■馮 鑫 周金影 欒嘉明 楊東旭 楊 濛 張 敏 金英海 耿春銀*

（1.延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學，東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林 延吉 133000）

棉籽粕是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，但因含有游離棉酚等抗營養(yǎng)因子，在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用常被限制。游離棉酚是一種具有醛基和活性羥基的棉酚，長期食入可對動物的血管、細胞神經(jīng)造成危害，使動物的生理功能發(fā)生紊亂，影響動物的生長發(fā)育[1]，因此棉籽粕的脫毒處理對其開發(fā)與應(yīng)用尤為重要。

目前，關(guān)于棉籽粕脫毒方法主要有化學脫毒法、物理脫毒法、生物脫毒法等。微生物固態(tài)發(fā)酵法屬生物脫毒法，是將微生物接種到特定的固態(tài)培養(yǎng)基中，利用微生物在生長代謝過程中會產(chǎn)生的生物酶，作用于游離棉酚等抗營養(yǎng)因子，降解游離棉酚或者將游離棉酚轉(zhuǎn)化為結(jié)合棉酚，進而達到降低棉籽粕毒性的目的[2]。微生物固態(tài)發(fā)酵條件溫和，相較傳統(tǒng)的物理、化學方法對棉籽粕中營養(yǎng)物質(zhì)的破壞程度較低，具有成本低、效果好、較安全等優(yōu)勢，是最具前景的棉籽粕脫毒方法之一。可用于降解游離棉酚的微生物主要有假絲酵母、黑曲霉等真菌和枯草芽孢菌和乳酸菌等細菌[3-4]。由于不同微生物菌種產(chǎn)酶種類及能力不同，對游離棉酚的降解效果也存在差異，因此篩選優(yōu)良的微生物菌種是保證棉籽餅（粕）脫毒效果和營養(yǎng)價值的首要步驟，鑒于此目的，本試驗選取了不同菌種對棉籽粕固態(tài)底物進行發(fā)酵，以選取出最優(yōu)的發(fā)酵菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棉籽粕由延邊大學農(nóng)學院動物營養(yǎng)實驗室提供（見表1），使用前粉碎過40目篩。

表1 棉籽粕營養(yǎng)成分

乳酸菌和酵母菌1 號由延邊大學農(nóng)學院動物營養(yǎng)實驗室保存；黑曲霉菌（菌種編號為CICC 41481）、紅曲霉菌（菌種編號為CICC 41606）、地衣芽孢桿菌（菌種編號為CICC 21112）、枯草芽孢桿菌10071（菌種編號為CICC 10071）、枯草芽孢桿菌10089（菌種編號為CICC 10089）均購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；拉曼酵母菌（菌種編號為CNCMI-1077），購自拉曼營養(yǎng)公司；福邦活性酵母菌，購自福邦酵母股份有限公司。

酵母菌和黑曲霉菌的培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，成分為馬鈴薯淀粉5 g、葡萄糖20 g、氯霉素0.1 g；乳酸菌的培養(yǎng)基為MRS 培養(yǎng)基，成分為蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸二銨2 g、乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1.0 mL、硫酸鎂0.5 g、硫酸錳0.25 g、瓊脂15 g、純化水1.0 L；紅曲霉菌的培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基，成分為5°Bé麥芽汁1.0 L、瓊脂15 g；枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基成分為蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、氯化鈉（NaCl）5 g、瓊脂20 g、純化水1.0 L；地衣芽孢桿菌的培養(yǎng)基成分為蛋白胨5 g、牛肉浸提物3 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、純化水1.0 L。以上培養(yǎng)基使用前均在121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用單因素試驗設(shè)計，取50 g 棉籽粕于棕色廣口瓶中，加入50 mL 的水（按100%的接水量），分別接入5 mL（按10%的接種量）酵母菌、乳酸菌、芽孢桿菌、黑曲霉菌、紅曲霉菌，具體分組見表2，每組6 個平行，pH 自然，用無菌的玻璃棒攪拌均勻，保鮮膜封蓋廣口瓶，并在保鮮膜上扎口。在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置，好氧培養(yǎng)72 h[5-6]。通過對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚含量、營養(yǎng)價值和酶活性指標進行分析，比較不同菌種的發(fā)酵效果，選出最優(yōu)的發(fā)酵菌種。

表2 微生物固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的分組情況

1.3 感官指標的測定

樣本發(fā)酵72 h后，每組隨機抽取3個進行感官評定。

1.4 游離棉酚和pH的測定

游離棉酚含量采用國標間苯三酚法進行測定[7]，pH使用實驗室pH計ST3100進行測定。

1.5 活菌數(shù)的測定

活菌數(shù)使用計數(shù)板在顯微鏡下進行測定[13]。

1.6 營養(yǎng)物質(zhì)含量的測定

粗蛋白含量的測定使用FOSS 8400 全自動凱氏定氮儀；干物質(zhì)、粗脂肪、粗灰分、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的含量按GB/T 6435—2014[8]、GB 6433—2006[9]、GB 6438—2007[10]、GB 20806—2006[11]、NY 1459—2007[12]的方法進行測定；半纖維素含量由NDF含量減去ADF含量計算得出。

1.7 酶活性的測定

酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶以及纖維素酶活性使用試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）測定；酸性木聚糖酶、中性木聚糖酶、堿性木聚糖酶活性使用試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司）測定；總淀粉酶含量由α-淀粉酶含量加上β-淀粉酶含量計算得出。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗的數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 軟件的GLM 模型進行方差分析，并用LSD、Duncan’s法進行多重比較，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種發(fā)酵對棉籽粕感官指標的影響（見表3）

由表3可知，通過發(fā)酵后的棉籽粕顏色會較大程度地加深，其中對照組為黃褐色，伴有棉籽油的香氣。T1、T2、T3組發(fā)酵棉籽粕底物呈深褐色，酒香味濃郁。T4組發(fā)酵后的顏色為深褐色，且伴有濃濃的酸味。T5、T6、T7、T8組發(fā)酵后成深棕色，腐敗味兒濃厚。T9組發(fā)酵后的棉籽粕為深褐色中帶有白色，且伴有醇香味。

表3 不同菌種發(fā)酵棉籽粕底物的感官指標變化

2.2 不同菌種發(fā)酵對棉籽粕游離棉酚含量、pH 及活菌數(shù)的影響（見表4）

表4 不同菌種發(fā)酵對棉籽粕游離棉酚含量、pH及活菌數(shù)的影響

由表4可知，與對照組相比，T1～T9組的游離棉酚的含量均顯著降低（P<0.05），其中T1組對棉籽粕的降解效果優(yōu)于其他菌種，游離棉酚降解率高達75.39%。此外，T1～T9組發(fā)酵后的pH均顯著降低（P<0.05）。除T7 組外，經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵后各處理組相應(yīng)的活菌數(shù)量均較發(fā)酵前有所升高。

2.3 不同菌種發(fā)酵對棉籽粕底物營養(yǎng)價值的影響（見表5）

表5 不同菌種發(fā)酵對棉籽粕底物營養(yǎng)價值的影響（%）

由表5 可知，與對照組相比，經(jīng)菌種發(fā)酵后干物質(zhì)、粗灰分、酸性洗滌纖維以及半纖維素含量均沒有顯著的變化（P>0.05），發(fā)酵棉籽粕的粗脂肪和粗蛋白含量顯著提高（P<0.05），中性洗滌纖維的含量顯著降低（P<0.05）。在粗蛋白方面，T1 組和T8 組的含量顯著高于除T9組外的其他組（P<0.05）。

2.4 不同菌種發(fā)酵對棉籽粕底物中酶活性的影響（見表6）

表6 不同菌種發(fā)酵對棉籽粕底物中酶活性的影響（U/g）

由表6可知，與對照組相比，T1～T9組的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和中性木聚糖酶的活性顯著升高（P<0.05），其他酶活性指標沒有顯著性差異（P>0.05）。

3 討論

感官指標是評價棉籽粕利用效果的最直接的指標。在發(fā)酵的前期棉籽粕的黏度較小、物料分散，在發(fā)酵的后期，棉籽粕的黏度增大且呈塊狀。顏色方面，通過不同的菌種固態(tài)發(fā)酵后的棉籽粕底物顏色皆為棕色或褐色，差異不大。氣味方面，枯草芽孢桿菌發(fā)酵后呈現(xiàn)腐敗氣味，可能與枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過程中發(fā)生脫羧作用或者脫氨作用產(chǎn)生有機氨、有機酸和氨氣有關(guān)?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉菌的腐敗氣味也可能與其特性有關(guān)，由于他們皆是好氧菌，在發(fā)酵后期氧氣的供應(yīng)量不足，導(dǎo)致發(fā)酵不充分，發(fā)生結(jié)塊，產(chǎn)生腐敗的味道[14]。紅曲霉菌發(fā)酵產(chǎn)生醇香味，酵母菌1號菌、福邦酵母菌、拉曼酵母菌發(fā)酵后呈酒香味，與真菌在固態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生醇類物質(zhì)有關(guān)[15]。乳酸菌產(chǎn)生濃濃的酸味則可能是發(fā)酵過程中生成的有機酸和乳酸導(dǎo)致的[16]。從實際生產(chǎn)角度出發(fā)，酒香味和醇香味的適口性更好，可考慮使用酵母菌和紅曲霉菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕。

通過微生物發(fā)酵降解游離棉酚的關(guān)鍵是菌種的選擇，目前報道的用于棉籽粕脫毒的菌株主要集中于酵母菌和一些天然霉菌。本試驗通過不同菌種對棉籽粕進行固態(tài)發(fā)酵，各組游離棉酚的含量均顯著降低，這可能是由于菌種在發(fā)酵過程中分泌氨基酸等物質(zhì)，這些物質(zhì)可以與游離棉酚結(jié)合，轉(zhuǎn)化為結(jié)合棉酚，降低游離棉酚的含量[17-19]。通過比較發(fā)現(xiàn)，效果最好的是T1組，對游離棉酚的降解率高達75.39%，福邦酵母菌和拉曼酵母菌對游離棉酚同樣具有很好的脫毒效果，這可能與酵母菌本身所具有的脫毒特性有關(guān)，酵母菌對真菌毒素、細菌內(nèi)毒素及其他有害物質(zhì)具有減毒或脫毒作用，酵母菌細胞壁中的β-葡聚糖及糖蛋白參與了生物脫毒過程[20]。通過對比可知，酵母菌1號對游離棉酚的降解作用最好，其次是拉曼酵母和福邦酵母。pH 既是發(fā)酵的條件也是發(fā)酵的影響因素，在實際生產(chǎn)中，其高低還是反映飼料品質(zhì)的重要指標。本試驗發(fā)現(xiàn)，不同菌種對棉籽粕發(fā)酵后pH 均顯著降低，主要由于菌種在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸等酸性物質(zhì)。

棉籽粕作為高蛋白質(zhì)飼料，粗蛋白的含量是反映其營養(yǎng)價值的重要指標。酵母菌1 號、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、地衣芽胞桿菌、福邦酵母菌和拉曼酵母菌均可以顯著提高發(fā)酵棉籽粕粗蛋白含量，其中酵母菌1 號和黑曲霉在提高粗蛋白方面優(yōu)于其他菌。粗蛋白含量的增加一方面是因為菌種在發(fā)酵過程中消耗了底物中的碳水化合物等物質(zhì)，降低了發(fā)酵產(chǎn)物的總質(zhì)量，使蛋白質(zhì)的比例增加[21-22]，另一方面在發(fā)酵過程中由于微生物生長而釋放出大量的酶或者多肽，使底物中非蛋白物質(zhì)進行轉(zhuǎn)化形成菌體蛋白，進而增加了蛋白質(zhì)的含量[23]。本試驗中，不同菌種通過固態(tài)發(fā)酵棉籽粕后會使棉籽中的粗脂肪含量顯著提高，Sun 等[24]研究中發(fā)現(xiàn)，固態(tài)發(fā)酵棉籽粕后，粗脂肪含量顯著下降，與本試驗結(jié)果不同，這可能與發(fā)酵所使用的微生物是否利用脂肪來支持菌體的生長有關(guān)[25]，有待進一步探究。此外，本試驗中，發(fā)酵后的棉籽粕中性洗滌纖維含量顯著降低，可能與微生物分泌的酶對纖維結(jié)構(gòu)造成破壞有關(guān)，這也是發(fā)酵后纖維物質(zhì)含量降低的重要原因之一[26]。

蛋白酶是指可以水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶，能提高蛋白質(zhì)的利用率。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，具有提高纖維素利用率的作用。木聚糖酶是半纖維素酶的一種，其含量的高低是反映半纖維素利用率的主要指標。淀粉酶則是水解淀粉和糖原的酶類總稱。本試驗通過對不同菌種發(fā)酵后的棉籽粕進行酶活性測定發(fā)現(xiàn)，酵母菌、紅曲霉菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌和地衣芽孢桿菌均具有提高酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及中性木聚糖酶活性的作用，而對堿性木聚糖酶、酸性木聚糖酶、半纖維素酶和淀粉酶的活性沒有顯著影響。

4 結(jié)論

綜上，本試驗所選用的9株菌種通過固體發(fā)酵均可使棉籽粕游離棉酚的含量降低，改善棉籽粕粗蛋白、粗纖維和中性洗滌纖維的含量，提高酸性蛋白酶、中性蛋白酶和中性木聚糖酶的活性。通過對發(fā)酵后棉籽粕氣味、營養(yǎng)價值和酶活性等綜合指標進行對比，3個酵母處理組的效果最好，酵母菌1號使棉籽粕中游離棉酚的含量降低75.39%，作用效果最顯著。因此，可以考慮選用酵母菌對棉籽粕進行固體發(fā)酵，以達到脫毒和改善營養(yǎng)價值的效果。未來，也可在此基礎(chǔ)上進一步使用混合菌種或混合底物進行固態(tài)發(fā)酵，以最大程度地發(fā)揮微生物的脫毒作用。