與牙髓干細(xì)胞相關(guān)的骨組織工程研究進(jìn)展

魏代?！∥很叭铩≮w戩

【摘要】 牙髓干細(xì)胞來(lái)自成人或兒童的牙髓組織，非常容易獲得，且具有良好的增殖分化能力，被認(rèn)為是在組織再生領(lǐng)域最有應(yīng)用潛力的干細(xì)胞之一。牙髓干細(xì)胞在骨組織工程領(lǐng)域的研究由來(lái)已久，本文就牙髓干細(xì)胞的成骨分化潛能、相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)、炎癥牙髓干細(xì)胞和同種異體牙髓干細(xì)胞幾個(gè)方面的研究進(jìn)展作綜述。

【關(guān)鍵詞】 牙髓干細(xì)胞 組織工程 成骨分化 骨再生

Advances of Bone Tissue Engineering Related to Dental Pulp Stem Cells/WEI Daifu， WEI Xinrui， ZHAO Jian. //Medical Innovation of China， 2022， 19（14）： -175

[Abstract] With excellent multilineage differentiation potential and high proliferation rate， dental pulp stem cells are considered as one of the most promising stem cells in the field of tissue engineering， which can be easily obtained from dental pulp tissues of adults and children. Potential applications of dental pulp stem cells in bone tissue engineering have been studied for a long time， and this article mainly discusses it’s osteogenic differentiation potential， relevant animal experiments and clinical trials， as well as allogenic pulp stem cells and stem cells derived from inflammatory dental pulp tissues.

[Key words] Dental pulp stem cells Tissue engineering Osteogenic differentiation Bone regeneration

First-author’s address： School and Hospital of Stomatology， Laborartory of Periodontics， China Medical University， Shenyang 110002， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.14.042

組織工程是基于細(xì)胞或蛋白質(zhì)與生物材料相結(jié)合來(lái)生成新組織的多學(xué)科領(lǐng)域，其中，骨組織再生一直以來(lái)都是學(xué)者努力探索的方向。成體干細(xì)胞是在成體組織或器官中發(fā)現(xiàn)的未分化細(xì)胞，可以自我更新，并能夠分化成多種細(xì)胞系的細(xì)胞。從各個(gè)組織中分離出的干細(xì)胞具有不同的生物特性以及不同的成骨分化能力，其中骨髓來(lái)源的干細(xì)胞是被研究最多的一種，而來(lái)源于牙髓的干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）也因?yàn)槠鋬?yōu)秀的成骨分化潛能和易獲得性受到廣泛研究，來(lái)自脫落乳牙牙髓的干細(xì)胞（stem cells from exfoliated deciduous teeth，SHED）同樣具有多向分化的能力。有研究表明，在生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子和受體分子的調(diào)控下，DPSCs可以分化成成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞等[1]。

1 牙髓干細(xì)胞的成骨分化能力

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）促進(jìn)骨再生主要與其成骨分化能力有關(guān)。造血干細(xì)胞和MSCs產(chǎn)生引起骨吸收的破骨細(xì)胞和介導(dǎo)骨形成的成骨細(xì)胞，對(duì)于骨組織的重建至關(guān)重要。骨組織內(nèi)的MSCs在未受到組織損傷和骨改建重塑的信號(hào)刺激時(shí)，一般都是處于相對(duì)靜止的狀態(tài)，而在受到一些成骨相關(guān)刺激因子（如骨成型蛋白）刺激后，可立即分化成成骨細(xì)胞。牙髓干細(xì)胞的成骨分化潛能已經(jīng)被文獻(xiàn)證實(shí)，地塞米松、L-抗壞血酸和β-甘油磷酸補(bǔ)充劑可以廣泛誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化。為了進(jìn)一步證實(shí)其成骨分化能力，骨特異性蛋白如堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白、Osterix和矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）的表達(dá)也已被證實(shí)[2]。

許多基因和生長(zhǎng)因子都可以調(diào)節(jié)牙髓干細(xì)胞成骨分化。除了Runx2等早已認(rèn)為是MSCs成骨分化中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子外，近些年研究發(fā)現(xiàn)，HOX轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育過(guò)程中能夠調(diào)節(jié)骨骼模式，并在成人骨組織中表達(dá)，HOX基因在成人骨組織再生和骨折愈合過(guò)程中起到重要作用[3]。微核糖核酸（MicroRNAs）可以通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/骨成型蛋白和Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)成骨分化基因表達(dá)[4]。Jaukovi?等[5]探究白細(xì)胞介素-17和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)DPSCs和SHED的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，前者對(duì)DPSCs和SHED的早期成骨分化起促進(jìn)作用，然而后者則起到了較為強(qiáng)烈的抑制作用。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)LncRNA LEF1-AS1的表達(dá)與DPSCs的成骨分化有關(guān)，并且其過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)成骨分化，可與mi-R-24-3p協(xié)同作用來(lái)調(diào)節(jié)骨再生進(jìn)程[6]。

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

近些年來(lái)，有關(guān)牙髓干細(xì)胞成骨的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究有許多報(bào)道，主要可以歸納到以下幾個(gè)方面。

2.1 DPSCs促進(jìn)骨再生的有效性 近些年，學(xué)者們開(kāi)展了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探究牙髓干細(xì)胞的體內(nèi)成骨分化能力，包括DPSCs/SHED與羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）或β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）等支架材料植入免疫缺陷動(dòng)物的脛骨、顱骨、頜骨以及皮下等處的研究[1]。有許多實(shí)驗(yàn)比較了單獨(dú)應(yīng)用支架材料和聯(lián)合應(yīng)用支架材料及DPSCs/SHED對(duì)骨缺損區(qū)治療效果的差異[7-11]，大多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都顯示了人類牙髓干細(xì)胞優(yōu)秀的成骨能力，與支架復(fù)合可以產(chǎn)生比單獨(dú)使用支架材料更大的骨增量。也有少數(shù)實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞明顯的體內(nèi)成骨優(yōu)勢(shì)，如Annibali等[7]將β-TCP單獨(dú)植入和聯(lián)合DPSCs植入小鼠顱骨缺損區(qū)，12周后通過(guò)Micro-CT和正電子成像術(shù)比較分析新生骨密度差異，發(fā)現(xiàn)二者無(wú)明顯差異，推測(cè)可能是DPSCs發(fā)揮成骨分化作用的最佳條件未滿足。

2.2 DPSCs促進(jìn)骨再生的機(jī)制探索 為了闡明MSCs植入體內(nèi)后是直接通過(guò)成骨分化參與骨再生進(jìn)程還是通過(guò)旁分泌效應(yīng)間接促進(jìn)骨再生，Collignon等[12]將熒光標(biāo)記的小鼠牙髓干細(xì)胞載入膠原，并植入到小鼠顱頂缺損處。通過(guò)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)DPSCs在移植后3個(gè)月出現(xiàn)在愈合的缺損中，并且它們?cè)谲浌羌?xì)胞樣細(xì)胞中迅速分化，表達(dá)所有預(yù)期的特征標(biāo)記。表明植入的DPSCs能夠在缺損區(qū)微環(huán)境中存活，并通過(guò)類似軟骨內(nèi)骨化過(guò)程直接參與修復(fù)，但不排除DPSCs旁分泌作用的影響。DPSCs在治療骨質(zhì)疏松癥方面的研究也有了新的進(jìn)展，Kong等[13]將肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）基因和熒光素酶基因修飾的DPSCs導(dǎo)入去卵巢的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)DPSCs可以存活1個(gè)月以上，大多數(shù)的DPSCs都分布在肺和肝臟，僅有少部分存于骨骼。DPSCs或DPSCs-HGF移植可明顯減少去卵巢所致的股骨遠(yuǎn)端干骺端松質(zhì)骨丟失，且DPSCs-HGF具有更強(qiáng)的緩解骨丟失的能力。提示DPSCs-HGF系統(tǒng)灌注治療去卵巢所致骨丟失是一種潛在的治療方法，其猜測(cè)這可能與旁分泌機(jī)制有關(guān)。

2.3 含DPSCs注射式凝膠及DPSCs膜片技術(shù) 除了目前常用的支架材料，如羥基磷灰石、β-磷酸三鈣、膠原海綿等，注射凝膠和無(wú)支架的DPSCs膜片技術(shù)也受到學(xué)者們的關(guān)注。Hu等[14]比較了在豬牙周炎骨缺損模型中直接注射DPSCs和植入DPSCs膜片兩種方法促進(jìn)骨再生效果的差異，術(shù)后12周檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩種方法均能有效促進(jìn)骨再生，而膜片植入組的新生骨量明顯大于注射組。為探究載有MSCs的水凝膠在體內(nèi)成骨的能力，Jang等[15]將混入DPSCs的共聚物溶液注射進(jìn)小鼠的背部皮下，溶液在體內(nèi)立即形成水凝膠。6周后取出水凝膠，經(jīng)Micro-CT掃描、基因表達(dá)檢測(cè)和組織學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)DPSCs在體內(nèi)的水凝膠中的分化為成骨細(xì)胞，提示了這種方法或許可以作為一種侵入性小的骨組織再生手段。此外Xia等[16]也探究了一種可注射型支架上DPSCs的增殖、成骨分化以及骨基質(zhì)礦化形成的能力，發(fā)現(xiàn)在復(fù)合了納米氧化鐵的磷酸鈣水門汀支架上DPSCs的堿性磷酸酶活性和成骨基因表達(dá)比在單獨(dú)的磷酸鈣水門汀支架要高出2～3倍。并且納米氧化鐵還能提升干細(xì)胞附著條件，具有良好的應(yīng)用前景。有些學(xué)者還研究了無(wú)支架的DPSCs膜片移植技術(shù)，F(xiàn)ujii等[17]將用某種向日葵黃質(zhì)衍生物（helioxanthin derivative，HD）處理過(guò)的DPSCs膜片移植到小鼠顱骨缺損區(qū)，8周后影像學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)移植區(qū)有明顯的骨再生，并且再生量要比DPSCs的骨成型蛋白處理組要多。該研究團(tuán)隊(duì)后來(lái)又將標(biāo)記有PKH26的向日葵黃質(zhì)衍生物處理的DPSCs膜片移植到小鼠脛骨骨折中，14 d后取出骨折部位的骨組織進(jìn)行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)DPSCs膜片定植于骨折區(qū)域，并促進(jìn)骨形成，表示無(wú)支架DPSCs膜片技術(shù)可作為DPSCs應(yīng)用于骨再生的一種選擇[18]。

2.4 DPSCs胞外囊泡的成骨能力 MSCs來(lái)源的胞外囊泡具有組織修復(fù)和抗炎的特性，Imanishi等[19]探究了DPSCs的胞外囊泡在骨再生中發(fā)揮的作用，提取了DPSCs的胞外囊泡并將之與膠原結(jié)合注入小鼠顱骨缺損區(qū)，設(shè)對(duì)照組為載有DPSCs的膠原組，4周后取出植入?yún)^(qū)的骨塊發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組產(chǎn)生的骨量相似，提示DPSCs的胞外囊泡或許也可以作為骨組織再生的一種有效的手段。

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了牙髓干細(xì)胞體內(nèi)促進(jìn)骨再生的良好應(yīng)用前景，并且牙髓干細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用方式也受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，但是要構(gòu)建最佳的DPSCs成骨分化微環(huán)境以最大化發(fā)揮其促進(jìn)骨再生能力則還需要進(jìn)一步的研究[20]。

3 臨床試驗(yàn)

除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之外，近些年也有部分DPSCs成骨研究的臨床試驗(yàn)的報(bào)道，大多數(shù)試驗(yàn)都是探索DPSCs在人體各部位應(yīng)用的有效性。Barbier等[21]將從患者第三磨牙中提取出的DPSCs與膠原混合植入拔牙窩，6個(gè)月后發(fā)現(xiàn)加DPSCs的植入組在新生骨密度和根尖骨隔的高度變化上與單獨(dú)植入膠原組無(wú)明顯差異，這與當(dāng)初部分學(xué)者的類似試驗(yàn)得出的結(jié)果相反[22]。最近也有學(xué)者將DPSCs和膠原海綿植入牙周炎的骨缺損區(qū)，經(jīng)過(guò)6個(gè)月和12個(gè)月的復(fù)查，發(fā)現(xiàn)與僅植入海綿組相比，實(shí)驗(yàn)組有著更大程度的骨再生，并且探診深度和附著水平獲得更顯著的改善[23]。此外，還有學(xué)者將牙髓干細(xì)胞和HA-膠原海綿支架植入腭裂患者的牙槽骨裂區(qū)，用于關(guān)閉裂隙，試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組一（骨成型蛋白-2處理組）和組二（髂骨移植組）。結(jié)果表明，6個(gè)月后DPSCs組和組二新生骨量相似，明顯高于組一。此外，關(guān)于術(shù)后并發(fā)癥，組一術(shù)后腫脹發(fā)生率為37.5%，組二供區(qū)疼痛發(fā)生率為87.5%，而DPSCs組未發(fā)現(xiàn)并發(fā)癥[24]。Hernández等[25]選取了22例帕金森病老年患者，將其分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，將載有DPSCs的膠原植入實(shí)驗(yàn)組牙周骨缺損區(qū)域，而對(duì)照物則無(wú)DPSCs植入，并在術(shù)前和術(shù)后6個(gè)月采集受試者唾液標(biāo)本，測(cè)定抗氧化劑、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化脂質(zhì)和白細(xì)胞介素的總濃度。6個(gè)月后，影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的植入?yún)^(qū)骨密度要高于對(duì)照組，并且與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組超氧化物歧化酶水平顯著更高而IL-1β水平則較低，其推測(cè)DPSCs改善受試者骨密度可能與升高超氧化物歧化酶和降低IL-1β水平有關(guān)。

雖然絕大多數(shù)臨床試驗(yàn)表明DPSCs在人體內(nèi)許多部位均能發(fā)揮良好的效果，但目前與DPSCs成骨相關(guān)的臨床試驗(yàn)仍然較少，牙髓干細(xì)胞治療的應(yīng)用方向和具體的應(yīng)用方式方法的確立還需要未來(lái)更多的臨床試驗(yàn)來(lái)奠定基礎(chǔ)。

4 炎癥牙髓干細(xì)胞及同種異體牙髓干細(xì)胞

一些學(xué)者還探究了來(lái)源于炎癥牙髓的DPSCs成骨特性。Li等[26]提取了2例牙髓炎患者的牙髓干細(xì)胞并將其與β-TCP混合植入患者牙周骨缺損處，9個(gè)月后植骨區(qū)域顯示良好的骨再生，其將炎癥牙髓的牙髓干細(xì)胞和正常的牙髓干細(xì)胞比較發(fā)現(xiàn)，雖然細(xì)胞原代培養(yǎng)成功率和生長(zhǎng)狀態(tài)受到一定程度影響，但炎癥牙髓干細(xì)胞仍表達(dá)了健康牙髓來(lái)源干細(xì)胞的標(biāo)志物，并保持了其多向分化能力。Xue等[27]用辛伐他汀處理炎癥牙髓干細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)低劑量的辛伐他汀可以促進(jìn)炎癥牙髓干細(xì)胞的增殖能力，并降低其炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮因子的生成。Li等[28]比較了單獨(dú)使用β-TCP、聯(lián)用β-TCP和豬炎癥牙髓干細(xì)胞以及聯(lián)用β-TCP和豬正常的牙髓干細(xì)胞對(duì)豬牙周骨缺損的影響，影像學(xué)顯示，牙髓干細(xì)胞組骨組織增量更顯著。并且正常的牙髓干細(xì)胞的成骨效果要強(qiáng)于炎癥牙髓干細(xì)胞，有著更強(qiáng)的骨保護(hù)素表達(dá)。對(duì)于這類牙髓干細(xì)胞的評(píng)價(jià)，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其具備某些情況下替代正常DPSCs的潛力，但仍需要進(jìn)一步研究來(lái)明確其特性。

由于牙髓干細(xì)胞免疫原性較低，且有著良好的免疫調(diào)節(jié)作用，有學(xué)者采用異體的未經(jīng)人類白細(xì)胞抗原配型的SHED聯(lián)合海綿支架植入拔牙窩的報(bào)道，6個(gè)月后臨床檢查和影像學(xué)顯示骨再生良好，且未出現(xiàn)安全方面問(wèn)題[29]。除了牙髓來(lái)源的干細(xì)胞外，還有許多其他來(lái)源的同種異體間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞移植臨床試驗(yàn)，絕大多數(shù)都未出現(xiàn)不良反應(yīng)，然而異體MSCs的臨床應(yīng)用依然存在很多倫理和安全方面的問(wèn)題，還有待進(jìn)一步的探究。

5 展望

牙髓干細(xì)胞近些年來(lái)受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，大量實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了其組織再生能力，但是MSCs移植的生物安全性（遺傳不穩(wěn)定性、致瘤性等）及其發(fā)生機(jī)制還值得進(jìn)一步探索。臨床試驗(yàn)和治療應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照干細(xì)胞應(yīng)用相關(guān)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，最大化降低干細(xì)胞應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)。目前有關(guān)牙髓干細(xì)胞促進(jìn)骨再生的研究中，體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)較多，但臨床試驗(yàn)較少，未來(lái)需要更多的臨床試驗(yàn)來(lái)證明其臨床應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。此外，目前的研究對(duì)于牙髓干細(xì)胞的加工方法、移植方法（包括支架選擇和細(xì)胞移植數(shù)量）以及細(xì)胞移植安全性評(píng)判尚缺乏同一的標(biāo)準(zhǔn)，需要制訂一套應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)來(lái)最大化提升其療效和應(yīng)用安全性。

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（收稿日期：2021-09-23） （本文編輯：占匯娟）