氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定飼料添加劑中乙氧基喹啉的殘留量

高冰心

(肇慶巨元生化有限公司，廣東 肇慶 526200)

乙氧基喹啉(ethoxyquin，化學(xué)名6-乙氧基-2，2，4-三甲基-1，2-二氫喹啉，結(jié)構(gòu)式見圖1)是性能優(yōu)良的飼料抗氧化劑之一，它能通過自身氧化作用保護(hù)其它易氧化組分，其對(duì)于改善飼料的品質(zhì)，防止飼料中維生素等營養(yǎng)成分的氧化變質(zhì)有重要的作用。一直以來，乙氧基喹啉都是飼料添加劑中廣泛使用的抗氧化劑，由于2017年歐盟發(fā)布公告G/SPS/EU/190：停止在動(dòng)物飼料中添加使用乙氧基喹啉。企業(yè)在更換抗氧化劑之后，還需要對(duì)其殘留進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)控。

圖1 乙氧基喹啉的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of ethoxyquin

飼料添加劑一般為顆?；蚍勰睿渲械囊已趸某Ａ繖z測(cè)主要采用高效液相色譜法[1]，但由于配制方法和檢出限的原因，當(dāng)乙氧基喹啉的殘留低于20 mg/kg時(shí)，高效液相色譜法(非熒光檢測(cè)器)無法檢測(cè)出，需采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)[2]。如今氣相色譜質(zhì)譜法已成為各種產(chǎn)品中乙氧基喹啉的微量分析的重要檢測(cè)方法[3-4]，本文建立了顆粒和粉末狀的飼料添加劑中乙氧基喹啉殘留量的分析方法，通過對(duì)樣品前處理過程的條件進(jìn)行比對(duì)和優(yōu)化，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)檢測(cè)，外標(biāo)法定量分析，得到了較準(zhǔn)確的定性定量結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2020氣相色譜-質(zhì)譜儀，日本島津；TB-215D電子天平，北京賽多利斯公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮有限公司。

乙氧基喹啉對(duì)照品(純度≥98%)，江蘇利田科技有限公司；水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水；正己烷，甲醇，乙腈(色譜純)，HONEYWELL公司；丙酮，環(huán)己烷，乙酸乙酯，異丙醇(色譜純)，廣州化學(xué)試劑廠；氯化鈉(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠；碳酸鈉，無水硫酸鈉(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，氫氧化鈉(分析純)，廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 溶液制備

1.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取乙氧基喹啉對(duì)照品30.0 mg到100 mL容量瓶中，加正己烷定容，搖勻，得0.30 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，此溶液避光冷藏保存。

1.2.2 樣品溶液

稱取1 g樣品(精確至0.01 g)置于125 mL分液漏斗中，加5 mL水，再加10 mL丙酮，加氯化鈉2 g，加環(huán)已烷、乙酸乙酯各5 mL，將混合液振蕩提取5 min后靜置分層。20 min后，用分液漏斗移取上層有機(jī)層，殘?jiān)?0 mL乙酸乙酯:環(huán)己烷=1:1的溶液提取2次，合并有機(jī)相加2 g無水硫酸鈉干燥，然后將有機(jī)相提取液于旋蒸瓶中旋蒸，蒸干后，加入5 mL乙酸乙酯和5 mL環(huán)已烷溶解殘?jiān)?。將上液用微孔濾膜(0.22 μm)過濾，稀釋10倍后進(jìn)GC-MS進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 色譜條件

GC條件：色譜柱：SH-Rxi-624Sil MS毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×1.8 μm)。進(jìn)樣口溫度:280 ℃，載氣：氦氣，純度?99.999%。柱溫升溫程序：100 ℃保持1 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持6 min，以20 ℃/min升至260 ℃保持10 min。進(jìn)樣方式：不分流，柱流量:2.0 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL。

MS條件：離子源溫度：230 ℃；接口溫度：250 ℃；相對(duì)電壓：0.2 kV；溶劑延遲時(shí)間：2 min；檢測(cè)時(shí)間：14～18 min；掃描范圍：50～500；數(shù)據(jù)采集模式：選擇性離子監(jiān)測(cè)(SIM)，選擇離子為m/z 202，174，217，145。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析

2.1 樣品提取溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)選取的飼料添加劑為本公司主要的三種產(chǎn)品：10%斑蝥黃(10% β，β-胡蘿卜素-4，4-二酮)，10%阿樸酯(β-阿樸-8’胡蘿卜酸乙酯)，10%β-胡蘿卜素。這三種產(chǎn)品均為顆粒狀，處理時(shí)應(yīng)先加少量水溶解樣品，然后再加提取溶劑提取乙氧基喹啉。

(1)本實(shí)驗(yàn)選取了5種不同的有機(jī)溶劑(乙腈，甲醇，正己烷，異丙醇，丙酮)，對(duì)乙氧基喹啉進(jìn)行提取，其中乙腈，甲醇和異丙醇的提取過程一致，具體步驟如下：稱取500 mg樣品加入50 mL容量瓶中，加5 mL純水于60 ℃超聲5 min至樣品全部溶解，然后加30 mL提取溶劑(乙腈、甲醇或異丙醇)于室溫超聲20 min，用溶劑定容，搖勻后將溶液倒于10 mL的離心管中離心5 min，取上清液移1 mL到50 mL容量瓶中，加提取溶劑(乙腈、甲醇或異丙醇)定容，取上液用微孔濾膜(0.22 μm)過濾，將這三種溶劑(乙腈、甲醇或異丙醇)提取后的溶液分別進(jìn)GC-MS進(jìn)檢測(cè)。

(2)國家出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T3856-2014[5]規(guī)定食品中乙氧基喹啉殘留量的測(cè)定采用正己烷作為提取溶劑，測(cè)定步驟如下：

準(zhǔn)確稱取4 g(精確到0.01 g)試樣于50 mL具塞離心管中，加入2 g碳酸鈉和2 g無水硫酸鈉，加入15 mL正己烷，均質(zhì)提取3 min，于離心機(jī)中5000 r/min離心3 min，取上層正己烷層，殘?jiān)儆?5 mL正己烷提取1次，合并正己烷提取液于旋蒸瓶中，旋蒸濃縮近干，用5 mL正己烷分多次洗滌殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，待凈化。

在待凈化液中加入0.5 mol/L的鹽酸溶液5 mL，渦旋震蕩1 min，靜置分層，棄去上層正己烷，下層酸溶液中加入5 mol/L的氫氧化鈉溶液1 mL，使溶液呈堿性(pH大于8)，加入正己烷2 mL，渦旋震蕩萃取1 min，5000 r/min離心3 min，取上層正己烷，下層水層再分別用2 mL正己烷萃取2次，合并正己烷層，氮吹濃縮至干，用2 mL正己烷溶解殘?jiān)?，?.22 μm的濾膜過濾，上機(jī)測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)也采用這種方法來檢測(cè)上面三種飼料添加劑中乙氧基喹啉的殘留量。

(3)通過不斷實(shí)驗(yàn)，研究建立了用丙酮作為提取溶劑檢測(cè)飼料添加劑中乙氧基喹啉殘留量方法(1.2.2)。以上5種溶劑對(duì)乙氧基喹啉的提取率見表1。

表1 不同溶劑對(duì)3種基質(zhì)中的乙氧基喹啉的提取率 (%)Table 1 Extraction efficiency ofethoxyquin using different dissolvants in 3 feed additives

由表1可見，對(duì)這3種飼料添加劑，丙酮對(duì)乙氧基喹啉的提取效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它4種溶劑，提取率高達(dá)94.4%。丙酮可作為最佳的提取溶劑，用于檢測(cè)飼料添加劑中乙氧基喹啉的殘留量。

2.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)(3.0 μg/mL)的色譜圖Fig.2 Selected ion chromalograms of ethoxyquin standard (3.0 μg/mL)

圖3 10%斑蝥黃樣品的色譜圖Fig.3 Selected ion chromalograms of 10% Canthaxanthin sample

取1.2.1的乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，搖勻，得到濃度為3.00 μg/mL的對(duì)照品溶液A。精密吸取對(duì)照品溶液A 0、0.1、0.2、1、2、5、10 mL分別置于100 mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，分別制成濃度為：0 μg/mL、0.003 μg/mL、0.006 μg/mL、0.03 μg/mL、0.06 μg/mL、0.15 μg/mL、0.30 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。用GC-MS的自動(dòng)進(jìn)樣器將上面制得的7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液，各吸取1 μL，注入氣相色譜-質(zhì)譜儀測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程：

Y=3737748X-2733.131,r2≥0.9999

結(jié)果表明，乙氧基喹啉在0～0.30 μg/mL的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，進(jìn)GC-MS檢測(cè)的樣品濃度在這個(gè)范圍內(nèi)能得到較準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。

2.3 最低檢出限

采用GCMS軟件的QAQC功能，計(jì)算在以上三種飼料添加劑基體中的乙氧基喹啉的檢出限(mg/kg)，結(jié)果為：10%斑蝥黃0.0098 mg/kg，10%阿樸酯0.0067 mg/kg，10%β-胡蘿卜素0.0089 mg/kg。乙氧基喹啉的檢出限在0.007～0.01 mg/kg的范圍內(nèi)。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)采取乙氧基喹啉的標(biāo)準(zhǔn)溶液和含有乙氧基喹啉的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。吸取濃度為0.30 μg/mL的對(duì)照品溶液2 mL，裝入樣品瓶中，在上文條件中連續(xù)進(jìn)樣5次，得到乙氧基喹啉含量的RSD(n=5)為0.79%。

用上文1.2.2的方法分別處理1批10%斑蝥黃、10%阿樸酯和10%β-胡蘿卜素樣品(樣品在最近5年的產(chǎn)品中隨機(jī)選取)，將得到樣品溶液10 mL，分別裝入樣品瓶中，在相同的條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)Table 2 Precision

由表2可知，在上面三種基質(zhì)的精密度實(shí)驗(yàn)中，乙氧基喹啉含量的RSD(n=5)為1.04%～2.60%，表明這種方法的精密度良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

分別稱取1批10%斑蝥黃，10%阿樸酯，10%β-胡蘿卜素樣品(精確至0.01 g)各1 g，置于125 mL分液漏斗中，加5 mL水，添加乙氧基喹啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為0.05 mg/kg，0.10 mg/kg，0.20 mg/kg，樣品按照1.2.2的方法處理好后，作為待測(cè)溶液進(jìn)GC-MS測(cè)定，每個(gè)濃度平行測(cè)定8次，測(cè)定乙氧基喹啉的的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果列于表3，結(jié)果表明此方法準(zhǔn)確。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)Table 3 Recoveries and RSD (%)

3 討 論

通過對(duì)不同提取溶劑及配樣方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，建立了用丙酮作為提取溶劑采用GC-MS測(cè)定飼料添加劑中乙氧基喹啉含量的分析方法。該方法的檢出限為0.01 mg/kg，精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.04%～2.60%，加標(biāo)回收率為72.96%～92.27%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.71%～8.01%。證明該方法選擇性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié) 論

現(xiàn)有的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中乙氧基喹啉殘留的測(cè)定方法，在本文的實(shí)驗(yàn)中得出這種方法對(duì)固體或粉末狀的飼料添加劑中的乙氧基喹啉的提取率較低，并不適合我們的日常檢測(cè)。而乙腈、甲醇和異丙醇可用于液相色譜中乙氧基喹啉殘留的常量分析，對(duì)于樣品中微量的乙氧基喹啉提取率較低。根據(jù)本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，將飼料添加劑用水溶解后，加丙酮作為提取溶劑，在環(huán)已烷和乙酸乙酯的共同作用下，乙氧基喹啉幾乎全部可提取出，這種方法為最合適的樣品前處理方法。

GC-MS檢測(cè)采用全掃描(SCAN)對(duì)樣品進(jìn)行全面定性，再用選擇性離子掃描(SIM)對(duì)樣品中的乙氧基喹啉進(jìn)行定量檢測(cè)，有效的排除了雜質(zhì)的干擾，專屬性強(qiáng)，提高了檢測(cè)的靈敏度，得到更加精確的分析結(jié)果。