L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中4種有害醛類形成的抑制作用及其品質(zhì)的改善效果

劉百里，鄭潔，黃才歡，劉付，歐仕益

（暨南大學(xué)理工學(xué)院，焙烤食品安全粵港聯(lián)合創(chuàng)新平臺，廣東廣州 510632）

曲奇是全世界最受歡迎的烘焙產(chǎn)品之一[1]。它們含有大量糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并經(jīng)過高溫烘烤處理，因此曲奇是研究美拉德反應(yīng)衍生的化學(xué)危害的典型模型。以往研究焙烤加工食品的有害物方面多專注于丙烯酰胺問題[2]。然而，在美拉德反應(yīng)或糖類的直接熱裂解過程中，還會產(chǎn)生5-羥甲基糠醛（HMF）、α-二羰基化合物如3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG）、乙二醛（GO）、丙酮醛（MGO）等[3]。此外，脂質(zhì)氧化也會產(chǎn)生GO、MGO等α-二羰基化合物[4]。研究表明，HMF可生物轉(zhuǎn)化為5-亞砜甲基-2-糠醛（SMF），后者能夠與DNA發(fā)生反應(yīng)且具有潛在致癌性[5]。二羰基化合物與蛋白質(zhì)反應(yīng)形成晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs），AGEs與多種和年齡相關(guān)的慢性炎癥疾病的發(fā)展相關(guān)，例如糖尿病、心血管疾病[6]、癌癥[7]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[8]。在分子水平上，羥基酪醇可以有效捕獲乙二醛和丙酮醛，它們與3-脫氧葡萄糖醛酮一起，代表了食物中最豐富的二羰基化合物[9]。L-半胱氨酸由發(fā)酵法制得，我國年產(chǎn)約1×104t[10]。它是一種還原劑，能切斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵進(jìn)而弱化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)伸展開。L-半胱氨酸在食品、化妝品和醫(yī)藥保健品中有廣泛用途，其中食品添加劑用途占比60%以上。同時，L-半胱氨酸還具有抗氧化應(yīng)激、改善人體脂質(zhì)代謝和益生元等作用[11]。

根據(jù)課題組前期研究，在生理條件下半胱氨酸可以與3-DG、GO、MGO、HMF形成加合物并降低細(xì)胞毒性，如丙烯醛的毒性降低近60倍[12,13]。因L-半胱氨酸溶解度小，食品工業(yè)中都用其鹽酸鹽；L-半胱氨酸鹽酸鹽是面粉改良劑，但在曲奇中的使用劑量，能否顯著降低以上四種有害醛類還未知。因此，本研究通過將不同添加量的L-半胱氨酸鹽酸鹽加于曲奇中，研究對曲奇外觀品質(zhì)、4種有害醛類含量及細(xì)胞毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低筋小麥粉，益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；酥油、烤焙油，天津南僑食品有限公司；二甲基亞砜、氯化鈉、蔗糖、碳酸氫鈉，均為分析純，天津大茂有限公司；2,4-二硝基苯肼、鄰苯二胺、甲醇，德國默克試劑有限公司；5-羥甲基糠醛（98%），北京百靈威科技有限公司；乙二醛、丙酮醛，質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%水溶液，北京百靈威科技有限公司；3-脫氧葡萄糖醛酮，加拿大TRC有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽（99%），北京夢怡美生物科技有限公司；MTT，德國BIOFROX公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜、GCMS-QP2010 ULTRA氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；Centrifuge 5810 R離心機(jī)，德國Eppendorf公司；XW-80A型微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠；SPECTRONIC-200分光光度計，賽默飛；QTS質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable.Micro System公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 曲奇的制備

參照美國AACC 10-54[14]方法制作曲奇。曲奇配方如表1（原料小麥粉不含有L-半胱氨酸鹽酸鹽）所示，首先將酥油迅速攪拌，加入蔗糖、奶粉、鹽、小蘇打攪打；之后取高果糖漿、碳酸氫銨、水，混合再向其中添加L-半胱氨酸鹽酸鹽（L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為0.0、0.3、0.6、1.0、1.5 g/kg）制得混合溶液。將溶液與干粉料攪拌均勻，置于心型模具內(nèi)制成曲奇，放在預(yù)熱45 min后的烤箱中，于200 ℃下烘焙15 min制得曲奇。

表1 曲奇配料 Table 1 Cookie ingredients (g)

1.3.2 感官評價

構(gòu)建感官評價小組，小組有12名成員（3名男性和9名女性，年齡21至24歲）。對曲奇樣品進(jìn)行評價，分別從顏色、形態(tài)、香味、甜味、細(xì)膩度、裹齒感、后味七個特性分析。每種特性分?jǐn)?shù)構(gòu)成為：顏色0～20分，形態(tài)0～15分，香味0～15分，甜味0～15分，細(xì)膩度0～10分，裹齒感0～10分，后味～15分。

1.3.3 曲奇中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

根據(jù)鐘京等[15]的方法稍加改動，采用固相微萃取方法檢測曲奇中風(fēng)味物質(zhì)。取5 g研磨后的曲奇樣品放入40 mL的頂空采樣瓶中，于60 ℃恒溫條件下吸附萃取30 min。吸附結(jié)束后，將萃取頭立即插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口，于250 ℃解析3 min，進(jìn)行分析。色譜條件：DB-5MS色譜柱（300 mm×0.25 mm，0.25 μm）；載氣（氦氣）流量：恒定流速，0.8 mL/min；升溫程序：初溫40 ℃，保留3 min，以5 ℃/min升至90 ℃，之后按照12 ℃/min升至220 ℃，保留7 min。

質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，電離方式為電子轟擊（electron impact），質(zhì)量掃描范圍為30～490。

1.3.4 曲奇白度、質(zhì)構(gòu)測定

采用白度計對曲奇樣品的色度進(jìn)行測定，以L*、a*和b*為色度參數(shù)。用質(zhì)構(gòu)分析儀檢測曲奇樣品的質(zhì)構(gòu)（配備探頭TA11/1000和TA90平臺），測試速度2 mm/s，觸發(fā)點負(fù)載1 g，返回速度2 mm/s[16]。

1.3.5 曲奇中水提物的制備

將1 g研磨后的曲奇樣品置于50 mL離心管中，加入5 mL去離子水，渦旋3 min，在10000 r/min下離心10 min，收集上清液，用5 mL去離子水重復(fù)提取兩次，合并上清液，用去離子水定容至15 mL。

1.3.6 HMF的測定

將曲奇水提物用0.22 μm濾膜過濾，參照Huang等[17]的方法，進(jìn)行高效液相色譜分析，色譜柱為Zorbax SB-Aq柱。流動相：5%甲醇水溶液；樣品進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.6 mL/min；檢測波長：284 nm。通過HMF標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=101278x-145308（R2=0.9992，線性范圍10～600 μg/mL）。每處理重復(fù)3次。

1.3.7 MGO、3-DG的測定

對于MGO和3-DG的檢測采用OPD衍生法進(jìn)行高效液相色譜檢測，取1.0 mL樣品水提物與100 μL 10%（m/V）鄰苯二胺甲醇溶液混合后，60 ℃水浴避光衍生24 h。將衍生后的混合物用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液采用HPLC測定?；旌暇鶆蚝笤?0 ℃水浴中加熱60 min，然后取出用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液進(jìn)樣分析。根據(jù)Ou等[18]的方法，樣品分離在Zorbax SB-Aq柱上進(jìn)行，流動相：A為0.1%乙酸水，B為甲醇，進(jìn)行梯度洗脫，梯度程序設(shè)置：B=28%～43%，0.00～15.00 min；B=43%～75%，15.01～ 30.00 min；B=75%，30.01～35.00 min。流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：40 ℃，檢測波長：314 nm。通過MGO和3-DG的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，其中MGO濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2 μmol/mL，3-DG濃度為10、30、50、70、90、120 μg/mL由本實驗測得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：MGO為y=2128405.56x- 12276.93（R2=0.9996，線性范圍0.1～1.2 μmol/mL）3-DG為y=21986.31x+3027.17（R2=0.9999，線性范圍10～120 μg/mL）。每處理重復(fù)3次。

1.3.8 GO的測定

對于GO的檢測采用2,4-二硝基苯肼衍生法[19]進(jìn)行高效液相色譜檢測。取0.2 mL樣品水提物加入1.8 mL乙腈和1 mL DNPH（濃度為12.5 mmol/L溶于乙腈/濃鹽酸9:1）混合均勻后在70 ℃水浴中加熱2 h，冷卻后取出用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液進(jìn)樣分析。根據(jù)Ou等[18]的方法，流動相A為0.1%乙酸水，流動相B為甲醇，進(jìn)行梯度洗脫，梯度程序設(shè)置：

B=28%～43%，0.00～15.00 min；B=43%～75%，15.01～ 30.00 min；B=75%，30.01～35.00 min。進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃。檢測波長：435 nm。繪制GO的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，其中GO的濃度設(shè)置為0.01、0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/mL，由本實驗測得GO的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下y=3095277.65x-15928.29（R2=0.99，線性范圍0.01～0.40 μmol/mL）。每處理重復(fù)3次。

1.3.9 細(xì)胞活力

通過MTT法檢測曲奇水提物對人胃粘膜上皮細(xì)胞（GES-1）的毒性，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100 μL 104cells/mL的GES-1細(xì)胞單細(xì)胞懸液，然后加入100 μL曲奇水提物在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，移除培養(yǎng)液，用120 μL含有5 mg/mL MTT溶液的培養(yǎng)基替代藥物，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，移除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置于搖床上振蕩10 min，然后在570 nm處檢測吸光度。每處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件處理，使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行方差分析，并在p=0.05水平下進(jìn)行Duncan’s顯著性差異分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇感官、色澤和質(zhì)地的影響

感官評價的結(jié)果如表2所示。從顏色、形態(tài)、香味、甜味、細(xì)膩度、裹齒感、后味七個屬性的得分分析，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后曲奇的感官評價得分高于空白組，當(dāng)L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為1.0 g/kg時，曲奇的感官評價得分最高。

表2 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇的感官評分的影響 Table 2 The sensory scores of cookies after adding L-cysteine hydrochloride

曲奇的白度可以通過三個參數(shù)來確定，即L*值、a*值和b*值，其中L*值表示黑色（0）/白色（100）顏色，a*值表示綠色（-）/紅色（+），b*值表示藍(lán)色（-）/黃色（+）[20]。隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量的增大，L*值顯著提高，b*值下降，證實了曲奇經(jīng)L-半胱氨酸鹽酸鹽處理后會變白。

隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加，硬度先升后降。在1.5 g/kg添加量時硬度小于空白組曲奇，咀嚼性顯著增加。所以，L-半胱氨酸鹽酸鹽可對曲奇質(zhì)構(gòu)中的硬度和咀嚼性有較大的影響，可使曲奇口感變得更酥脆[21]。

表3 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇質(zhì)構(gòu)的影響 Table 3 Effect of L-cysteine hydrochloride on texture in cookies

2.2 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中二羰基化合物含量的影響

在本實驗中，我們研究了L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中3種二羰基化合物（3-DG、GO、MGO）的影響。二羰基化合物3-DG、GO、MGO等化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡瑢θ梭w健康產(chǎn)生有害影響，是焙烤食品中需要把控的物質(zhì)[22]。

由表4可知，L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加可顯著降低曲奇中3-DG、GO、MGO的含量。

表4 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中3-DG、GO、MGO的影響(mg/kg) Table 4 Effect of L-cysteine hydrochloride on 3-DG, GO, and MGO in cookies (mg/kg)

當(dāng)L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量為0.3 g/kg時，3-DG含量顯著下降，減少了30.05%（p＜0.05），隨著添加量繼續(xù)增大，3-DG、GO、MGO都有顯著降低，L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量為1.5 g/kg時，3-DG、GO、MGO含量分別下降了62.73%、46.27%、36.59%（p＜0.05）。以往的研究中，Liu等[23]在熱加工模擬體系中添加槲皮素分別降低MGO、GO含量32.60%、40.48%。與此結(jié)果相比，L-半胱氨酸鹽酸鹽效果較好。實驗結(jié)果表明，L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中產(chǎn)生的二羰基化合物有明顯的抑制作用，能有效地降低烘焙過程中產(chǎn)生的有害物。這可能是因為L-半胱氨酸和二羰基化合物形成了加合產(chǎn)物[13]。

2.3 L-半胱氨酸鹽酸鹽對HMF的影響

研究表明HMF在高濃度下具有細(xì)胞毒性，對眼睛、上呼吸道、皮膚和粘膜有刺激性[24]。由表5可知，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽可顯著降低曲奇中的HMF含量：當(dāng)添加量達(dá)到0.3 g/kg后，HMF顯著下降，降低幅度達(dá)到28.75%（p＜0.05）。繼續(xù)增加L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加量，抑制率顯著增加，添加量至1.5 g/kg時，HMF下降82.95%。

表5 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中HMF的影響 Table 5 Effect of L-cysteine hydrochloride on HMF in cookies

2.4 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

半胱氨酸可以通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生肉香、燒烤風(fēng)味[25]。添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后，曲奇中的揮發(fā)性醛、醇和吡嗪含量升高，除呋喃酮外大部分酮類物質(zhì)含量減少。如表6所示，風(fēng)味物質(zhì)含量采用峰面積歸一化法計算。吡嗪類物質(zhì)在對照組中檢測到2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪，添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后增加了2,3-二甲基-吡嗪，2-(正丙基)-吡嗪。其中添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪含量分別增加了72.51%、92.54%、40%，2,6-二甲基吡嗪含量降低11.18%。醇類物質(zhì)在對照組中檢測到苯甲醇、乙醛縮丙醇苯乙醇、3-呋喃甲醇、1-戊醇、1-辛醇、1,2-丙二醇、3-甲基-4戊烯-1醇、2,3-丁二醇、葉醇，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后1,2-丙二醇、3-甲基-4戊烯-1醇含量分別降低72.22%、100%，苯甲醇、乙醛縮丙醇苯乙醇、3-呋喃甲醇、葉醇含量分別升高80%、25%、8.15%、4.65%。醛類物質(zhì)在對照組中檢測到乙醛、壬醛、糠醛、2,4-二甲基-苯甲醛、辛烷醛，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后增加了桃醛、反式-2,4-癸二烯醛、苯甲醛、2-噻吩甲醛。添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后，壬醛、2,4-二甲基-苯甲醛、辛烷醛含量分別升高85.71%、728.57%、66.67%，乙醛、糠醛含量分別降低88.24%、43.59%。酮類物質(zhì)在對照組中檢測到1-羥基-2-丙酮、3,4-二氫-6-甲基-2H-吡喃-2-酮、5-乙基二氫-2(3H)-呋喃酮、2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮、1-羥基-2-丁酮、2-庚酮、3-[3-溴苯基]-7-氯-3,4-二氫-10-羥基-1,9(2H,10H)-吖啶二酮、2(5H)-呋喃酮、二氫-5-丙基-2(3H)-呋喃酮、5-丁基二氫-2(3H)-呋喃酮、二氫-5-戊基-2(3H)-呋喃酮、5-己基二氫-2(3H)-呋喃酮，添加前后酮種類基本不變，含量有較明顯變化，在添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽后3-[3-溴苯基]-7-氯-3,4-二氫-10-羥基-1,9(2H,10H)-吖啶二酮、2-庚酮、2(5H)-呋喃酮、5-丁基二氫-2(3H)-呋喃酮、二氫-5-戊基-2(3H)-呋喃酮含量分別升高200%、17.24%、7.69%、46.27%、176.14%，1-羥基-2-丙酮、3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮、1-羥基-2-丁酮、二氫-5-丙基-2(3H)-呋喃酮物質(zhì)含量分別降低4.75%、61.90%、79.31%、42.67%。這可能是因為半胱氨酸和還原糖的美拉德反應(yīng)會降低脂肪族羰基的水平源自脂質(zhì)氧化和降解的化合物，例如酮[26]。含硫化合物-噻吩是肉香味的重要來源[27]。對照組中檢測到4-甲基-5-(beta-羥乙基)噻唑，在添加L-半胱氨酸鹽酸鹽后增加了2-乙基-噻唑、2-乙酰噻唑。

表6 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響 Table 6 Effect of L-cysteine hydrochloride on the volatile flavor substances in cookies

續(xù)表6

2.5 L-半胱氨酸鹽酸鹽對曲奇水提物細(xì)胞毒性的影響

采用人胃粘膜細(xì)胞（GES-1）研究了曲奇水提物對細(xì)胞活力的影響。未加藥的對照組細(xì)胞存活率為84.8%，添加L-半胱氨酸鹽酸鹽的曲奇水提物培養(yǎng)GES-1細(xì)胞的存活率分別為103.7%、100.9%、86.3%、99.2%。添加了L-半胱氨酸鹽酸鹽的曲奇水提物培養(yǎng)細(xì)胞的存活率均有提高，說明L-半胱氨酸鹽酸鹽的添加對GES-1細(xì)胞活力有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

本實驗通過添加不同量L-半胱氨酸鹽酸鹽，研究對烘焙曲奇外觀品質(zhì)及有害物質(zhì)的影響。研究表明：L-半胱氨酸鹽酸鹽提高了曲奇的白度和感官評分，更加酥脆的口感。抑制了曲奇中的活潑羰基化合物（HMF、3-DG、GO、MGO）的形成。同時對風(fēng)味成分有不同程度的影響，揮發(fā)性醛、醇和吡嗪含量升高，除呋喃酮外大部分酮類物質(zhì)含量減少。添加L-半胱氨酸鹽酸鹽對細(xì)胞沒有抑制作用。結(jié)合實驗數(shù)據(jù)分析可以得出結(jié)論，在1.0 g/kg L-半胱氨酸鹽酸鹽添加量時，曲奇的外觀、氣味、口感均令人滿意，有害醛類含量較少且對GES-1細(xì)胞活力有促進(jìn)作用。