NO 誘導(dǎo)IAA 和O2·-積累于側(cè)根尖端促進(jìn)水稻側(cè)根生長(zhǎng)

朱雄梅，蔡慧楠，劉瑞琪，林佩錦，郞雙怡，黃悅， 鄧舒琪，莫億偉*，金晨鐘*

（1. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 婁底 417000；2. 紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000）

植物根系主要由兩部分組成，一種起源于胚根的初生根，另一種在主根上形成側(cè)根及生長(zhǎng)于成熟組織的不定根。側(cè)根和根毛的形成均受到多種植物激素調(diào)控[1-2]，特別是生長(zhǎng)素（IAA）在側(cè)根的起始分化和形成中起著關(guān)鍵作用[3]，而根系的IAA 源于地上部分向根部運(yùn)輸，當(dāng)IAA 向根部運(yùn)輸增多時(shí)則利于更多側(cè)根形成[4]；當(dāng)IAA 極性運(yùn)輸受阻，側(cè)根的數(shù)量則顯著下降[5]。一氧化氮（Nitric oxide，NO）在參與植物逆境調(diào)節(jié)和側(cè)根發(fā)育中均起著重要作用，植物體內(nèi)的NO 合成有兩種途徑，一種是依賴亞硝酸還原途徑依靠硝酸還原酶1(NIA1) 和硝酸還原酶2(NIA2)，另一種是依靠L-精氨酸的氧化途 徑[6-7]。有研究表明，提供外源NO 供體硝普鈉（Sodium nitroprusside，SNP）時(shí)，可使番茄側(cè)根原基及側(cè)根數(shù)量顯著增多[8]；當(dāng)受NO 合成酶（NOS）抑制劑（N’-硝基-L-精氨酸甲酯鹽酸鹽，L-NAME）處理時(shí)，根系NO 含量顯著降低并抑制側(cè)根形成[9]?；贗AA 和NO 在側(cè)根形成過程中均起到重要的調(diào)控作用，但這兩種信號(hào)物質(zhì)相互調(diào)節(jié)機(jī)制尚未弄清，有的研究認(rèn)為NO 是IAA 的上游信號(hào)物質(zhì)，因?yàn)樵跀M南芥葉片發(fā)育中發(fā)現(xiàn)，NO 可調(diào)控IAA 極性運(yùn)輸輸出載體PIN1 蛋白積累于葉原基處，從而促進(jìn)葉片形成[10-11]；有的研究則認(rèn)為NO 是IAA 的下游信號(hào)物質(zhì)，因?yàn)橛肗OS 抑制劑L-NAME 或NO 清除劑（2-（4-羧基苯基）-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物鉀鹽，cPTIO）處理后可抑制IBA 對(duì)側(cè)根的誘導(dǎo)，且NAA 可通過誘導(dǎo)NO 的合成促進(jìn)番茄側(cè)根發(fā)育[12]。此外，活性氧（Reactive oxygen species, ROS）作為一種信號(hào)分子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和激素信號(hào)調(diào)控中起著重要作用，如ROS 增多也可促進(jìn)側(cè)根及根毛形成[13-14]。由此說明，IAA、NO和O2·-在調(diào)控側(cè)根形成過程中均有著重要作用，但前人的相關(guān)研究結(jié)果主要來源于雙子葉模式植物擬南芥等，在水稻等主要農(nóng)作物則研究較少。前人為了更直觀地探討IAA 定位和功能的關(guān)系，有研究發(fā)現(xiàn)，DR5 比天然的IAA 反應(yīng)元件（AuxREs）具有更強(qiáng)的IAA 反應(yīng)能力，表達(dá)活性可增加5～10 倍[15]， 以DR5 為啟動(dòng)子與報(bào)告基因重組，構(gòu)建成IAA 響應(yīng)報(bào)告基因DR5::GUS，轉(zhuǎn)入植物體獲得轉(zhuǎn)基因植株，已成為研究IAA 的定位及其作用的良好工具[16]，利用DR5::GUS 報(bào)告基因研究IAA 的分布已在擬南芥[11]、水稻[17]和棉花[18-19]等多種植物得到應(yīng)用。水稻是重要的糧食作物，側(cè)根形成的水平直接影響水稻植株對(duì)養(yǎng)分的吸收能力，本研究以DR5-GUS標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻為材料，深入探討IAA、NO 和O2·-對(duì)水稻側(cè)根形成的影響，以期提高水稻根系的養(yǎng)分利用效率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和處理

DR5::GUS 標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻（Oryza sativa L.）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)王學(xué)路教授饋贈(zèng)，SNP、NO 合成酶抑制劑（L-NAME）、2-（4-羧基苯基）-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物鉀鹽（cPTIO）、NO 熒 光 探 針（5,6-Diaminofluorescein diacetat，DAF-2DA）、IAA 檢測(cè)的DR5::GUS 報(bào)告基因染色液均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。水稻種子浸種和催芽后，選擇種子根長(zhǎng)約為0.5 cm 生長(zhǎng)一致的幼苗，置于含兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入1/50 MS 微量元素培養(yǎng)溶液（以防單鹽毒害），保持根系置于培養(yǎng)液中進(jìn)行相應(yīng)的處理。

1.2 NO 供體及清除劑對(duì)水稻種子根根系生長(zhǎng)的影響

為研究NO 供體及NO 清除劑對(duì)水稻種子根根系生長(zhǎng)的影響，設(shè)計(jì)了如下三組試驗(yàn)。1）為了探討外源NO 供體對(duì)側(cè)根形成的影響，設(shè)計(jì)在1/50 MS 微量元素培養(yǎng)溶液中分別加入0（對(duì)照）、5、10、15、20 和25 μmol/L SNP 的處理。2）為了探討NO 合成酶抑制劑對(duì)側(cè)根形成的影響，設(shè)計(jì)在1/50 MS 微量元素培養(yǎng)溶液中分別加0（對(duì)照）、50、100、200、400、800 μmol/L NO 合成酶抑制劑的處理。3）為了探討NO 清除劑對(duì)側(cè)根形成的影響，設(shè)計(jì)在1/50 MS 微量元素培養(yǎng)溶液中分別加0（對(duì)照）、50、100、200、400、800 μmol/L cPTIO 的處理。

所有處理組均置于光照培養(yǎng)箱中，每個(gè)處理設(shè)置4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)皿放置8 粒種子。光照培養(yǎng)箱的溫度設(shè)置為28 ℃，光照強(qiáng)度為 500 μmol/(m2·s)，每天13 h 光照，11 h 黑暗，相對(duì)濕度為85%。每天補(bǔ)充相應(yīng)溶液，在處理的第3 d和第5 d，分別測(cè)量初生根、側(cè)根、冠根的長(zhǎng)度及數(shù)量。

1.3 NO、IAA 和O2·-在側(cè)根起始部位的定位觀察

1.3.1 NO 染色 經(jīng)上述處理后，第3 d 剪取開始出現(xiàn)側(cè)根生長(zhǎng)的初生根，參考Sánchez-Vicente 等[10]的方法，用100 mmol/L pH7.2 的磷酸鈉緩沖液配制成10 μM DAF-2DA 溶液，在25 ℃黑暗條件下對(duì)根系染色30 min，再用ddH2O 浸泡3 次，每次5 min，以洗掉材料表面的染料，置于顯微鏡下觀察并照相。

1.3.2 GUS 染色 參考胥華偉[20]等用GUS 染色法確定IAA 在側(cè)根的定位，具體方法為根系材料用GUS 染色液(100 mmol/L pH7.2 磷酸鈉緩沖液、0.5 mmol/L 高鐵氰化鉀、0.5 mmol/L 亞鐵氰化鉀、1.0 mmol/L X-gluc 和2.0% DMSO)在37 ℃染色2 h 后，經(jīng)ddH2O 浸泡3 次，每次5 min，以洗掉材料表面的染料，置于顯微鏡下觀察并照相。

1.3.3 NBT 染色 將根系材料置于NBT 染液中(100 mmol/L pH7.2 磷酸鈉緩沖液，NBT 濃度為0.1mg/mL)， 室溫染色1.5 h，倒掉染色液，再用ddH2O 浸泡3次，每次5 min，以洗掉材料表面的染料后，置于顯微鏡下觀察并照相。根據(jù)染色的程度判斷各處理對(duì)NO、IAA 和O2·-在側(cè)根起始部位分布的影響。

1.4 SNP 和NO 合成酶抑制劑處理對(duì)NO 形成相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測(cè)

取上述不同SNP 及NO 合成酶抑制劑處理3 d的幼苗初生根（基部1.5 cm 內(nèi)能形成側(cè)根的部分），通過Takara RNA 提取試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。參考Zhou 等[21]方法，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析與NO 合成相關(guān)的硝酸還原酶1（OsNIA1）和硝酸還原酶2（OsNIA1）表達(dá)情況，以水稻Actin1 作為內(nèi)參基因OsActin1 (LOC_Os03g50890)，具體引物設(shè)計(jì)如下：OsNIA1 引物為：F：5′-CCAATTCTTTCATCGTGTTCT-3′，R：5′-CATG CAGCATTTCGTTTCT-3′；OsNIA2 引物為：F：5′-AC TGGTGCTGGTGCTTCTGG-3′，R：5′-CGGCTGGG TGTTGAGGGACT-3′；Actin1 引物為：F：5′-CAACA CCCCTGCTATGTACG-3′，R：5′-CATCACCAGAGTC CAACACAA-3′。熒光定量PCR 試劑盒為Thermo Scientific DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR Kit (Thermo)，儀器為Stratagene Mx3005P 熒光定量PCR 儀，反應(yīng)體系及條件參照試劑盒說明書進(jìn)行。以上實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)5 次，結(jié)果用平均值±SD 表示，用SPSS16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度SNP 處理對(duì)水稻初生根長(zhǎng)度及側(cè)根數(shù)量的影響

從表1 可知，SNP 處理濃度為5 μmol/L 時(shí)，在處理后的第3 d 和第5 d，初生根長(zhǎng)、側(cè)根和冠根的數(shù)量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異（P ＞0.05）；當(dāng)SNP處理濃度達(dá)10 μmol/L 以上時(shí)，隨著SNP 處理濃度的增加，初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量和冠根數(shù)量也逐漸增大，各處理初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量及冠根數(shù)量均顯著大于對(duì)照處理。其中以SNP 處理為20 μmol/L時(shí)效果最佳，在處理后的第3 d，初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量和冠根數(shù)量分別比對(duì)照處理提高59.95%、26.89%和67.80%，均達(dá)顯著性差異（P ＜0.05）；在處理后的第5 d， 初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量和冠根數(shù)量分別比對(duì)照處理提高28.04%、25.37%和65.49%，均達(dá)顯著性差異（P ＜0.05）。但當(dāng)SNP 濃度達(dá)25 μmol/L 時(shí)，與20 μmol/L 的使用濃度相比，對(duì)初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量及冠根數(shù)量不再有顯著促進(jìn)作用（P ＞0.05），結(jié)果表明水稻幼苗根系生長(zhǎng)需要NO信號(hào)的參與。

表1 硝普納處理對(duì)初生根長(zhǎng)度、側(cè)根及冠根數(shù)的影響Table 1 The effects of SNP treatment on primary root length, lateral root and crown root number

2.2 NO 合成酶抑制劑對(duì)水稻初生根長(zhǎng)度及側(cè)根數(shù)量的影響

從表2 可知，當(dāng)NO 合成酶抑制劑為50 μmol/L 時(shí)，在處理后的第3 d 和第5 d，初生根長(zhǎng)、側(cè)根和冠根的數(shù)量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異（P ＞0.05）；當(dāng)NO 合成酶抑制劑達(dá)100 μmol/L 以上時(shí)，隨著NO合成酶抑制劑處理濃度的增加，初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量和冠根數(shù)量也逐漸減小。NO 合成酶抑制劑濃度達(dá)100 μmol/L 以上時(shí)，各處理的初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量及冠根數(shù)量均顯著低于對(duì)照處理。其中以NO 合成酶抑制劑為800 μmol/L 時(shí)效果最佳，如在處理后的第3 d，初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量和冠根數(shù)量分別比對(duì)照處理降低30.96%、56.94%和55.05%，均達(dá)顯著性差異（P ＜0.05）；在處理后的第5 d 時(shí)，初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量和冠根數(shù)量分別比對(duì)照處理降低51.38%、64.12%和58.59%，也均達(dá)顯著性差異（P ＜0.05）。結(jié)果表明NO 合成受到抑制時(shí)，也抑制了根系的生長(zhǎng)。

表2 NO 合成酶抑制劑處理對(duì)初生根長(zhǎng)度、側(cè)根及冠根數(shù)的影響Table 2 The effects of NO synthetase inhibitor treatment on primary root length, lateral root and crown root number

2.3 NO 清除劑處理對(duì)水稻初生根長(zhǎng)度及側(cè)根數(shù)量的影響

從表3 可知，當(dāng)NO 清除劑為50 μmol/L 時(shí)，在處理的第3 d 和第5 d，初生根長(zhǎng)、側(cè)根和冠根的數(shù)量與對(duì)照相比無(wú)顯著差異（P ＞0.05）；當(dāng)NO清除劑達(dá)100 μmol/L 以上時(shí)，隨著NO 清除劑處理濃度的增加，初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量和冠根數(shù)量也逐漸減小。當(dāng)NO 清除劑cPTIO 濃度達(dá)100 μmol/L 以上時(shí)，各處理的初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)及冠根數(shù)均顯著低于對(duì)照處理，其中以800 μmol/L NO 清除劑cPTIO 處理的效果最佳，如在處理后的第3 d，初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量和冠根數(shù)量分別比對(duì)照處理降低49.80%、56.26%和76.75%，均達(dá)顯著性差異 （P ＜0.05）；在處理后的第5 d 時(shí)，初生根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量和冠根數(shù)量分別比對(duì)照處理降低56.67%、56.61%和55.41%，均達(dá)顯著性差異（P ＜0.05）。結(jié)果表明，當(dāng)根系的NO 受到cPTIO 清除后，初生根、側(cè)根及冠根的生長(zhǎng)均受到抑制作用。

表3 NO 清除劑處理對(duì)初生根長(zhǎng)度、側(cè)根及冠根數(shù)的影響Table 3 The effects of NO scavenger treatment on primary root length, lateral root and crown root number

2.4 SNP、NO 合成酶抑制劑及清除劑處理對(duì)側(cè)根NO 分布的影響

從圖1 可知，經(jīng)SNP 處理后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NO 在根表皮及根內(nèi)大部分細(xì)胞均有分布，主要集中分布于側(cè)根形成部位和側(cè)根根尖部分，且熒光強(qiáng)度越大，表示NO 含量越高。與對(duì)照相比，外源SNP 處理后，NO 熒光強(qiáng)度明顯大于對(duì)照處理。受NO 合成酶抑制劑和清除劑處理后，染色程度明顯下降。側(cè)根清除處理后起始部位的NO 含量明顯減少，且NO 的熒光強(qiáng)度最淺，側(cè)根數(shù)量少而短（圖1），結(jié)果表明當(dāng)NO 積累減少，側(cè)根數(shù)量下降。

2.5 SNP、NO 合成酶抑制劑及清除劑處理對(duì)側(cè)根IAA 分布的影響

圖 1 SNP、NO 合成酶抑制劑及清除劑處理對(duì)NO 分布的影響Fig. 1 The effects of SNP, NO synthetase inhibitor and scavenger treatments on NO distribution

圖 2 SNP、NO 合成酶抑制劑及清除劑處理對(duì)IAA 分布的影響Fig. 2 The effects of SNP, NO synthetase inhibitor and scavenger treatments on IAA distribution

從圖2 可知，經(jīng)SNP 處理后，通過對(duì)DR5:: GUS 標(biāo)記水稻側(cè)根起始部位染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IAA主要分布在根的維管束部位，極性分布于側(cè)根形成部位和側(cè)根根尖部分，在初生根的維管束與側(cè)根形成起始部位，明顯看到染色較深，說明IAA 含量較多（圖2），與對(duì)照相比，外源的SNP 處理后，染色程度明顯大于對(duì)照處理。而受到NO 合成酶抑制劑和清除劑處理后，側(cè)根數(shù)量減少，染色程度明顯下降，以受NO 清除劑處理后，IAA 的GUS染色最淺，結(jié)果表明由初生根向側(cè)根運(yùn)輸IAA 含量明顯減少，IAA 極性積累于側(cè)根起始形成部位，有益于側(cè)根形成，當(dāng)IAA 積累減少，側(cè)根形成量顯著下降。

2.6 SNP、NO 合成酶抑制劑及清除劑處理對(duì)側(cè)根O2·-分布的影響

經(jīng)SNP 處理后，用NBT 對(duì)水稻側(cè)根的起始部位染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)O2·-主要分布在根的維管束部位，極性分布于側(cè)根形成部位及側(cè)根根尖部分，在初生根維管束與側(cè)根形成起始部位，明顯看到染色較深，表明O2·-含量較多（圖3）。與對(duì)照相比，外源SNP處理后，染色程度明顯大于對(duì)照處理。受到NO 合成酶抑制劑和清除劑處理后，O2·-染色程度明顯下降。表明O2·-極性積累于側(cè)根起始形成部位，有益于側(cè)根形成，當(dāng)O2·-積累減少時(shí)，側(cè)根的形成量顯著下降。

2.7 外源SNP 對(duì)OsNIA1 和OsNIA2 基因表達(dá)的影響

從圖4 可知，隨著SNP 處理濃度的增加，對(duì)基因OsNIA1 和OsNIA2 相對(duì)表達(dá)量的促進(jìn)作用逐漸增大。當(dāng)SNP 達(dá)10 μmol/L 以上時(shí)，各處理濃度均可顯著提高OsNIA1 和OsNIA2 基因的表達(dá)（P ＜0.05）。如當(dāng)SNP 濃度為15 μmol/L、20 μmol/L和25 μmol/L 時(shí)，OsNIA1 表達(dá)量分別比對(duì)照處理增 加 了107.65%、88.82% 和79.41%（P ＜0.05），OsNIA2 表達(dá)量分別比對(duì)照處理增加了109.36%、152.71%和146.31%（P ＜0.05）。表明外源SNP 能促進(jìn)與NO 合成相關(guān)基因OsNIA1 和OsNIA2 的表達(dá)，且當(dāng)SNP 濃度達(dá)到15 μmol/L 時(shí)，對(duì)OsNIA1誘導(dǎo)效果最好，而SNP 濃度超過20 μmol/L 時(shí)，對(duì)OsNIA2 誘導(dǎo)效果最佳。

圖 3 SNP、NO 合成酶抑制劑及清除劑處理對(duì)側(cè)根O2·-分布的影響Fig. 3 The effects of SNP, NO synthetase inhibitor and scavenger treatments on O2·- distribution

圖4 SNP 處理對(duì)OsNIA1 和OsNIA2 基因表達(dá)的影響Fig. 4 The effect of SNP treatment on the expression of OsNIA1 and OsNIA2

2.8 外源NO 合成酶抑制劑對(duì)OsNIA1 和OsNIA2基因表達(dá)的影響

從圖5 可知，隨著NO 合成酶抑制劑處理濃度的增加，對(duì)基因OsNIA1 和OsNIA2 相對(duì)表達(dá)量的抑制作用逐漸增大。當(dāng)NO 合成酶抑制劑達(dá)100 μmol/L 時(shí)，可顯著抑制OsNIA1 表達(dá)（P＜0.05），對(duì)OsNIA2 表達(dá)沒有顯著影響（P＞0.05），當(dāng)NO 合成酶抑制劑達(dá)200 μmol/L 時(shí)，可顯著抑制OsNIA2 的表達(dá)（P＜0.05），當(dāng)NO 合成酶抑制劑濃度為800 μmol/L 時(shí)，對(duì)OsNIA1 和OsNIA2 的表達(dá)量受到的抑制作用最大，分別比對(duì)照下降63.85%和60.58%（P＜0.05）。表明外源NO 合成酶抑制劑可抑制與NO 合成相關(guān)基因OsNIA1 和OsNIA2 的表達(dá)。

2.9 外源SNP 對(duì)NO 含量及O2·-產(chǎn)生速率的影響

從圖6 可知，當(dāng)SNP 處理濃度低于5 μmol/L時(shí)，對(duì)NO 的含量無(wú)促進(jìn)作用，與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。當(dāng)SNP 達(dá)10 μmol/L 以上時(shí)，隨著SNP 處理濃度的增加，對(duì)NO 含量的促進(jìn)作用也逐漸增大，如SNP 濃度為10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L 和25 μmol/L 時(shí)，NO 含量則分別比對(duì)照增加了45.99%、78.17%、96.43%和71.42%，均達(dá)顯著性差異（P＜0.05），其中當(dāng)SNP 濃度為20 μmol/L處理時(shí)，NO 含量最高，當(dāng)濃度達(dá)25 μmol/L 時(shí)，NO 含量又有所下降。進(jìn)一步探究SNP 處理對(duì)側(cè)根形成部位O2·-產(chǎn)生速率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SNP 處理濃度低于5 μmol/L 時(shí)，對(duì)O2·-的產(chǎn)生速率無(wú)促進(jìn)作用，與對(duì)照相比無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。當(dāng)SNP 達(dá)10 μmol/L 以上時(shí)，隨著SNP 處理濃度增加，對(duì)NO 含量和O2·-產(chǎn)生速率的促進(jìn)作用也逐漸增大，如在SNP 濃度為10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L和25 μmol/L 時(shí)，O2·-產(chǎn)生速率分別比對(duì)照增加了64.07%、131.13%、208.98%和174.65%，均達(dá)顯著性差異（P＜0.05），當(dāng)SNP 濃度為20 μmol/L 處理時(shí)，O2·-產(chǎn)生速率最大，當(dāng)濃度達(dá)25 μmol/L 時(shí)，O2·-產(chǎn)生速率又有所下降。

3 討論

3.1 水稻側(cè)根形成需要NO、IAA 和O2·-極性積累于側(cè)根起始部位

圖 5 NO 合成酶抑制劑處理對(duì)OsNIA1 和OsNIA2 基因表達(dá)的影響Fig. 5 The effect of NO synthetase inhibitor treatment on the expression of OsNIA1 and OsNIA2

圖 6 SNP 處理NO 含量及O2·-產(chǎn)生速率的影響Fig. 6 The effect of SNP treatment on NO content and O2·-generation rate

本研究結(jié)果證實(shí)，水稻側(cè)根形成需要NO 信號(hào)調(diào)控，且需要NO、IAA 和O2·-極性積累于側(cè)根的起始部位。當(dāng)有外源的SNP 供體時(shí)，NO 在側(cè)根形成部位的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)，當(dāng)受到NO 合成酶抑制劑或NO 清除劑處理后，水稻側(cè)根部位的NO 熒光強(qiáng)度顯著減弱，同時(shí)IAA 和O2·-在側(cè)根起始部位的積累也顯著降低，表明側(cè)根數(shù)量和長(zhǎng)度均受到顯著抑制，當(dāng)清除NO 時(shí)，側(cè)根的數(shù)量顯著下降[22]。研究結(jié)果表明，O2·-和IAA 極性積累于側(cè)根起始部位受到NO 信號(hào)調(diào)節(jié)，受NO 供體SNP 處理后，能夠促進(jìn)IAA 和O2·-極性積累于側(cè)根起始部位及根尖，從而誘導(dǎo)側(cè)根的發(fā)生頻率和快速生長(zhǎng)。該研究結(jié)果與前人在擬南芥中發(fā)現(xiàn)IAA 在側(cè)根初始細(xì)胞的選擇、根原基發(fā)育和側(cè)根分生組織激活等過程中均起到關(guān)鍵作用的結(jié)論基本一致[23]。但這三種信號(hào)物質(zhì)如何選擇主根中的特定中柱細(xì)胞作為側(cè)根原基并促進(jìn)側(cè)根發(fā)育的具體機(jī)制，還需深入研究。

3.2 NO 促進(jìn)IAA 和O2·-積累于側(cè)根起始部位利于側(cè)根發(fā)育

通過對(duì)DR5-GUS 標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻IAA 進(jìn)行GUS 染色發(fā)現(xiàn)，IAA 主要分布在初生根中柱部位和側(cè)根根尖，而在初生根皮層細(xì)胞的含量很少，在無(wú)側(cè)根發(fā)育部位甚至無(wú)極性積累。當(dāng)NO 供體SNP 濃度增加時(shí)，側(cè)根形成部位NO 含量也隨之增加，同時(shí)，IAA 的GUS 染色顯著加深，表明側(cè)根形成部位IAA 的積累也相應(yīng)提高。因此，該研究結(jié)果證實(shí)了水稻側(cè)根發(fā)生確實(shí)需要IAA 極性積累于側(cè)根起始細(xì)胞才有利于側(cè)根的快速生長(zhǎng)，這與前人的研究結(jié)果相似[24]，且本研究結(jié)果也說明IAA 位于NO 的下游信號(hào)物質(zhì)。水稻側(cè)根的形成需要NO 調(diào)控IAA極性積累于側(cè)根起始部位，NO 信號(hào)是促進(jìn)IAA 極性運(yùn)輸還是加強(qiáng)了IAA 從頭合成再向側(cè)根原基的極性積累，還需深入研究。

此外，水稻根受外源NO 供體SNP 處理后，隨著NO 含量增加，側(cè)根形成部位及根尖的O2·-極性積累也增加，這與前人發(fā)現(xiàn)NO 在調(diào)控ROS 在植物體內(nèi)的代謝平衡有著重要作用的結(jié)論一致[25-26]。且有研究表明，NO 通過ONOO-來調(diào)控H2O2的信號(hào)，這與前人發(fā)現(xiàn)水稻種子萌發(fā)時(shí)受外源O2·-清除劑處理則可顯著抑制初生根生長(zhǎng)的結(jié)果相似[27-28]。因?yàn)橐延醒芯堪l(fā)現(xiàn)，O2·-是植物生長(zhǎng)的重要調(diào)節(jié)信號(hào)物質(zhì)，在生長(zhǎng)活躍區(qū)都有O2·-產(chǎn)生，當(dāng)O2·-積累后可誘導(dǎo)SOD 活性增加，SOD 將O2·-轉(zhuǎn)化成H2O2，再在O2·-和H2O2信號(hào)下誘導(dǎo)側(cè)根的形成[29]。而且O2·-經(jīng)SOD 作用產(chǎn)生H2O2的同時(shí)也形成.OH 時(shí)，.OH可促進(jìn)細(xì)胞壁木糖和果膠的裂解，從而促進(jìn)細(xì)胞壁松動(dòng)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng).OH 形成途徑受阻時(shí)，玉米根尖伸長(zhǎng)區(qū)生長(zhǎng)明顯受到抑制[30]。所以側(cè)根形成及快速生長(zhǎng)均需O2·-信號(hào)的參與。當(dāng)水稻幼苗NO 合成受到抑制或受清除時(shí)，O2·-在側(cè)根的積累量顯著下降，導(dǎo)致側(cè)根形成受阻，這與前人在NO 促進(jìn)其他植物不定根形成的研究結(jié)果類 似[31]。當(dāng)超表達(dá)O2·-供體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Respiratory burst oxidase homologue, Rboh） 時(shí)，擬南芥的側(cè)根數(shù)量明顯增多，當(dāng)Rboh基因表達(dá)受到抑制或突變時(shí)，側(cè)根數(shù)量顯著減少，當(dāng)利用外源的KI 清除O2·-后，側(cè)根數(shù)量也顯著降低[14]，說明側(cè)根形成也需要O2·-積累于側(cè)根的起始部位。Orman-Ligeza 等[14]進(jìn)一步研究表明，外源IAA 和NAA 處理可顯著提高Rboh基因家族表達(dá)、Rboh 蛋白在側(cè)根原基積累可促進(jìn)H2O2含量增加，從而誘導(dǎo)側(cè)根形成，且外源H2O2還能部分恢復(fù)生長(zhǎng)素運(yùn)輸aux1 和lax3 雙突變體的側(cè)根數(shù)量，由此說明O2·-作為IAA 下游信號(hào)物質(zhì)調(diào)控側(cè)根的形成，或存在著互作與協(xié)同關(guān)系[32]。因此，在NO 調(diào)控水稻側(cè)根形成過程中，可能是NO 先促進(jìn)IAA 極性積累，再促進(jìn)O2·-極性積累，從而利于側(cè)根形成。但水稻側(cè)根形成過程中，NO 信號(hào)調(diào)控IAA 和O2·-極性積累并促進(jìn)側(cè)根形成的具體生理與分子機(jī)制還需要深入研究，特別是中側(cè)根原基起始細(xì)胞的選擇與NO 調(diào)控信號(hào)的關(guān)系也需深入探討。

4 結(jié)論

1）水稻幼苗側(cè)根形成需要NO 信號(hào)參與，當(dāng)提供外源的NO 供體SNP 時(shí)，可顯著促進(jìn)IAA 和O2·-極性積累于側(cè)根原基起始細(xì)胞和側(cè)根的尖端，從而促進(jìn)側(cè)根形成。當(dāng)提供外源NO 合成受到抑制和清除劑時(shí)，降低了NO 在側(cè)根起始部位的積累，也顯著降低了側(cè)根數(shù)量。

2）在水稻幼苗側(cè)根形成過程中，IAA 可能是NO 的下游信號(hào)物質(zhì)，O2·-則可能是IAA 的下游信號(hào)物質(zhì)，他們共同調(diào)控側(cè)根的形成。