李 靜,申風(fēng)俊

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科，太原 030001；*通訊作者,E-mail:919016603@qq.com)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是一個細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的病理性過程，目前已知，氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)和腎素-血管緊張素系統(tǒng)在肝纖維化的進(jìn)展過程中都發(fā)揮了重要的作用，且兩者相互作用。氧化系統(tǒng)及抗氧化系統(tǒng)的平衡在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持中起著重要作用。肝臟的內(nèi)環(huán)境在氧化代謝產(chǎn)物活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的生成與消除中維持著動態(tài)平衡，各種病因?qū)е碌母卫w維化均有氧化應(yīng)激的參與。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)是機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)的一個多蛋白復(fù)合體，是目前已知唯一的專職產(chǎn)生ROS的酶類[1]。當(dāng)機(jī)體受到氧化性刺激因素作用時，NOX4能夠促進(jìn)ROS產(chǎn)生，介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。有研究表明，在肝臟組織和被血清培養(yǎng)激活的原代造血干細(xì)胞中，NOX4 mRNA明顯增多，而在缺乏NOX4的造血干細(xì)胞中，ROS生成則被減弱[2]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)作用于各種酶轉(zhuǎn)錄因子，在抑制肝臟炎癥的發(fā)展中起著重要作用。對小鼠的功能性分析表明，Nrf2通過改善纖維生成對慢性肝病的起始和進(jìn)展起保護(hù)作用。人肝組織免疫組化分析顯示，慢性肝病患者肝組織中氧化應(yīng)激水平升高，Nrf2表達(dá)增加[3]。局部腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)的經(jīng)典RAS途徑中，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是核心效應(yīng)分子，它是一種重要的炎癥促進(jìn)因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成以及細(xì)胞增殖，促進(jìn)纖維化的形成。腎素血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)在長期治療高血壓的過程中，可抑制心肌重塑，能夠用來治療心力衰竭，因此認(rèn)為ACEI有抗纖維化的作用。許瑩瑩等[4]通過觀察發(fā)現(xiàn)，ACEI類藥物貝那普利能夠升高Nrf2 mRNA、降低NOX4 mRNA水平，顯著改善肝纖維化的程度。但對于貝那普利是否能夠影響NOX4及Nrf2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，進(jìn)而影響肝纖維化的發(fā)生發(fā)展鮮有研究。本實(shí)驗(yàn)建立四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型，用免疫組化的方法研究貝那普利是否可以通過影響NOX4和Nrf2的表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)肝纖維化的進(jìn)程，并探討血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑抗肝纖維化的機(jī)制，為臨床防治肝纖維化尋找新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級健康雄性SD大鼠購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；四氯化碳購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；貝那普利由北京諾華制藥有限公司提供；NOX4和Nrf2抗體試劑盒和多聚體抗兔IgG-HRP試劑盒購于太原市正和生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒、二甲苯、乙醇等由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將22只清潔級健康雄性SD大鼠(180～210 g)隨機(jī)分為3組：對照組6只，模型組8只，治療組8只。模型組及治療組予40%四氯化碳皮下注射，初始劑量為5 ml/kg，之后劑量為2 ml/kg，2次/周，共8周；對照組予等劑量油劑皮下注射，2次/周，共8周。在造模同時，治療組予貝那普利灌胃，劑量為10 mg/(kg·d)，對照組和模型組予等劑量生理鹽水灌胃，共8周。三組大鼠均給予正常飲食，在結(jié)束給藥當(dāng)天(即實(shí)驗(yàn)第56天)分別隨機(jī)處死各組大鼠6只，留取相同部位肝組織待用。貝那普利劑量選定：既往學(xué)者在研究ACEI類藥物貝那普利對心臟和腎臟影響的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)貝那普利10 mg/(kg·d)可有效降低膠原表達(dá)，改善動脈血管重塑[5-7]，因此，我們也采用此實(shí)驗(yàn)劑量研究了貝那普利對肝臟纖維化的影響。

1.3 標(biāo)本獲取及處理

各組大鼠處死前禁食12 h，嚴(yán)格遵循無菌原則，用25%烏拉坦(4 ml/kg)麻醉，無菌手術(shù)刀打開腹腔(同時觀察有無腹水和腹水量，做好記錄)，觀察并記錄肝臟大體特征(形態(tài)、顏色、大小、質(zhì)地等)，留取相同部位肝組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后固定、脫水、透明、包埋，切片行HE及Masson染色。免疫組化法測定肝組織中NOX4和Nrf2水平：400倍光鏡下隨機(jī)選擇3個視野，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，計(jì)算NOX4和Nrf2陽性蛋白的平均光密度值。平均光密度值越高，說明陽性蛋白表達(dá)量越多。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)表現(xiàn)

肉眼觀察：對照組大鼠肝臟體積正常，紅褐色，質(zhì)軟，表面和邊緣光滑，組織彈性好。與對照組相比，模型組大鼠肝臟體積減小，呈土黃色，質(zhì)較硬，表面可觸及顆粒樣改變。治療組大鼠肝臟體積介于對照組和模型組之間，略呈土黃色，質(zhì)較韌，表面顆粒樣改變較模型組輕。

病理組織學(xué)：對照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完好。與對照組相比，模型組可見明顯變性、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，有假小葉形成，大量炎性細(xì)胞浸潤。與模型組相比，治療組肝組織變性、壞死減輕，纖維條索較模型組窄(見圖1)。

圖1 三組大鼠第8周肝組織HE染色和Masson染色病理結(jié)果 (×40)Figure 1 Pathological changes of liver tissue by HE staining and Masson staining at the 8th week in the three groups (×40)

2.2 各組肝組織中NOX4和Nrf2陽性蛋白的表達(dá)

NOX4陽性蛋白和Nrf2陽性蛋白顯色均為棕黃色，NOX4陽性蛋白定位于肝細(xì)胞胞漿、纖維間隔及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞；Nrf2陽性蛋白顯色主要定位于肝細(xì)胞胞漿(見圖2)。光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察，可見對照組無明顯NOX4和Nrf2陽性蛋白。與對照組相比，模型組肝組織中NOX4和Nrf2陽性蛋白的平均光密度值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，治療組肝組織NOX4陽性蛋白平均光密度值降低，Nrf2陽性蛋白平均光密度值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

圖2 三組大鼠第8周肝組織NOX4和Nrf2陽性蛋白蘇木精染色結(jié)果 (×400)Figure 2 NOX4 and Nrf2 positive proteins in liver tissues at the 8th week in the three groups by HE staining (×400)

表1 各組大鼠肝組織NOX4和Nrf2陽性蛋白的平均光密度值比較Table 1 Comparison of mean optical density values of NOX4 and Nrf2 positive proteins in liver tissues of rats in each

3 討論

肝纖維化是包括病毒、酒精、免疫等多種致病因素導(dǎo)致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理性過程，以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過多沉積為特征。氧化應(yīng)激指機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，偏向于氧化，導(dǎo)致以中性粒細(xì)胞為代表的炎癥細(xì)胞浸潤，大量的氧化產(chǎn)物堆積并損傷機(jī)體。越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激機(jī)制參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[8-11]?；钚匝醮豏OS是氧化損傷過程中產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)生和清除能力的不平衡導(dǎo)致了氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。生理?xiàng)l件下，ROS在機(jī)體內(nèi)少量存在，發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抵御有害微生物的作用[12]。病理?xiàng)l件下，即發(fā)生氧化因素?fù)p傷時，機(jī)體產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，損傷機(jī)體微環(huán)境[13]。ROS作為氧化敏感蛋白，可以激活氧化和抗氧化系統(tǒng)的分子表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)肝纖維化[8]。血管緊張素Ⅱ作為RAS系統(tǒng)的核心促纖維化因子，可以通過多條信號通路介導(dǎo)ROS產(chǎn)生，參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)是機(jī)體內(nèi)氧化系統(tǒng)的一個多蛋白復(fù)合體，是目前已知的唯一一種專職產(chǎn)生ROS的酶類[1]，NOX4是其中一種,其在肝枯否細(xì)胞(Kupffer cells，KCs)和肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)中高度表達(dá)。當(dāng)機(jī)體受到氧化刺激損傷時，NOX4的調(diào)節(jié)亞基發(fā)生磷酸化，易位至細(xì)胞膜，激活下游氧化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使ROS的產(chǎn)生，介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。

在肝硬化患者的血清中，NOX4蛋白表達(dá)水平升高，但在敲除了NOX4基因的肝纖維化小鼠模型中，肝臟的炎癥程度、氧化應(yīng)激水平及肝纖維化的程度均有明顯下降[2]。在小鼠原代肝細(xì)胞和一種人肝細(xì)胞系中，血管緊張素Ⅱ的活化增加了NOX4蛋白的表達(dá)量以及由H2O2活化介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，模型組大鼠肝細(xì)胞中NOX4平均光密度值升高，給予貝那普利治療后，NOX4平均光密度值降低，因此我們猜測貝那普利可以通過抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換為血管緊張素Ⅱ，抑制NOX4的活化，減少ROS的產(chǎn)生，減輕肝纖維化。

核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)是抗氧化反應(yīng)元件(ARE)介導(dǎo)的基因表達(dá)的中心調(diào)控因子[15]，由紅細(xì)胞衍生核因子2樣蛋白2(NFE2L2)編碼，屬于堿性亮氨酸轉(zhuǎn)錄因子家族。Nrf2可以調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，編碼抗氧化酶、解讀因子、抗凋亡蛋白和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體[16]。生理狀態(tài)下，大部分Nrf2與細(xì)胞質(zhì)錨連分子Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(KEAP1)結(jié)合而被蛋白酶降解，只有少部分用于維持還原型谷胱甘肽(GSH)的基礎(chǔ)表達(dá)。Nrf2在所有類型的細(xì)胞中均有表達(dá)，正常情況下，其基礎(chǔ)蛋白水平通常較低，這主要是由于KEAP1介導(dǎo)的蛋白酶體降解作用[17]。氧化應(yīng)激條件下，Nrf2 基因被激活，與磷酸化的KEAP1解離，激活下游的抗氧化基因。Nrf2可以調(diào)節(jié)GSH的氧化還原狀態(tài)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，Nrf2的基因或藥理激活可以抑制急性炎癥性肝損傷[18]。Nrf2可以直接抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生或抑制NF-κB的活性來抑制炎癥[19]。另有研究表明，經(jīng)基因或藥理激活的Nrf2可以保護(hù)肝臟免受多種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷[20，21]。對人類肝臟切片的免疫組化分析顯示慢性肝臟病患者Nrf2高表達(dá)[22]。因此人們認(rèn)為Nrf2可以發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，使機(jī)體保持氧化還原穩(wěn)態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，肝纖維化模型組Nrf2在細(xì)胞漿中的平均光密度值較對照組升高，治療組較模型組進(jìn)一步升高。因此我們推測，貝那普利可以通過升高Nrf2表達(dá)量來抑制氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，氧化應(yīng)激條件下，NOX4和Nrf2均參與了肝纖維化的過程，我們推測，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑貝那普利可以抑制NOX4的產(chǎn)生和促進(jìn)Nrf2的產(chǎn)生，發(fā)揮抑制肝纖維化的作用，但其長期效用仍有待繼續(xù)研究。