zhuǎn)錄因子能通過依賴SA和/或JA途徑激活植物對(duì)病原菌的抵抗力.研究表明GbERFb、GmERF113、擬南芥ERF1(AtERF92)、AtERF15(AtERF93)、ORA59(AtERF94)、ATERF14(AtERF97)、NbERF173、番茄SlERF.A1、SlERF.B4、SlERF.C3、ZmERF105、小麥TaERF3和TaAP2-155等EFR B3亞組轉(zhuǎn)錄因子參與了植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)[29,33,35-36].反過來(lái)ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子受病原菌誘導(dǎo)存在差異表達(dá)，例如SlERF.A1、SlERF.B4和SlERF.C3受病原菌的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)顯著[29].本文CsERFB3-9/10/13/20/21被SA和/或JA誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)也受黃龍病菌的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)顯著.我們推測(cè)這5個(gè)ERF B3亞組轉(zhuǎn)錄因子可能通過依賴SA和JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑正調(diào)控甜橙對(duì)黃龍病菌的抗性反應(yīng).然而要證明這些推測(cè)，還需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，比如通過過表達(dá)或基因沉默來(lái)驗(yàn)證基因功能.