肌醇對不同鹽度條件下凡納濱對蝦幼蝦生長和代謝的影響

何桂倫，易遠名，楊奇慧，譚北平，遲淑艷，劉泓宇

廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院/水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料實驗室，廣東 湛江 524088

凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei) 具有生長快、養(yǎng)殖量大和成活率高等特點[1]，可在鹽度1～50的水體環(huán)境中生活[2]。盡管凡納濱對蝦耐鹽廣，但水體鹽度會對其生長與代謝產(chǎn)生重要影響，適宜的鹽度可使其獲得優(yōu)良的生長發(fā)育和免疫能力[3]。已有研究報道凡納濱對蝦在鹽度12[1]、17[4]或20左右[5-6]能獲得優(yōu)良的生長性能。由于凡納濱對蝦與水體環(huán)境間存在滲透壓力差，在滲透壓調(diào)節(jié)過程中面臨著體內(nèi)主要滲透壓調(diào)節(jié)離子損失和營養(yǎng)物質(zhì)需求量增加等問題[7]，因此高鹽或低鹽環(huán)境不僅會導(dǎo)致凡納濱對蝦滲透調(diào)節(jié)消耗更多的營養(yǎng)和能量[4]，還會導(dǎo)致其增重率、成活率[4]、抗逆性[8-9]和免疫力[9-10]下降等問題，低鹽條件下易受氨氮[11]、副溶血性弧菌 (Vibrio parahemolyticus)[12]和白斑綜合征病毒 (WSSV)[13]等病原體的侵襲。前期研究表明，凡納濱對蝦在鹽度3時的增重率和成活率較鹽度17[4]和30[14]時低，對硼環(huán)境毒性敏感度高于鹽度20[8]，鹽度5時肝胰腺受損[15]，肌肉營養(yǎng)成分較正常鹽度低[16]，血細胞免疫力較鹽度20 時低[14]。

水產(chǎn)動物飼料不僅應(yīng)提供動物體足夠的營養(yǎng)和能量，還應(yīng)具有緩解水產(chǎn)動物在環(huán)境變化時產(chǎn)生不良反應(yīng)的活性物質(zhì)。研究表明，鹽度6時實驗配方低蛋白質(zhì)和高碳水化合物含量 (26%蛋白質(zhì)和6%魚粉加益生菌混合物) 能抵消部分低鹽度帶來的影響，提高凡納濱對蝦的成活率，提高其蛋白質(zhì)效率和免疫力，而飼料蛋白質(zhì)水平的升高 (40%粗蛋白質(zhì)和20%魚粉不含益生菌混合物) 并不能改善對蝦的成活率[17]。肌醇既是一種與維生素H和維生素B1活性相似的營養(yǎng)因子[18]，對細胞膜的結(jié)構(gòu)完整性和功能有重大影響[19]；也是一種重要的環(huán)境調(diào)節(jié)因子，主要以磷脂酰肌醇形式參與調(diào)節(jié)細胞對外部刺激的反應(yīng)或神經(jīng)傳遞并與各種特定蛋白質(zhì)共同作用調(diào)節(jié)酶的活性[20]，進而調(diào)控動物體的生長及代謝[19-24]。前期研究表明，肌醇對水產(chǎn)動物腸道菌群和微環(huán)境調(diào)節(jié)具有重要作用[25]，飼料中添加肌醇能改善斑節(jié)對蝦 (Penaeus monodon) 和幼建鯉 (Cyprinus carpiovarJian) 的腸道環(huán)境[26-27]，提高消化酶活性進而改善腸道消化吸收能力，使中國明對蝦 (Fenneropenaeus chinensis) (肌醇水平 4 000 mg?kg?1)[28]、斑節(jié)對蝦 (肌醇水平 3 400 mg?kg?1)[26]和鹽度 17.4 的凡納濱對蝦 (肌醇水平 1 181.54 mg?kg?1)獲得良好的生長發(fā)育和免疫狀況[29]。飼料中添加肌醇能增強凡納濱對蝦的抗氧化酶活性[30]，肌醇水平 110 mg?kg?1能防止其出現(xiàn)明顯的生長緩慢現(xiàn)象[29]。而飼料中缺乏肌醇不僅會減緩凡納濱對蝦、中國明對蝦和斑節(jié)對蝦的生長，對其發(fā)育和代謝產(chǎn)生不良影響，還會造成凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦成活率明顯降低[26,28-29]，致使建鯉幼魚出現(xiàn)皮膚出血，鱗片脫落，皮膚、尾鰭和背鰭糜爛等癥狀[31]。

凡納濱對蝦的生長發(fā)育和免疫力與其體內(nèi)mTOR蛋白信號通路中的TORC1相關(guān)因子有關(guān)，在環(huán)境因子或營養(yǎng)因子作用下此信號通路發(fā)生改變，進而影響其生長發(fā)育和免疫力[32-34]。低鹽環(huán)境可能會對凡納濱對蝦的健康造成一定損害，肌醇作為環(huán)境和營養(yǎng)因子，可能會改善低鹽條件下蝦的生長、發(fā)育并提高其免疫力，但肌醇對低鹽條件下凡納濱對蝦的生長、發(fā)育和代謝是否有促進作用尚未見報道。隨著凡納濱對蝦在淡水或低鹽條件下養(yǎng)殖面積與規(guī)模的增大，有關(guān)低鹽度下凡納濱對蝦礦物元素[35]、維生素、飼料中蛋白質(zhì)水平[7]、脂類營養(yǎng)[36]和糖類營養(yǎng)[37]的研究廣泛。本研究通過分析對比鹽度4和28條件下凡納濱對蝦的生長指標(biāo)、體組成分、血清生化指標(biāo)和非特異性免疫酶活性等，探討了不同鹽度下肌醇對凡納濱對蝦生長和代謝的影響，以為不同鹽度水體養(yǎng)殖凡納濱對蝦提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

以魚粉、酪蛋白和明膠為蛋白源，豆油和魚油為脂肪源，每千克基礎(chǔ)飼料 (表1) 中分別添加0、100、200、400、800 和 1 600 mg 肌醇配制成 6 種等氮等脂飼料，分別標(biāo)記為J0、J1、J2、J3、J4和J5組開展實驗。計算并稱量各原料，先過80目篩，再混合，加入適量的水揉勻，經(jīng)雙螺桿擠條機[華南理工大學(xué)研制的F-Ⅲ(26)型]制成顆粒狀飼料 (粒徑 1.0 和 1.5 mm) 后，置常壓干燥箱 60 ℃熟化30 min，待溫度降至室溫后于避光通風(fēng)處風(fēng)干，用密封袋裝封后置?20 ℃冰箱備用。

表1 實驗飼料組成及營養(yǎng)水平 (干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(dry mass basis)

1.2 飼養(yǎng)管理

蝦苗購自湛江市中聯(lián)養(yǎng)殖有限公司，于廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地標(biāo)粗4 周至實驗所需規(guī)格后，挑選健康的蝦于室內(nèi)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)開展養(yǎng)殖實驗。選取體質(zhì)量為 (0.75±0.03) g的凡納濱對蝦幼蝦，每個處理組設(shè)3個重復(fù)，共12個處理，在每個0.3 m3的玻璃纖維桶中放養(yǎng)40尾。每天按蝦體質(zhì)量的8%～10%稱料，于07:00、11:00和16:00和20:00投喂，其中早晚投餌量各占一天投餌量的30%～35%，投喂30 min后觀察并記錄攝食情況，根據(jù)天氣條件和攝食情況對投喂量進行調(diào)整。實驗周期共10周，養(yǎng)殖水體鹽度分別為4 (L)和28(H)。根據(jù)飼料和鹽度的不同組合，J0投喂對照組飼料，J1、J2、J3、J4和J5分別為添加100、200、400、800 和 1 600 mg?kg?1肌醇飼料的實驗組；L 為鹽度4的養(yǎng)殖水體條件，H為鹽度28的養(yǎng)殖水體條件，將12個處理組分別命名為LJ0、LJ1、LJ2、LJ3、LJ4、LJ5、HJ0、HJ1、HJ2、HJ3、HJ4、HJ5。實驗期間水中持續(xù)充氧，水溫28.6～31.4 ℃，氨氮質(zhì)量濃度<0.03 mg?L?1，水體溶解氧質(zhì)量濃度>6.8 mg?L?1，pH 7.8～8.2。

1.3 生長指標(biāo)和體成分測定

實驗結(jié)束后，對桶內(nèi)的對蝦進行稱質(zhì)量和計數(shù)，每個重復(fù)隨機選取5尾分析全蝦體成分，按李日美[38]的方法測定水分、粗灰分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪。另選取5尾取出肝胰腺后稱質(zhì)量，計算肝體比。

1.4 血清指標(biāo)及酶活測定

每個重復(fù)取5尾蝦，按李日美[38]方法處理，備測血清中總膽固醇 (Total cholesterol, TC)、甘油三酯 (Triglyceride, TG)、總蛋白 (Total protein, TP)和葡萄糖 (Glucose, Glu)；冰上取出5尾蝦的肝胰腺，按李日美[38]方法處理，用于肝胰腺酸性磷酸酶 (Acid phosphatase, ACP)、堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase, AKP)、總超氧化物歧化酶 (Total superoxide dismutase, T-SOD) 和一氧化氮合成酶(Nitric oxide synthase, NOS) 活性測定。上述指標(biāo)檢測試劑盒均來自南京建成生物工程研究所，按試劑盒說明書進行實驗操作。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (SD)”表示，采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，若單因素各組間平均數(shù)差異顯著則采用Duncan's多重比較法，若交互因素作用顯著，則對單個因素的平均值進行Duncan's多重比較，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。增重率 (Weight gain rate, WGR)、成活率 (Survival rate, SR)、飼料系數(shù) (Feed coefficient, FC)、特定生長率 (Special growth rate, SGR)、蛋白質(zhì)效率 (Protein efficiency ratio, PER)、肝體比 (Hepatopancreas somatic indices, HSI)、蛋白質(zhì)凈利用率 (Net protein utilization, NPU) 等指標(biāo)計算公式如下：

式中：Wt為終末體質(zhì)量；W0為初始體質(zhì)量；nt為實驗結(jié)束時蝦尾數(shù)；n0實驗開始時放蝦尾數(shù)；M為攝食飼料干物質(zhì)質(zhì)量；m0為平均初始體質(zhì)量；mt為平均終末體質(zhì)量；mi為蛋白質(zhì)攝入量；Wh為肝胰腺質(zhì)量；m為蝦體質(zhì)量；t為實驗天數(shù)；MS為氮沉積量；MN為氮攝入量。

2 結(jié)果

2.1 肌醇對凡納濱對蝦生長和飼料利用的影響

肌醇對凡納濱對蝦幼蝦生長和飼料利用有顯著影響 (P<0.05，表2)。鹽度4條件下，各肌醇添加組的終末體質(zhì)量、增重率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率均顯著高于對照組 (P<0.05)，LJ2、LJ3、LJ4和LJ5組的成活率顯著高于對照組 (P<0.05)，隨著肌醇水平的升高呈上升趨勢，飼料系數(shù)反之，肌醇水平 1 600 mg?kg?1的飼料系數(shù)最低，其余指標(biāo)反之。LJ0組的終末體質(zhì)量、增重率、成活率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率顯著低于HJ0組 (P<0.05)，飼料系數(shù)反之，飼料中添加 100 mg?kg?1肌醇組各指標(biāo)與HL0組無顯著差異(P>0.05)。鹽度28條件下，各肌醇添加組的成活率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率顯著高于對照組(P<0.05)，HJ2、HJ3、HJ4和HJ5組的終末體質(zhì)量、增重率顯著高于對照組，隨著肌醇水平的升高呈上升趨勢，飼料系數(shù)反之，肌醇水平1 600 mg?kg?1的飼料系數(shù)最低，其余指標(biāo)反之。鹽度 28 條件下投喂肌醇水平 100 mg?kg?1的凡納濱對蝦成活率和蛋白質(zhì)效率顯著高于鹽度4 (P<0.05)，200、400、800 和 1 600 mg?kg?1的終末體質(zhì)量、增重率、特定生長率和蛋白質(zhì)效率顯著高于鹽度4(P<0.05)。雙因素方差分析顯示，鹽度和肌醇對終末體質(zhì)量、增重率、成活率、特定生長率、飼料系數(shù)和蛋白質(zhì)效率有顯著影響 (P<0.05)，鹽度和肌醇的交互作用對終末體質(zhì)量、增重率、成活率、特定生長率、飼料系數(shù)有顯著影響 (P<0.05)。

表2 肌醇對凡納濱對蝦幼蝦生長性能的影響Table 2 Effects of inositol on growth performance for juvenile L. vannamei

2.2 肌醇對凡納濱對蝦體組成成分的影響

肌醇對凡納濱對蝦體組成成分有顯著影響(P<0.05，表3)。鹽度28的水分低于鹽度4，而NPU反之。HSI隨著肌醇水平的升高先升后降，在肌醇水平 800 mg?kg?1的達到最大值；NPU 隨肌醇水平的增加呈上升趨勢，在肌醇水平 1 600 mg?kg?1時達到最高。雙因素方差分析顯示，鹽度對水分、NPU有顯著影響(P<0.05)，肌醇水平對HSI和NPU有顯著影響 (P<0.05)，鹽度和肌醇水平的交互作用對HIS、水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分和NPU無顯著影響 (P>0.05)。

表3 肌醇對凡納濱對蝦幼蝦體成分的影響 (干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 3 Effects of inositol on body composition for juvenile L. vannamei (dry matter basis)

2.3 肌醇對凡納濱對蝦血清生化指標(biāo)的影響

肌醇對凡納濱對蝦血清生化指標(biāo)有顯著影響(P<0.05，表4)。兩種鹽度條件下，隨著肌醇水平升高 TC 含量呈下降趨勢，在 1 600 mg?kg?1時最低，均顯著低于對照組 (P<0.05)。鹽度28肌醇水平 400 mg?kg?1組的 TC含量顯著高于鹽度 4(P<0.05)。雙因素方差分析顯示，鹽度和肌醇水平對TC含量有顯著影響 (P<0.05)。鹽度和肌醇水平的交互作用對TP、TG、TC和Glu含量無顯著影響 (P>0.05)。

表4 肌醇對凡納濱對蝦幼蝦血清生化指標(biāo)影響Table 4 Effects of inositol on serum biochemical indexes for juvenile L. vannamei

2.4 肌醇對凡納濱對蝦肝胰腺非特異性免疫酶活的影響

肌醇對凡納濱對蝦肝胰腺非特異性免疫酶活有顯著影響 (P<0.05，表5)。鹽度4條件下，投喂肌醇 200、400 和 800 mg?kg?1組的 ACP 活性無顯著差異 (P>0.05)，但顯著高于對照組 (P<0.05)，200 mg?kg?1組的活性最高。AKP 活性隨肌醇水平的升高呈上升趨勢，200、400、800 和 1 600 mg?kg?1組顯著高于對照組 (P<0.05)，且 1 600 mg?kg?1組顯著高于其他組 (P<0.05)；投喂肌醇對T-SOD和NOS活性無顯著影響 (P>0.05)。鹽度28條件下，各肌醇添加組的ACP活性顯著高于對照組 (P<0.05)，隨肌醇水平的升高，ACP活性呈先升后降趨勢，400 與 200 mg?kg?1組無顯著差異 (P>0.05)，且ACP 活性最高。投喂 100 mg?kg?1肌醇組的 AKP 活性顯著高于其他組 (P<0.05)；投喂200、400、800 和 1 600 mg?kg?1肌醇組的 T-SOD 活性顯著高于對照組 (P<0.05)，400 mg?kg?1組顯著高于其他組 (P<0.05)。NOS活性隨肌醇水平的升高呈先升后降的趨勢，200、400 和 800 mg?kg?1組顯著高于對照組(P<0.05)，400 mg?kg?1組顯著高于其他組 (P<0.05)。LJ0組的AKP和NOS活性顯著低于HJ0組 (P<0.05)。鹽度 4 條件下飼料中添加肌醇 1 600 mg?kg?1(LJ5組)可使凡納濱對蝦的AKP、T-SOD和NOS活性與HJ0組無顯著差異 (P>0.05)，ACP活性顯著高于HJ0組 (P<0.05)。雙因素方差分析顯示，鹽度對ACP、AKP、T-SOD和NOS有顯著影響 (P<0.05)，肌醇水平對ACP、AKP和NOS有顯著影響(P<0.05)，鹽度和肌醇水平的交互作用對AKP、TSOD和NOS有顯著影響 (P<0.05)。

表5 肌醇對凡納濱對蝦幼蝦部分非特異性免疫酶活的影響Table 5 Effects of inositol on some non-specific immunoenzyme activities for juvenile L. vannamei

3 討論

水生動物的生長受水體環(huán)境和飼料等因素的影響，良好的水體環(huán)境和飼料是其取得優(yōu)良生長狀況的重要保障。飼料系數(shù)反映了飼料利用率，飼料系數(shù)越低，說明飼料轉(zhuǎn)化率越高，飼喂效果越好。本研究中，鹽度和肌醇對終末體質(zhì)量、增重率、成活率、特定生長率和飼料系數(shù)的影響存在交互作用，飼料中添加肌醇可顯著提高不同鹽度下凡納濱對蝦的上述指標(biāo)，但對不同鹽度下蝦的促生長作用效果不同。在鹽度 28 下投喂 800 或 1 600 mg?kg?1肌醇可使蝦的終末體質(zhì)量、增重率、特定生長率達到最高水平，投喂 1 600 mg?kg?1肌醇飼料系數(shù)達到最低水平，投喂不低于 100 mg?kg?1肌醇或鹽度 4 投喂不低于 200 mg?kg?1肌醇成活率達到最高水平，而1 600 mg?kg?1肌醇組終末體質(zhì)量、增重率、成活率和特定生長率最大，飼料系數(shù)最小，表明肌醇能促進不同鹽度下蝦的生長、發(fā)育且實現(xiàn)了飼料的高效利用，且高鹽度更優(yōu)。這與Chen等[30]飼料中添加肌醇可促進凡納濱對蝦生長的研究結(jié)果一致，后者報道了肌醇水平高于 1 568 mg?kg?1不會進一步提高蝦的生長性能。凡納濱對蝦在滲透壓調(diào)節(jié)過程中的能量主要由蛋白質(zhì)提供[37]，不同鹽度下對蛋白質(zhì)的需求量不同。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽度2和28的環(huán)境中，凡納濱對蝦的最適蛋白質(zhì)需求量分別為26.7%和33.0%[37]。本研究中，飼料蛋白質(zhì)水平為40.0%(魚粉16.00%)，飼料中添加肌醇降低了飼料系數(shù)，提高了凡納濱對蝦對飼料營養(yǎng)成分的利用，增強了其自身蛋白質(zhì)的生成和貯存能力，且低鹽條件和高肌醇水平下這種作用更明顯，表明肌醇有利于低鹽度養(yǎng)殖凡納濱對蝦正常生長狀態(tài)的恢復(fù)，但具體的作用機制需測定相關(guān)基因后進一步驗證分析。

ACP、AKP、T-SOD和NOS是重要的非特異性免疫酶指標(biāo)。AKP和ACP參與細胞調(diào)控周期中蛋白 (酶) 的去磷酸化階段[39]，在生物體免疫反應(yīng)時可以催化磷酸酯類物質(zhì)水解生成無機磷酸并伴隨促進ATP的生成[40]。有研究表明，水產(chǎn)動物在面對外界不良環(huán)境變化如低鹽或鹽度驟變時體內(nèi)AKP和ACP的活性均受到抑制[41-42]，這與腺嘌呤核糖核苷酸活化蛋白激酶 (AMPK) 有關(guān)，在滲透壓調(diào)節(jié)過程中，凡納濱對蝦體內(nèi)AMPK通過激活A(yù)TP產(chǎn)生途徑和阻斷ATP消耗來管理過量的能量消耗[43]。有研究指出鹽度3較鹽度30的AMPK轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平高[43]。本研究中，鹽度和肌醇對AKP、T-SOD和NOS活性的影響存在交互作用，飼料中添加肌醇提高了AKP活性，鹽度28且肌醇水平 100 mg?kg?1時，AKP 活性最高。在飼料中添加肌醇有利于凡納濱對蝦中AKP和ACP活性的增強[44-45]，飼料中肌醇水平為 600 mg?kg?1時，血淋巴中AKP活性最高[30]；中華絨螯蟹 (Eriocheir sinensis)攝食肌醇水平為 1 650 mg?kg?1時，血清中AKP 活性最高[46]；因此，投喂 100 mg?kg?1肌醇正常鹽度養(yǎng)殖凡納濱對蝦有利于提高其非特異性免疫力。T-SOD是機體內(nèi)清除氧自由基的酶類，可反映機體的抗氧化能力[38]。本研究中，鹽度28且肌醇水平 400 mg?kg?1時 T-SOD 活性最高，說明投喂100 mg?kg?1肌醇、正常鹽度養(yǎng)殖凡納濱對蝦有利于提高其抗氧化能力。NOS是體現(xiàn)動物健康的一個重要指標(biāo)，是生物體內(nèi)合成一氧化氮 (NO) 過程中的關(guān)鍵酶，可作用于病原體的核酸生物體內(nèi)，催化產(chǎn)生的NO具有殺滅細菌、病毒和寄生蟲等作用[12]，其活性受脂質(zhì)代謝、細胞內(nèi)鈣離子或信號傳導(dǎo)的影響[47]。有研究指出，HcNOS具有高度保守性，是典型的無脊椎NOS，可能是應(yīng)對細菌感染和組織移植的關(guān)鍵角色[43]。本研究中，鹽度28、肌醇水平 400 mg?kg?1時 NOS 活性最高，說明飼料中添加適量肌醇有利于提高凡納濱對蝦對氨氮環(huán)境的適應(yīng)能力，這與Chen等[44]的研究結(jié)果一致(肌醇水平介于 459.7～993.8 mg?kg?1時，凡納濱對蝦可適應(yīng)總氨氮質(zhì)量濃度為 60.21 mg?L?1的環(huán)境)。

4 結(jié)論

凡納濱對蝦幼蝦的生長和肝胰腺非特異性免疫指標(biāo)隨攝食肌醇的劑量和鹽度不同而呈不同的變化趨勢。鹽度可顯著影響其生長和非特異性免疫指標(biāo)，各指標(biāo)最大值出現(xiàn)在28鹽度組。肌醇和鹽度對凡納濱對蝦的各生長指標(biāo)和AKP、T-SOD、NOS活性的影響存在交互作用，飼料中添加肌醇可促進凡納濱對蝦的生長發(fā)育，提高其成活率和非特異性免疫力；飼料中添加肌醇介于800～1 600 mg?kg?1時能使兩種鹽度條件下凡納濱對蝦均獲得最佳的生長發(fā)育和成活率；鹽度28條件下，飼料中肌醇水平為 100 或 400 mg?kg?1時，蝦可獲得良好的非特異性免疫力；鹽度4條件下，凡納濱對蝦的生長和非特異性免疫力受到抑制，飼料中肌醇水平不低于200 mg?kg?1可在一定程度上提高其免疫力。