黃靖 韓櫂濂 湯昊 李源恒 孫宏震 張晶晶 程志強 趙春莉

(吉林農(nóng)業(yè)大學，長春,134000)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)為薔薇科植物、多年生落葉灌木，又被稱作野櫻莓、不老梅，原產(chǎn)于美國東部和加拿大東部[1]。成熟的黑果腺肋花楸果實呈藍紫色，含量豐富的花青素；花青素是一種水溶性色素，常與糖苷鍵形成花色苷的形式存在[2-3]。大量研究表明，花色苷具有抗氧化性[4-5]、抗炎[6-7]等多種生物活性，可用于預防和治療糖尿病和心血管疾病[8-9]、調(diào)節(jié)血膽固醇和血壓水平[10-11]、保護視力[12-13]等功能。目前，黑果腺肋花楸作為花色苷含量極為豐富的植物，并未得到廣泛關注和開發(fā)利用，對其含有的花色苷的提取、分離純化方法多為傳統(tǒng)方法。對黑果腺肋花楸含有的花色苷單體的種類及結構沒有充分了解，造成花色苷的提取量少，分離得到的花色苷單體單一等問題。

本研究以超聲輔助提取的方式，并結合響應面分析法對黑果腺肋花楸中花色苷的提取工藝進行優(yōu)化，并用高速逆流色譜對其中的花色苷進行分離制備，結合紫外可見光譜和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術對黑果腺肋花楸中花色苷物質(zhì)進行定性定量分析，以明確得到何種花色苷單體，為黑果腺肋花楸的資源開發(fā)利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸富康源品種，采自吉林省長白山地區(qū)，采摘時間為9月中旬(果實成熟期)，挑選新鮮果實，冷凍保存?zhèn)溆?。試劑采用上海阿拉丁生化科技公司生產(chǎn)的乙腈、正丁醇、甲基叔丁基醚(色譜純)、檸檬酸、三氟乙酸；分離用有機溶劑均為北京化工試劑廠分析純；試驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

儀器與設備主要有食物破壁料理機(中國九陽)、電子天平(日本島津)、超聲細胞破碎機(上海凈信)、離心機(上海安亭)、紫外分光光度計(北京普析)、TBE-300B高速逆流色譜儀(上海同田)、賽默飛世爾Vanquish 3000液相色譜儀和質(zhì)譜儀FSN10450(美國賽默飛世爾)。

1.3 黑果腺肋花楸果花色苷的提取方法

1.3.1 超聲波輔助法

單因素試驗設計：取新鮮的黑果腺肋花楸果實，用去離子水清洗，在陰涼處晾干附著于果皮表面的水珠，立即放入食物破壁料理機中充分勻漿，精確稱量1 g果漿。篩選含1%檸檬酸的乙醇體積分數(shù)、超聲功率、超聲時間、V(液)∶m(料)作為單因素試驗的獨立變量；為了確定4個變量的合適范圍，將4個自變量設置為6個水平(見表1)，試驗均重復3次。

表1 各因素水平的選擇

中心組合(Box-Benhnken)響應面試驗設計：根據(jù)中心組合試驗設計原理[14]，以單因素試驗最佳結果為基礎，每個因素選取3個水平，建立4因素3水平的響應面分析，優(yōu)化黑果腺肋花楸中花色苷最佳提取工藝。

黑果腺肋花楸花色苷質(zhì)量分數(shù)的測定：分別準確移取0.5 mL提取液于2支10 mL試管中，再分別用pH為1.0、4.5的緩沖溶液定容至5 mL，避光平衡60 min后，以去離子水作為空白對照，用紫外-可見光分光光度計分別測定待測液在510、700 nm處的吸光度，利用公式對待測液中花色苷質(zhì)量分數(shù)進行計算，計算公式如下[15]：總花色苷的質(zhì)量分數(shù)=(A×M×DF×V)/(ε×m)。式中：M為矢車菊-3-葡糖糖苷分子量(449.2)；A為花色苷總吸光度(A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5)，A510為花色苷在510 nm處的吸光度；A700為花色苷在700 nm處的吸光度；DF為稀釋因子；V為提取液總體積；ε為矢車菊-3-葡糖糖苷的消光系數(shù)(26 900)；m為原料質(zhì)量。

1.3.2 高速逆流色譜分離純化方法

粗提物的制備：在響應面試驗的基礎上，采用最佳工藝條件：含1%檸檬酸的體積分數(shù)為56%乙醇溶液作為提取劑，稱取10 g的果漿，按照V(液)∶m(料)=20 mL∶1 g加入提取溶劑，設定超聲功率為125 W、超聲提取4 min后，過濾；將濾渣在相同條件下提取2次，合并3次所得的濾液，40 ℃下減壓濃縮，回收乙醇，得到濃縮液以1∶1的體積比加入乙酸乙酯萃取3次，收集水相，40 ℃下再次減壓濃縮，得到花色苷粗提液，將粗提液減壓濃縮，冷凍干燥后備用。

高速逆流色譜的分離條件：根據(jù)參考文獻[16-17]確定高速逆流色譜分離黑果腺肋花楸花色苷的適宜溶劑體系為V(正丁醇)∶V(甲基叔丁基醚)∶V(乙腈)V∶(水)∶V(三氟乙酸)=2.00∶2.00∶1.00∶5.00∶0.01。取溶劑體系中的上下兩相各5 mL溶解花色苷粗提物粉末100 mg，搖勻靜置后，分別取上下相各1 mL，通過0.45 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜(HPLC)檢測，并得到樣品在兩相中的分配系數(shù)K值[18-19]，實驗樣品A上相與A下相的比值(K值)等于1.34，在0.5～2.0范圍符合K值選擇要求，測得固定相保存率為58%。

將按比例配置的溶劑系統(tǒng)充分混合，待溶液平衡后，將兩相分離靜置12 h或超聲脫氣20 min，選擇下相作為流動相，設定流速為2 mL·min-1；取200 mg粗提物樣品溶于上下兩相各10 mL用于進樣，主機轉(zhuǎn)速設定為900 r·min-1，紫外檢測波長為510 nm的條件下進行分離純化，根據(jù)圖譜進行收集，將收集到的組分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)避光冷凍干燥并置于-80 ℃中保存。

1.3.3高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析(HPLC-MS)方法

將所得到的組分，分別溶解并稀釋至適當濃度，用紫外分光光度計進行200～700 nm全波長掃描，分析其波長特征。

色譜條件：Hypersil GLOD VANQUISH AQ柱(100 mm×2.1 mm)色譜柱。流動相為0.1%甲酸水(A相)-乙腈(B相)。梯度洗脫為0～1 min，2% B；1～25 min，2%～98% B；25～27 min，98% B；27.1 min，98%～2% B；27.1～30 min，2% B。柱溫箱溫度35 ℃；流速0.3 mL·min-1；進樣量1 mL。

質(zhì)譜條件：鞘氣40 Arb；輔助氣5 Arb；離子傳輸管溫度320 ℃；霧化器溫度320 ℃；離子峰掃描范圍150～1 500 m/z。

1.3.4 花色苷抗氧化能力的測定

按照參考文獻[20]方法并稍作改動，采用無水乙醇溶解DPPH配制成濃度為0.6 mmol·L-1的混合溶液，避光保存。將2 mL DPPH溶液與1 mL不同組分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)分別配制成不同質(zhì)量濃度(10、20、40、60、80、100 g·L-1)的溶液混合均勻，避光反應30 min，以同濃度的維生素C溶液作陽性對照，在517 nm處測定混合液的吸光度A，按照公式計算DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除率=[A0-(A1-A2)/A0]×100%。式中，A1為樣品組(樣品和DPPH溶液)的吸光度；A2為樣品對照組(樣品和無水乙醇)的吸光度；A0為對照組(無水乙醇與DPPH溶液)的吸光度。

2 結果與分析

2.1 影響花色苷提取量的單因素水平

由表2可知，隨著超聲波水平的增加花色苷的質(zhì)量分數(shù)發(fā)生了明顯的改變，先增加后降低，各水平間差異極顯著(P<0.01)，當超聲波功率為120 W(水平4)時，花色苷的提取量最大(5.09 mg·g-1)。主要原因是超聲波增加了空化氣泡的數(shù)量，在超聲提取中，氣泡會爆裂并產(chǎn)生局部壓力，導致植物組織破裂，提高溶劑滲透性并加速活性成分的滲出，從而有利于花色苷的提??；當功率超過120 W時，空化氣泡會急劇增加，超聲能量傳輸?shù)浇橘|(zhì)中的效率降低，花色苷的內(nèi)部結構也更易被破壞，從而降低了花色苷的提取量。

隨著乙醇體積分數(shù)水平的增加花色苷的質(zhì)量分數(shù)發(fā)生了明顯的改變，先增加后降低，各水平間差異極顯著(P<0.01)，當乙醇體積分數(shù)為60%(水平4)時，花色苷的提取量最大(4.62 mg·g-1)。主要原因是花色苷為水溶性天然色素，當乙醇溶液體積分數(shù)不斷增加，溶液體系中含水量減小，隨之溶出的花色苷減少，果實中花色苷的提取量因其溶解量減少而降；當乙醇體積分數(shù)超過60%時，溶液體系中所含的水分逐漸減少，花色苷溶解到水中能力受限，從而降低了花色苷的提取量。

隨著超聲時間的增加花色苷的質(zhì)量分數(shù)發(fā)生了明顯的改變，先增加后降低，各水平間差異顯著(P<0.05)，當超聲時間為4 min(水平4)時，花色苷的提取量最大(4.73 mg·g-1)。主要原因是超聲波具有破壁作用，在超聲提取過程中使溶劑滲透到植物基質(zhì)中，在一定的時間變化范圍內(nèi)，超聲時間越長花色苷的溶出量越大。當超聲時間達到4 min時，花楸果細胞完全破碎，從而有利于花色苷的提??；當超聲時間超過4 min時，花色苷會因長時間暴露在超聲波中，導致部分花色苷在過高溫度環(huán)境下被氧化、分解，使得花色苷的提取量逐漸下降。

隨著V(液)∶m(料)的增加花色苷的質(zhì)量分數(shù)發(fā)生了明顯的改變，先增加后下降，各水平間差異顯著(P<0.05)，當V(液)∶m(料)為20 mL∶1 g(水平4)時，花色苷的提取量最大(4.57 mg·g-1)。主要原因是植物內(nèi)細胞液與外部溶劑的存在濃度差，比值越大，代表植物內(nèi)細胞液與外部溶劑的濃度差越大，花色苷在其中擴散速度加快，從而有利于花色苷的提取，當V(液)∶m(料)超過20 mL∶1 g時，超聲能量隨單位體積的增大而減小，使得花色苷的提取量下降。

表2 各因素對黑果腺肋花楸花色苷提取量的影響

2.2 黑果腺肋花楸中花色苷最佳提取條件

由于各單因素的最佳值為水平4(乙醇體積分數(shù)為60%、超聲功率為120 W、超聲時間為4 min、V(液)∶m(料)=20 mL∶1 g)，因此，根據(jù)各因素水平3、水平4和水平5進行響應面實驗設計(見表3)。

表3 響應面實驗設計與花色苷提取量

利用Design-Expert 12軟件，通過方差分析，花色苷提取量預測模型如下：

Y=6.38-0.326 7A+0.175 0B+0.085 8C-0.060 8D-

0.452 5(A×B)+0.037 5(A×C)-0.035 0(A×D)-

0.040 0(B×C)-0.462 5(B×D)-0.16(C×D)-

0.998 4A2-1.000 0B2+0.005 3C2-0.764 7D2，

R2=0.983 8，

式中：Y為花色苷提取量，A為乙醇體積分數(shù)，B為超聲波功率，C為超聲時間，D為V(液)∶m(料)。

表4 回歸模型方差分析結果

由1(a)可知，在超聲時間保持在4 min、V(液)∶m(料)=20 mL∶1 g的情況下(零級水平)，在乙醇體積分數(shù)從40%增加到56.13%、超聲功率從80 W增加125.21 W時，三維響應曲面逐漸向上上升，說明花色苷提取量也相應增大；當分別超過56.13%和125.21 W時，曲面開始下降，表明花色苷提取量逐漸減小。另外，等高線圖也可以印證乙醇體積分數(shù)和超聲功率之間交互作用極顯著(P<0.01)，這與回歸模型方差分析相符合。

由1(b)可知，當乙醇體積分數(shù)和液料比分別固定在60%和V(液)∶m(料)=20 mL∶1 g時(零級水平)，在超聲波功率為80～123.16 W、超聲時間為3～4.16 min，曲面呈現(xiàn)上升狀態(tài)，說明在此范圍內(nèi)兩因素交互作用使花色苷提取量在不斷增加；當曲面上升至頂點時，對應的兩因素條件為123.16 W、4.16 min，此時花色苷提取量最大為6.38 mg·g-1。另外，等高線圖可觀察得到，超聲功率和超聲時間兩因素交互作用極顯著(P<0.01)。

由圖1(c)可知，當乙醇體積分數(shù)和超聲時間分別設定為60%和4 min的前提下(零級水平)，圖形呈現(xiàn)先上升后下落的曲面，這與隨超聲功率、V(液)∶m(料)的增加，花色苷提取量先增大后減小相對應。當超聲功率為116.70 W、V(液)∶m(料)=20.30 mL∶1 g時，達到曲面的頂點且此時花色苷提取量最大為6.20 mg·g-1。此外，等高線圖也反映超聲功率和V(液)∶m(料)也存在顯著的交互作用(P<0.05)。

通過求解回歸方程，得到所選變量的最佳值為：乙醇體積分數(shù)55.75%、超聲功率125.02 W、超聲時間4.12 min、V(液)∶m(料)=20.64 mL∶1.00 g，黑果腺肋花楸花色苷的提取量可達最大理論值為6.51 mg·g-1，根據(jù)實際操作情況，將最佳工藝條件修改為：乙醇體積分數(shù)56%、超聲功率125 W、超聲時間4 min、V(液)∶m(料)=20 mL∶1 g，在此條件下進行花色苷提取的驗證試驗，重復3次，花色苷提取量平均值為6.49 mg·g-1。針對近似誤差的百分比計算預測值和實驗值，該百分比不超過接近誤差的10%，近似誤差為1.05%，表明驗證的結果在預測值和實驗值基本吻合，優(yōu)化參數(shù)可用。

2.3 高速逆流色譜(HSCCC)分離純化花色苷

由圖2可知，黑果腺肋花楸花色苷粗提物中分離得到4個峰，其中峰1未完全分離，峰2、3、4分別在62、123、195 min時出現(xiàn)并都取得了較好的分離效果，將得到的3個純度較高的組分分別命名為組分Ⅰ、組分Ⅱ、組分Ⅲ。

在波長280、510 nm左右有最大吸收波長是花色苷類物質(zhì)的特征[21]，所以在指定波長下有無最大吸收波長可作為初步判斷物質(zhì)是否為花色苷的方法之一。由圖3可知，組分Ⅰ在220.1、280.5、514.23處有最大吸收波長，組分Ⅱ在226.3、282.5、519.6處有最大吸收波長，且通過對比發(fā)現(xiàn)組分Ⅰ和Ⅱ最大吸收波長相似且圖譜輪廓也相似，初步推測二者為同一花色苷元，組分Ⅲ在221.9、286.4、523.6處存在最大吸收波長，3個組分在特定波長范圍內(nèi)均有最大吸收峰，由此可證明得到的組分為花色苷物質(zhì)。

圖1 各因素交互作用的響應面及等高線

由圖4可知，將高速逆流色譜分離得到的3個組分進行純度分析，各組分分離效果較好，均無其他雜峰，表明得到單一的花色苷，根據(jù)峰面積計算各組分的純度為：組分Ⅰ為82.04%、組分Ⅱ為85.65%、組分Ⅲ為88.37%。

2.4 花色苷的結構式

根據(jù)分子離子及其碎片可以確認分離得到的花色苷的身份[22]，由圖5(a)的ESI-MS信息可知，組分Ⅰ的碎片離子的質(zhì)荷比(m∶z)為419.1，二級碎片離子的質(zhì)荷比(m∶z)為287.06是矢車菊的特征離子[23]，遺失碎片的質(zhì)荷比(m∶z)為132是脫水五碳糖基的質(zhì)量分數(shù)。另外，由紫外可見吸收光譜可知，組分Ⅰ的A440/Aλmax大于20%可判斷其成苷位在C3上，經(jīng)分析可初步判定組分Ⅰ為矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷，這與位路路[24]、李騰[25]等人檢測出的黑果腺肋花楸花色苷的結果一致。

圖2 高速逆流色譜分離黑果腺肋花楸花色苷的色譜圖

圖3 高速逆流色譜各組分紫外-可見光譜圖

圖4 組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的高效液相色譜色譜圖

由圖5(b)的ESI-MS信息可知，組分Ⅱ的碎片離子的質(zhì)荷比(m∶z)為449.11，二級碎片離子的質(zhì)荷比(m∶z)為287.06是矢車菊的特征離子，遺失碎片的質(zhì)荷比(m∶z)為162是脫水六碳糖基的質(zhì)量分數(shù)，由于花色苷用鹽酸水解后的六碳糖只有葡萄糖，另外，由紫外可見吸收光譜可知，組分Ⅱ的A440/Aλmax大于20%，經(jīng)分析可可初步判定組分Ⅱ為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，這一結果與Br?unlich et al.[26]人提取出的花色苷單體結論相同。

由圖5(c)的ESI-MS信息可知，組分Ⅲ的碎片離子的質(zhì)荷比(m∶z)為465.1，二級碎片離子的質(zhì)荷比(m∶z)為303.05，遺失碎片的質(zhì)荷比(m∶z)為162，這表明組分Ⅲ的花色苷是飛燕草素為母核與葡萄糖形成的苷，再結合紫外吸收光譜可知，組分Ⅲ的A440/Aλmax大于20%，經(jīng)分析初步判定組分Ⅲ為飛燕草素-3-O-葡萄糖苷，這一結論與張上上等[27]人鑒定出的花青苷類化合物研究結果一致。

圖5 各組分ESI-MS圖及花色苷結構式

2.5 花色苷的抗氧化性

通過測定DPPH自由基清除率可以判斷花色苷的抗氧化能力，以IC50值(清除率為50%時，抗氧化劑的濃度值)作為評價花色苷清除DPPH自由基能力的指標，值越小清除效果越好[28]。由表5可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的提高，對DPPH自由基清除率呈上升趨勢，經(jīng)計算維生素C、花色苷粗提物、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的IC50值分別為46.94、32.52、24.53、21.15、15.38 g·L-1。說明組分Ⅲ清除DPPH自由基的能力最強，其次是組分Ⅱ，再次為組分Ⅰ，也就是說分離出的3個單體抗氧化性均強于花色苷粗提物，且花色苷粗提物、組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ也均強于維生素C，說明黑果腺肋花楸中花色苷的抗氧化效果較好。這是由于不同的花色苷單體結構不同導致抗氧化性不同[29]，飛燕草素-3-O-葡萄糖苷(組分Ⅲ)苯環(huán)上的酚羥基數(shù)量最多(9個)，與DPPH發(fā)生氧化還原反應提供氫也最多，所以抗氧化能力最強。對DPPH自由基清除能力由強到弱的順序為：飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷、花色苷粗提物、維生素C。

表5 黑果腺肋花楸中花色苷和VC對DPPH自由基清除率的影響

3 結論

在本研究中，采用超聲波輔助技術從黑果腺肋花楸果實中提取花色苷，超聲功率對花色苷提取量的影響最大，其次是乙醇體積分數(shù)，再次是超聲時間，產(chǎn)生最小影響的是V(液)∶m(料)?；ㄉ兆罴烟崛l件為：乙醇體積分數(shù)56%、超聲功率125 W、超聲時間4 min、V(液)∶m(料)=20 mL∶1 g，花色苷的實際提取量為6.49 mg·g-1。利用高速逆流色譜方法從黑果腺肋花楸中成功分離得到3個組分，通過對3個組分紫外吸收光譜、液相色譜以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析，判定組分Ⅰ為矢車菊3-O-阿拉伯糖苷、組分Ⅱ為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、組分Ⅲ為飛燕草素-3-O-葡萄糖苷；黑果腺肋花楸中花色苷對DPPH自由基清除能力由強到弱的順序為：飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷、花色苷粗提物。

該實驗再次證實，超聲輔助提取能有效地從植物中提取重要的化學物質(zhì)，為進一步分離純化花青素等天然色素提供技術支持，也為黑果腺肋花楸花色苷的應用提供了基礎數(shù)據(jù)和理論指導。分離出的花色苷單體具有抗氧化能力，對更深入地促進黑果腺肋花楸在食品、藥品和化妝品領域的應用具有重要的實踐意義。