孫夢(mèng)曉，丁輝，王躍飛，高秀梅，李雪，楊文志

（天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是保障其國(guó)際化的重中之重。在新型冠狀病毒肺炎疫情中，中藥復(fù)方也成為疫情防控的中國(guó)亮點(diǎn)[1]。但因其多味藥疊加，具有“多成分、多靶點(diǎn)、多渠道”整體性協(xié)同發(fā)揮作用的特點(diǎn)[2]，這就使得其物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明尤為迫切。

隨著分析儀器的快速發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因兼有色譜的高分離性能和質(zhì)譜的高靈敏度以及高選擇性的特點(diǎn)，被廣泛用于中藥及復(fù)方分析，極大推動(dòng)了對(duì)中藥的研究探索[3]。超高效液相色譜/離子淌度-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC/IM-QTOF-MS）是一種集快速色譜分離與維度增強(qiáng)高分辨測(cè)定的分析技術(shù)，通過(guò)選用亞2 μm填料色譜柱，能夠極大減少溶劑消耗，增強(qiáng)分離度、提高分析效率；另外，數(shù)據(jù)非依賴(lài)高分辨MSE采集（HDMSE）具有離子淌度分離功能、同時(shí)最大可能覆蓋所有母離子獲取二級(jí)質(zhì)譜信息，從而支持中藥復(fù)方多成分的系統(tǒng)表征與鑒定[4]。

張伯禮院士團(tuán)隊(duì)為助力常態(tài)化疫情防控，研發(fā)了對(duì)呼吸系統(tǒng)感染性疾病的防治有較好療效的清感飲（春飲、夏飲、秋飲、冬飲、童飲）制劑，具有清咽潤(rùn)喉，疏風(fēng)解毒的功效，也有預(yù)防季節(jié)性流感的作用，目前已在天津市共400余家醫(yī)療機(jī)構(gòu)調(diào)劑使用[5]。其中，清感春飲用于外感風(fēng)邪、濕濁內(nèi)蘊(yùn)證，處方由炒草果仁、連翹、炒牛蒡子、射干、桔梗、茉莉花茶等組成；夏飲用于暑熱犯表證，處方由廣藿香、薄荷、牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫蘇葉、金銀花、焦山楂、甘草、綠茶組成；秋飲用于風(fēng)燥襲肺證，處方由北沙參、桑葉、炒牛蒡子、射干、桔梗、赤芍、紫蘇葉、金銀花、焦山楂、甘草片、菊花等組成；冬飲用于外感風(fēng)寒、陽(yáng)氣不足證處方由黃芪、虎杖、炒牛蒡子、射干、桔梗、紅茶等組成；童飲用于外感風(fēng)邪、肺氣失宣證，處方由薏苡仁、連翹、牛蒡子、薄荷、桔梗、赤芍、紫蘇葉、焦山楂、甘草、菊花組成。

本研究從中藥復(fù)方整體性出發(fā)，采用超高效液相色譜與離子淌度-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UHPLC/IM-QTOF-HDMSE），進(jìn)行色譜質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化后采集清感飲制劑樣品及其單味藥數(shù)據(jù)，基于UNIFI軟件調(diào)用自建數(shù)據(jù)庫(kù)的自動(dòng)峰注解流程進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；優(yōu)先對(duì)主要色譜峰進(jìn)行單味藥歸屬，根據(jù)對(duì)照品比對(duì)結(jié)果和高分辨質(zhì)譜裂解信息，結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)，全面快速地闡明清感飲（系列）制劑的化學(xué)成分，見(jiàn)圖1。

圖1 基于UHPLC/IM-QTOF-HDMSE結(jié)合UNIFI自動(dòng)峰注釋和自建數(shù)據(jù)庫(kù)的清感飲系列制劑的多成分表征流程圖Fig.1 A schematic diagram exhibiting the efficient characterization of the multiple components from Qinggan Yin series preparations based on UHPLC/IM-QTOF-HDMSEin combination with automatic peak annotation by UNIFI and searching against the in-house libraries

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑 Vion IMS-QTOF離子淌度高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀（Waters公司，美國(guó)）；Milli-Q Integral 5純水機(jī)（Millipore公司，美國(guó)）；MS105DU型十萬(wàn)分之一電子天平、ME104/02型萬(wàn)分之一電子天平（Mettler Toledo公司，瑞士），LQ-A6001型十分之一電子天平（上海瑤新電子科技有限公司）；L530型臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；5804R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，美國(guó)）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；FSJ-A05N6型小熊粉碎機(jī)（小熊電器股份有限公司）。

甲醇、乙腈（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)）、甲酸（Sigma-Aldrich公司，瑞士）均為色譜純，超純水由Milli-Q純水機(jī)制備。

1.2 藥品 清感飲系列制劑：天津中醫(yī)藥大學(xué)省部共建組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研團(tuán)隊(duì)研制（清感春飲、夏飲、秋飲、冬飲、童飲）；單味藥藥材飲片黃芪[Astragali Radix：Astragalus membranaceus（Fisch.）

Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge，批號(hào)：1908045]，牛蒡子（Arctii Fructus：Arctium lappa L.，批號(hào)：1909015），射干 [Belamcandae Rhizoma：Belamcanda chinensis（L.）DC.，批號(hào)：2005011]， 桔梗 [Platycodonis Radix：Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.，批號(hào)：190601]，赤芍（Paeoniae Radix Rubra：Paeonia lactiflora Pall.或Paeonia veitchii Lynch，批號(hào)：2004082），紫蘇葉[Perillae Folium：Perilla frutescens（L.）Britt.，批號(hào)：2001032]，金銀花（Lonicerae Japonicae Flos：Lonicera japonica Thunb.，批號(hào)：20200701），焦山楂（Crataegi Fructus：Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或 Crataegus pinnatifida Bge.，批號(hào)：200301），甘草（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma：Glycyrrhiza uralensis Fisch.或 Glycyrrhiza inflata Bat.或 Glycyrrhiza glabra L.，批號(hào)：200601），連翹[Forsythiae Fructus：Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl，批號(hào)：191201]，草果（Tsaoko Fructus：Amomum tsaoko Crevost et Lemaire，批號(hào)：190801），廣藿香 [Pogostemonis Herba：Pogostemon cablin（Blanco）Benth.，批號(hào)：2003034]，薄荷（Menthae Haplocalycis Herba：Mentha haplocalyx Briq.，批號(hào)：2003149），北沙參（Glehniae Radix：Glehnia littoralis Fr.SchmidtexMiq.，批號(hào)：2004065），桑葉（MoriFolium：Morus alba L.，批號(hào) ：1902158）， 虎杖（Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix：Polygonum cuspidatum Sieb.Et Zucc.，批號(hào)：2003018），菊花（Chrysanthemi Flos：ChrysanthemummorifoliumRamat.，批號(hào)：191101），薏苡仁[Coicis Semen：Coix lacrymajobi L.var.mayuen（Roman.）Stapf，批號(hào)：200301]均由安徽省世茂醫(yī)藥有限公司提供；茉莉花茶（Jasminum Tea，批號(hào)：HXJ19-0356），綠茶（GreenTea，批號(hào)：202004006），武夷紅茶（Black Tea，批號(hào)：201910016）均由天津市河西區(qū)春光茶業(yè)經(jīng)營(yíng)部提供。飲片經(jīng)檢測(cè)均符合《中國(guó)藥典》2020年版一部的有關(guān)規(guī)定。

對(duì)照品新綠原酸（編號(hào) 1，批號(hào)：DST191028-015）、綠原酸（編號(hào) 2，批號(hào)：DST190906-021）、隱綠原酸（編號(hào) 3，批號(hào)：DST190908-035）、異綠原酸 B（編號(hào)4，批號(hào)：DST191008-037）、異綠原酸 A（編號(hào) 5，批號(hào)：DST190918-036）、異綠原酸C（編號(hào)6，批號(hào)：DST190904-038）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（編號(hào)7，批號(hào)：DST191026-037）、迷迭香酸（編號(hào)8，批號(hào)：DST190506-027）、獐牙菜苷（編號(hào) 9，批號(hào)：DST200310-014）、芍藥內(nèi)酯苷（編號(hào)10，批號(hào)：DST190912-071）、斷氧化馬錢(qián)子苷（編號(hào)11，批號(hào)：DST190803-111）、芍藥苷（編號(hào) 12，批號(hào)：DST191024-070）、氧化芍藥苷（編號(hào)13，批號(hào)：DST191012-074）、毛蕊花糖苷（編號(hào)17，批號(hào)：DST200709-061）、白藜蘆醇（編號(hào) 23，批號(hào)：DST200308-045）、虎杖苷（編號(hào) 24，批號(hào)：DST190821-038）、芹菜素（編號(hào) 26，批號(hào)：DST190816-026）、金合歡素（編號(hào) 27，批號(hào)：DST200618-037）、木犀草素（編號(hào) 28，批號(hào)：DST191020-032）、山奈酚（編號(hào) 29，批號(hào)：DST191020-056）、夏佛托苷（編號(hào) 31，批號(hào)：DST200524-006）、異夏佛塔苷（編號(hào)32，批號(hào)：DST200416-019）、木犀草苷（編號(hào) 35，批號(hào)：DST191020-016）、紫云英苷（編號(hào) 36，批號(hào)：DSTDZ000101）、蘆丁 （編號(hào) 37，批號(hào)：DSTDL001701）、柚皮素 （編號(hào) 41，批號(hào)：DST200109-100）、橙皮苷（編號(hào) 46，批號(hào)：DST200517-038）、野鳶尾苷（編號(hào) 49，批號(hào)：DST191011-247）、兒茶素（編號(hào) 53，批號(hào)：DST200602-001）、表兒茶素（編號(hào) 54，批號(hào)：DST200304-035）、原花青素B1（編號(hào)55，批號(hào)：DST200602-051）、原花青素B2（編號(hào)56，批號(hào)：DST200523-050）均購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司；連翹酯苷I（編號(hào)14，批號(hào)：3313）、異連翹酯苷A（編號(hào) 15，批號(hào)：7894）、連翹酯苷 A（編號(hào) 16，批號(hào)：3639）、連翹苷（編號(hào) 18，批號(hào)：3212）、牛蒡子苷元（編號(hào) 19，批號(hào)：4137）、牛蒡苷（編號(hào) 20，批號(hào)：5691）、大黃素-8-O-葡萄糖苷（編號(hào)21，批號(hào)：7823）、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷（編號(hào)22，批號(hào)：8075）、槲皮素（編號(hào) 30，批號(hào)：1116）、金絲桃苷（編號(hào)33，批號(hào)：5067）、異槲皮苷（編號(hào)34，批號(hào)：5650）、山奈酚-3-O-新橙皮糖苷（編號(hào) 38，批號(hào)：7989）、山奈酚-3-O-蕓香糖苷（編號(hào)39，批號(hào)：6889）、蒙花苷（編號(hào) 40，批號(hào)：5515）、圣草酚（編號(hào)43，批號(hào)：3535）、新甘草苷（編號(hào) 44，批號(hào)：7543）、毛蕊異黃酮（編號(hào)47，批號(hào)：6126）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（編號(hào) 48，批號(hào)：5240）、異甘草苷（編號(hào) 50，批號(hào)：6387）、新異甘草苷（編號(hào) 51，批號(hào)：6971）、芹糖異甘草苷（編號(hào)52，批號(hào)：5063）均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；甘草酸（編號(hào)25，批號(hào)：PS010448）、甘草苷（編號(hào) 42，批號(hào)：PS012028）、芹糖甘草苷（編號(hào)45，批號(hào)：PS011457）均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司，對(duì)照品純度均大于98%。本研究所用56種對(duì)照品結(jié)構(gòu)式及編號(hào)見(jiàn)圖2。

圖2 56種對(duì)照品結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Chemical structures of the 56 reference compounds used in the current work

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 全方供試品溶液的制備 參考文獻(xiàn)[5]報(bào)道的熱水浸泡服藥方式，分別取清感飲（系列）制劑（清感春飲、夏飲、秋飲、飲冬、童飲）各1袋，精密稱(chēng)定，約3 g，分別置于圓底燒瓶中，精密加入藥材20倍量的超純水，混合均勻，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流提取1 h，取出，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用超純水補(bǔ)足失重，搖勻，離心（4 000 r/min，10 min，半徑 10 cm），取上清液儲(chǔ)存?zhèn)溆?。同時(shí)取上清液加超純水稀釋5倍，離心（14 000 r/min，10 min，半徑 8.8 cm），即得。

2.1.2 各單味藥供試品的制備 分別取21味單味藥粉末（過(guò)4號(hào)篩）約1.0 g，精密稱(chēng)定，分別置于圓底燒瓶中，精密加入藥材粉末20倍量的超純水，混合均勻，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流提取1 h，取出，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用超純水補(bǔ)足失重，搖勻，離心（4 000 r/min，10 min，半徑 10 cm），取上清液儲(chǔ)存?zhèn)溆?。同時(shí)取上清液加超純水稀釋5倍，離心（14 000 r/min，10 min，半徑 8.8 cm），即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)定各對(duì)照品1 mg，加甲醇制備為濃度1.00 mg/mL的各對(duì)照品溶液，精密吸取等量各對(duì)照品溶液，渦旋混勻后加甲醇稀釋為每1 mL分別含各化合物50 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，離心（14 000 r/min，10 min，半徑8.8 cm），即得50 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A），乙腈（B）。梯度洗脫：0～0.5 min，1%B；0.5～6 min，1%～3%B；6～7 min，3%～10%B；7～19 min，10%～15%B；19～29 min，15%～20%B；29～31 min，20%～24%B；31～37 min，24%～40%B；37～39 min，40%～45%B；39～40 min，45%～70%B；40～41 min，70%～98%B；41～44 min，98%B；44～44.5 min，98%～1%B；44.5～49 min，1%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量 2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；采集方法：數(shù)據(jù)非依賴(lài)HDMSE；掃描方式：正負(fù)離子同時(shí)掃描；全掃描范圍（m/z）：100～2 000；離子源溫度：120°C；脫溶劑氣體溫度：500℃；錐孔氣流速（N2）：50 L/h；脫溶劑氣體流速（N2）：800 L/h；毛細(xì)管電壓：1.0 kV；錐孔電壓40 V；碰撞能量20～50 eV。

2.4 數(shù)據(jù)處理和分析 首先，通過(guò)查閱CNKI、Web of Science、ChemSpider、PubChem 等數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索清感飲系列制劑中的各單味藥化學(xué)成分相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)其已報(bào)道NMR數(shù)據(jù)的化學(xué)成分名稱(chēng)、分子式、結(jié)構(gòu)式、亞型等信息進(jìn)行歸納總結(jié)，并將每個(gè)化合物結(jié)構(gòu)式保存為.mol文件，導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI軟件，構(gòu)建清感飲系列制劑化學(xué)成分自建數(shù)據(jù)庫(kù)。

其次，將Vion IMS-QTOF所采集的清感飲系列制劑及單味藥HDMSE數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)NIFITM1.9.3.0軟件（Waters，美國(guó)）進(jìn)行處理和分析。UNIFITM軟件通過(guò)調(diào)用自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行自動(dòng)峰注釋?zhuān)潢P(guān)鍵參數(shù)設(shè)置如下：保留時(shí)間范圍0～41 min；一級(jí)響應(yīng)閾值為100.0 counts；二級(jí)響應(yīng)閾值為50.0 counts；目標(biāo)質(zhì)量數(shù)偏差范圍為10.0 ppm；選定篩選所有同位素中的一個(gè)候選者，從結(jié)構(gòu)中生成預(yù)測(cè)碎片；啟用在源代碼中尋找碎片功能，碎片匹配偏差為10.0 ppm；Lock mass：combine width，3 scans；質(zhì)量窗口 0.5 m/z。負(fù)離子模式加合離子包括+HCOO，-H，+Cl，+e；參比質(zhì)量數(shù)554.262 0；參比電荷-1。正離子模式加合離子包括+H，+Na，-e；參比質(zhì)量數(shù) 556.2766；參比電荷+1。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用UHPLC/IM-QTOF-HDMSE在上述色譜和質(zhì)譜條件下對(duì)清感飲系列制劑全方及單味藥供試品溶液進(jìn)行分析，由于大多數(shù)化合物在負(fù)離子模式的響應(yīng)較好，因此以負(fù)離子模式為主分析清感飲系列制劑中化合物。見(jiàn)圖3。

圖3 清感飲系列制劑負(fù)離子模式下基峰離子圖Fig.3 Base peak intensity chromatograms of Qinggan Yin series preparations in the negative ion mode

圖3為負(fù)離子模式下分別測(cè)定的清感飲系列制劑（春飲、夏飲、秋飲、冬飲、童飲）基峰離子圖，圖中色譜峰編號(hào)與鑒定列表（基于UHPLC/IM-QTOFHDMSE的正負(fù)離子模式下清感飲系列制劑所含化合物鑒定及歸屬）中化合物編號(hào)一致，具體信息見(jiàn)開(kāi)放科學(xué)資源服務(wù)標(biāo)識(shí)碼（OSID）。

利用UHPLC/IM-QTOF-HDMSE正負(fù)離子模式數(shù)據(jù)非依賴(lài)HDMSE模式采集清感飲系列制劑（春飲、夏飲、秋飲、冬飲、童飲）中所含的化學(xué)成分的高分辨碰撞誘導(dǎo)解離二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（CID-MS2），建立基于UNIFI軟件調(diào)用自建數(shù)據(jù)庫(kù)的自動(dòng)峰注解流程，初步鑒定清感飲系列制劑的化學(xué)成分。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)高分辨一級(jí)質(zhì)譜識(shí)別分子式，對(duì)照品比對(duì)、二級(jí)質(zhì)譜裂解行為分析、與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)照等，對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行確證。在同條件下對(duì)清感飲系列制劑各單味藥進(jìn)行分析，通過(guò)色譜峰辨識(shí)歸屬可能的中藥來(lái)源。最終共有177種化學(xué)成分被初步表征，包括73種黃酮類(lèi)，32種有機(jī)酸類(lèi)，18種單萜類(lèi)，15種苯乙醇苷類(lèi)，13種木脂素類(lèi)，10種三萜皂苷類(lèi)，6種醌類(lèi)，5種糖類(lèi)，3種生物堿類(lèi)及2種二苯乙烯類(lèi)。這些成分在清感春、夏、秋、冬、童飲中被表征數(shù)量分別為 106、100、99、101、99 種；其中清感飲系列制劑中特有單味藥茉莉花茶、綠茶、紅茶、菊花所占比例較多，含量較高，所含化合物易被表征；同時(shí)也有部分黃酮類(lèi)及有機(jī)酸類(lèi)等化合物來(lái)源于多味中藥，屬于處方中多種單味藥來(lái)源。同時(shí)，所鑒定的化合物中有46種化合物通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間及質(zhì)譜圖進(jìn)行比對(duì)而確認(rèn)，所鑒定的化合物的誤差范圍均在±5 ppm以?xún)?nèi)。

清感飲系列制劑所表征的177種化合物見(jiàn)開(kāi)放科學(xué)資源服務(wù)標(biāo)識(shí)碼（OSID），涉及參考文獻(xiàn)[6-26]。

3.1 黃酮類(lèi)化合物 本研究從清感飲系列制劑中共鑒定出73種黃酮類(lèi)化合物（F1-F73），主要來(lái)源于菊花、金銀花、甘草等。黃酮類(lèi)化合物，易發(fā)生糖苷鍵的解離，中性丟失有蕓香糖殘基（C12H20O9，308Da），葡萄糖殘基（C6H10O5，162 Da）等；對(duì)于黃酮苷元母核，易在C環(huán)上發(fā)生RDA裂解，產(chǎn)生特征碎片離子；同時(shí)還可以觀(guān)察到常見(jiàn)的中性丟失，如CO（28 Da），CO2（44 Da），H2O（18 Da）等[27]。

化合物F28在負(fù)離子模式下觀(guān)察到準(zhǔn)分子離子 m/z 609.145 5[M-H]-，推斷分子式為 C27H30O16。糖苷鍵斷裂脫去一分子蕓香糖后分別產(chǎn)生一個(gè)均裂碎片峰m/z 300.026 0[M-2H-Glc-Rha]-和一個(gè)異裂碎片離子峰m/z 301.032 6[M-H-Glc-Rha]-；且碎片離子m/z 300.026 0的豐度明顯高于m/z 301.032 6，與3-O糖基取代的黃酮苷的二級(jí)質(zhì)譜裂解特征（均裂碎片豐度大于異裂碎片豐度）一致[28]；脫糖之后剩下的黃酮苷元產(chǎn)生的碎片離子主要有m/z 271.023 1[300-CO-H]-，m/z 255.028 1[301-CO-H2O]-；m/z 151.002 1是黃酮苷元發(fā)生RDA裂解，C環(huán)上的1鍵和3鍵斷裂形成的1，3A-特征碎片，由此推測(cè)該化合物為3-O-黃酮苷。經(jīng)與對(duì)照品蘆丁比對(duì)，保留時(shí)間及二級(jí)質(zhì)譜行為一致，故鑒定該化合物為蘆丁。其二級(jí)質(zhì)譜圖與裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖4 黃酮類(lèi)代表化合物（蘆?。┖湍局仡?lèi)代表化合物（牛蒡苷）負(fù)離子模式下的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.4 The collision-induced dissociation-MS2spectra and proposed fragmentation pathways for the representative flavonoid（rutin）and lignan（arctiin）compounds in negative ion mode

3.2 木脂素類(lèi)化合物 本研究從清感飲系列制劑中共鑒定出13種木脂素類(lèi)化合物（L1-P13），主要來(lái)源于牛蒡子。木脂素因有芐基集團(tuán)，易發(fā)生芐基裂解。

化合物L(fēng)6在負(fù)離子模式下一級(jí)質(zhì)譜圖中可以觀(guān)察到準(zhǔn)分子離子m/z 579.208 3[M+COOH]-，m/z 533.203 2[M-H]-，推斷分子式為 C27H34O11。二級(jí)質(zhì)譜圖中主要碎片離子有m/z 371.149 3[M-H-Glc]-，與牛蒡子苷元對(duì)應(yīng)；m/z 356.126 0[M-H-Glc-CH3]-，進(jìn)而發(fā)生芐基裂解產(chǎn)生碎片離子m/z 235.098 6。經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，該化合物的保留時(shí)間、二級(jí)質(zhì)譜行為與對(duì)照品牛蒡苷一致，最終鑒定該化合物為牛蒡苷。其二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解途徑見(jiàn)圖4。

3.3 有機(jī)酸類(lèi)化合物 本研究從清感飲系列制劑中共鑒定出32種有機(jī)酸類(lèi)化合物（OA1-OA32），主要來(lái)源于金銀花、菊花等。該類(lèi)化合物主要產(chǎn)生酯鍵的解離或糖苷鍵的斷裂，中性丟失有咖啡?；–9H6O3，162 Da）、奎寧酸殘基（C7H10O5，174 Da）等。

化合物OA10在負(fù)離子模式下觀(guān)察到準(zhǔn)分子離子m/z353.0869[M-H]-，推斷分子式為C16H18O9。其產(chǎn)生的主要碎片離子有m/z 191.054 6[M-H-Caffeoyl]-，m/z 173.043 9[M-H-Caffeoyl-H2O]-，m/z 127.038 7[173-HCOOH]-，由此推測(cè)該化合物為咖啡酸與奎寧酸的縮酚酸。通過(guò)與綠原酸對(duì)照品的色譜質(zhì)譜行為進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)該化合物為綠原酸。化合物OA22、OA25、OA30準(zhǔn)分子離子m/z 515，均比綠原酸多一份子的咖啡?；–9H6O3，162 Da），且具有相似的結(jié)構(gòu)碎片，經(jīng)與對(duì)照品色譜質(zhì)譜行為比對(duì)，將化合物OA22鑒定為異綠原酸B，OA25鑒定為異綠原酸A，OA30鑒定為異綠原酸C；并以異綠原酸B（OA22）為例，其二級(jí)質(zhì)譜圖與裂解途徑見(jiàn)圖5。

圖5 有機(jī)酸類(lèi)代表化合物（異綠原酸B）和單萜類(lèi)代表化合物（芍藥苷）負(fù)離子模式下的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.5 The collision-induced dissociation-MS2spectra and proposed fragmentation pathways for the representative organic acid（3，4-dicaffeoylquinic acid）and monoterpenoid（paeoniflorin）compounds in negative ion mode

3.4 單萜類(lèi)化合物 本研究從清感飲系列制劑中共鑒定出18種單萜類(lèi)化合物（MP1-MP18），主要來(lái)源于赤芍和金銀花。萜類(lèi)在負(fù)離子模式下響應(yīng)較好，碎片離子以丟失糖配基較為常見(jiàn)。對(duì)于分子中帶有羧酸基團(tuán)（·COOH，45 Da）、甲氧基（·OCH3，31 Da）等基團(tuán)時(shí)還可以發(fā)生自由基丟失[27]。

化合物MP9在負(fù)離子模式下一級(jí)質(zhì)譜圖中可以觀(guān)察到準(zhǔn)分子離子m/z 525.161 3[M+COOH]-，m/z 479.155 7[M-H]-，推斷分子式為 C23H28O11。二級(jí)質(zhì)譜圖中主要碎片離子有m/z 449.145 2[M-H-CH2OH]-，再丟失一分子苯甲酸產(chǎn)生碎片離子m/z 327.107 4，脫去一分子葡萄糖產(chǎn)生碎片離子m/z 165.054 6。同時(shí)m/z 165.054 6的碎片離子源于芍藥苷類(lèi)化合物的蒎烷基本骨架[29]，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，該化合物的保留時(shí)間及質(zhì)譜行為與對(duì)照品芍藥苷一致，將該成分鑒定為芍藥苷。其二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑見(jiàn)圖5。

3.5 苯乙醇苷類(lèi)化合物 本研究從清感飲系列制劑中共鑒定出15種苯乙醇苷類(lèi)化合物（P1-P15），主要來(lái)源于連翹，是連翹中藥材中的特征性成分。該類(lèi)化合物主要在負(fù)離子模式下形成準(zhǔn)分子離子[M-H]-，碎片離子主要通過(guò)糖苷鍵的斷裂形成，常見(jiàn)的中性丟失有葡萄糖殘基（C6H10O5，162 Da）、咖啡?；–9H6O3，162 Da）H2O（18 Da）、CO2（44 Da）等。

化合物P10在負(fù)離子模式下觀(guān)察到準(zhǔn)分子離子m/z 623.1977[M-H]-，推斷分子式為C29H36O15。二級(jí)質(zhì)譜圖中主要碎片離子有m/z461.1661[M-H-Caffeoyl]-，m/z 315.108 2[M-H-Caffeoyl-Rha]-，315 為二羥基苯乙醇苷母核碎片，咖啡酸碎片m/z 179.033 8，咖啡酸脫去一分子H2O的碎片m/z 161.020 9。經(jīng)對(duì)照品比對(duì)，該化合物的保留時(shí)間、質(zhì)譜行為與對(duì)照品連翹酯苷A一致，鑒定該化合物為連翹酯苷A。其二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑見(jiàn)圖6。

圖6 苯乙醇苷類(lèi)代表化合物（連翹酯苷A）和三萜皂苷類(lèi)代表化合物（甘草酸）負(fù)離子模式下的二級(jí)質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.6 The collision-induced dissociation-MS2spectra and proposed fragmentation pathways for the representative phenylethanoid（forsythoside A）and triterpenoid saponin（glycyrrhizic acid）compounds in negative ion mode

3.6 三萜皂苷類(lèi)化合物 本研究從清感飲系列制劑中共鑒定出10種三萜皂苷類(lèi)化合物（TS1-TS10），主要來(lái)源于甘草和桔梗。該類(lèi)化合物常含有葡萄糖，鼠李糖，芹糖和葡萄糖醛酸等，易發(fā)生糖苷鍵的斷裂產(chǎn)生碎片離子。

化合物TS9在負(fù)離子模式下可以觀(guān)察到準(zhǔn)分子離子m/z 821.395 3[M-H]-，推斷分子式為C42H62O16。二級(jí)質(zhì)譜圖的主要碎片離子有m/z 645.364 1[M-HGlucuronideacid]-和m/z469.319 6[M-H-2Glucuronide acid]-，可以推測(cè)結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)葡萄糖醛酸?；衔颰S10與TS9具有相同的碎片離子，裂解途徑相同，證明兩者互為同分異構(gòu)體，經(jīng)文獻(xiàn)[13]與對(duì)照品比對(duì)，化合物TS9的保留行為與對(duì)照品甘草酸一致，鑒定該化合物為甘草酸，其二級(jí)質(zhì)譜圖和裂解途徑見(jiàn)圖6；推測(cè)TS10化合物為甘草皂苷H2或其同分異構(gòu)體。

3.7 其他化合物 除上述6種主要類(lèi)型的化合物之外，還從清感飲系列制劑中初步表征了4種其他類(lèi)型的化合物，其中包括醌類(lèi)化合物（Q1-Q6），主要為蒽醌類(lèi)化合物，化合物Q3與對(duì)照品比對(duì)，被鑒定為大黃素-8-O-葡萄糖苷；二苯乙烯類(lèi)化合物（ST1、ST2）來(lái)源于虎杖，化合物ST1與對(duì)照品比對(duì)，被確認(rèn)為虎杖苷；糖類(lèi)化合物（S1-S5），主要為寡糖，來(lái)源于桔梗；生物堿類(lèi)化合物（A1-A3），只在正離子模式下被表征，主要來(lái)源于紅茶等。

4 討論

本研究首次利用UHPLC/IM-QTOF-HDMSE方法對(duì)清感飲系列制劑（春飲、夏飲、秋飲、冬飲、童飲）的化學(xué)成分進(jìn)行了較為全面、高效地解析，并對(duì)5種制劑的主要色譜峰來(lái)源進(jìn)行了歸屬和鑒定，因5種制劑同屬清感飲系列，且因色譜圖中有共有峰，故最終將5種制劑鑒定結(jié)果進(jìn)行整合，共有效表征該系列制劑中177種化學(xué)成分，按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類(lèi)主要分為黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、單萜類(lèi)、苯乙醇苷類(lèi)等，其中主要為黃酮類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)成分。

文獻(xiàn)報(bào)道，清感飲系列制劑具有清咽潤(rùn)喉，疏風(fēng)解毒的功效，有較好的抗氧化和抗炎活性，且對(duì)呼吸系統(tǒng)感染性疾病的防治均有較好的療效[5]。本研究利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)清感飲系列制劑進(jìn)行化學(xué)成分分析，并與所組成的各方單味藥進(jìn)行比對(duì)分析，初步確定各制劑的化學(xué)成分來(lái)源。其中有16種成分來(lái)源于牛蒡子，主要為牛蒡苷、牛蒡子苷元等木脂素類(lèi)化合物，具有解毒利咽，止咳抑菌等作用；有17種成分來(lái)源于金銀花，主要為綠原酸等咖啡?？鼘幩犷?lèi)衍生物，具有抗病毒抗炎等作用，且與連翹配伍使用能增強(qiáng)解熱抗炎功效；有33種成分來(lái)源于菊花，主要為有機(jī)酸及黃酮類(lèi)成分，具有抑菌抗炎、抗氧化抗病毒抗腫瘤等活性，因其清肝明目解毒等功效除藥用外也常被用于保健品。

綜上所述，利用本研究所建立的UHPLC/IMQTOF-HDMSE方法并結(jié)合UNIFI智能解析策略，快速實(shí)現(xiàn)了對(duì)清感飲系列制劑的定性分析，且該方法簡(jiǎn)便、高效、靈敏度高，也可進(jìn)一步用于中藥其他復(fù)方的定性分析，同時(shí)也為闡明該制劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供參考。但在全方的BPI圖中也觀(guān)察到一些響應(yīng)較好或單味藥中沒(méi)有出現(xiàn)的色譜峰，表明清感飲系列制劑中還有大量的未知成分，有待于進(jìn)一步研究。