腦膠質(zhì)瘤是一種極為常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，約占原發(fā)性顱內(nèi)瘤46%。雖然目前有多種治療方式，但是存在手術(shù)切除不徹底以及血腦屏障的存在導(dǎo)致化療藥物難以到達(dá)腫瘤部位等情況，故導(dǎo)致患者預(yù)后不佳。阿托伐他?。ˋVT）作為羥甲戊二酰輔酶還原酶抑制劑在臨床上被廣泛用于高膽固醇血癥的治療。新近研究證實(shí)AVT對腫多種瘤細(xì)胞，如肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞等具有顯著的抑制作用。其中AVT對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的顯著抑制作用備受臨床醫(yī)生和科研工作者的密切關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)AVT能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。

教學(xué)設(shè)計(jì)二中，培養(yǎng)學(xué)生研讀文章、生發(fā)思考并自行解決的研究能力這一目標(biāo)則將《貝多芬百年祭》視為“樣本”了，重視的是學(xué)生依據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)，在與特定的文本交往過程中形成怎樣讀、怎樣寫的方法或能力。

AVT能夠通過下調(diào)趨化因子受體4表達(dá)，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。但是目前有關(guān)AVT對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。miR-146a是一類與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)的miRNA，可以通過調(diào)控Notch1基因的表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。另外，miR-146a能夠通過介導(dǎo)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路抑制肝星狀細(xì)胞誘導(dǎo)的肝纖維化，而PI3K/Akt 信號作為膠質(zhì)瘤治療的關(guān)鍵通路，抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲。那么有關(guān)AVT 對膠質(zhì)瘤的治療作用是否涉及miR-146a/PI3K/Akt信號傳導(dǎo)尚不清楚。因此，本研究擬通過體外培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，觀察AVT能否通過調(diào)控miR-146a/PI3K/Akt信號傳導(dǎo)從而膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為，以期為臨床膠質(zhì)瘤治療提供新的理論基礎(chǔ)。

該隧道的圍巖分為三種：即V級、IV級與III級。進(jìn)口處覆蓋層實(shí)際埋深相對較淺的位置存在V級圍巖，土質(zhì)主要為紅黏土，而其他洞段主要為IV級圍巖或V級圍巖，對于IV級圍巖，主要是頁巖夾砂巖，少見土石交界與紅黏土，而III級圍巖以砂巖及頁巖為主。V級圍巖分布在DK501+826—DK502+076段落，該段覆土層厚度相對較小，且隧道整體埋深也很小，局部不超過3m，建有大量房屋?，F(xiàn)圍繞本隧道實(shí)際情況，對其淺埋段地表深層注漿加固技術(shù)進(jìn)行深入分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，購自中科院上海分院細(xì)胞庫。

1.2.5 式細(xì)胞術(shù)檢測U251細(xì)胞凋亡率 胰蛋白酶消化處理后得到各組U251，加入磷酸鹽緩沖溶液將細(xì)胞密度調(diào)控為1×10/mL；移液槍吸取200 μL的細(xì)胞懸液放于反應(yīng)管內(nèi)，之后加入Annexin V-FITC和PI各5 μL；充分混勻，避光環(huán)境下反應(yīng)15 min；流式細(xì)胞儀檢測各組U251凋亡情況。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

與Control 組相比，AVT 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（＜0.01）。與AVT組相比，AVT+miR-146a inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯降低（＜0.01），AVT+miR-146a NC組細(xì)胞凋亡率無顯著性變化（＞0.05，圖3）。

1.2.1 U251細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251采用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（含有10%的胎牛血清），并放置于37 ℃，5%CO的培養(yǎng)箱內(nèi)，細(xì)胞貼壁生長24～48 h，生長融合度達(dá)到90%左右，0.25%的胰酶消化處理，待細(xì)胞呈現(xiàn)卵圓形時(shí)終止消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。期間每個(gè)24 h細(xì)胞換液處理1次。

為了引導(dǎo)員工認(rèn)清任務(wù)重點(diǎn)，高效達(dá)成績效指標(biāo)，選擇適合中小企業(yè)掌握的主觀經(jīng)驗(yàn)法和各級指標(biāo)配對比較的方式，通過借鑒各類企業(yè)對不同崗位知識型員工的權(quán)重設(shè)置，在此期間始終結(jié)合公司的經(jīng)營重點(diǎn)并收集員工意見，對初步確定的指標(biāo)權(quán)重經(jīng)過多次合理變更，最終形成規(guī)范的指標(biāo)體系。

1.2 方法

1.1.3 主要儀器 TWK-FST32型組織勻漿儀（武漢泰普拓公司）；Micro17R型高速冷凍離心機(jī)［賽默飛世爾科技(中國)有限公司］；GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡（Nikon）；FC型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)檢測儀［賽默飛世爾科技(中國)有限公司］；1658033型電泳儀（Bio-Rad）；ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2.2 U251細(xì)胞給藥與分組 實(shí)驗(yàn)分為4組，即對照組（Control）、阿托伐他汀組（AVT）、阿托伐他汀+轉(zhuǎn)染miR-146a無關(guān)片段組（AVT+miR-146a NC）和阿托伐他汀+轉(zhuǎn)染miR-146a干擾組轉(zhuǎn)染（AVT+miR-146a inhibitor）。其中VAT組細(xì)胞加入終濃度為8.0 μmol/L 的VAT，AVT+miR-146a NC組和AVT+miR-146a inhibitor組轉(zhuǎn)染miR-146a無關(guān)片段和miR-146a inhibitor 24 h后，加入8.0 μmol/L AVT處理48 h。Control組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不加入藥物處理。

1.2.3 RT-PCR檢測miR-146a表達(dá) 依據(jù)RNA提取試劑盒說明書步驟提取U251細(xì)胞總RNA，并運(yùn)用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度與純度。以RNA為模板，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。再以cDNA為模板，根據(jù)廣州銳博公司設(shè)計(jì)合成的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：92 ℃30 s；92 ℃5 s；60 ℃31 s，共進(jìn)行31個(gè)循環(huán)。采用7300 System SDS Software分析數(shù)據(jù)，根據(jù)2值相對定量樣本中目的基因表達(dá)水平。miR-146a引物序列如下：正義鏈：F：5'-GGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3'；反義鏈：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。U6引物序列如下：正義鏈：5'-CCTCACTGTCCACCTTCCA-3'；反義鏈：5'-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3'。

與Control組比較，AVT組細(xì)胞miR-146a相對表達(dá)量顯著增加（＜0.01）；與AVT組相比，AVT+miR-146a inhibitor組細(xì)胞miR-146a相對表達(dá)量降低（＜0.01），AVT+miR-146a NC組細(xì)胞miR-146a相對表達(dá)量無顯著變化（＞0.05，圖1）。

1.1.2 藥品與主要試劑 阿托伐他?。⊿igma）；RT-PCR檢測試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；二辛可寧酸（BCA）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；牛血清白蛋白（BSA）（上海碧云天生物技術(shù)公司）；胎牛血清（FBS）（Gibco）；噻唑蘭（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Transwell檢測試劑盒（Corning）；轉(zhuǎn)染試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；p-PI3K抗體（Abcam）；PI3K抗體（Abcam）；p-Akt抗體（Abcam）；Akt抗體（Abcam）；一抗、二抗稀釋液（上海碧云天生物技術(shù)公司）；山羊抗兔二抗（上海碧云天生物技術(shù)公司）；山羊抗小鼠二抗（上海碧云天生物技術(shù)公司）；顯影液（碧云天生物技術(shù)公司）；miR-146a引物設(shè)計(jì)與合成（上海生工生物工程股份有限公司）。

與Control組比較，AVT組細(xì)胞細(xì)胞增殖率顯著降低（＜0.05）；與AVT組相比，AVT+miR-146a inhibitor組細(xì)胞增殖率顯著升高（＜0.01），AVT+miR-146a NC組細(xì)胞增殖無顯著變化（＞0.05，圖2）。

1.2.7 Western blot檢測PI3K/Akt信號通路蛋白相對表達(dá)量 收集各組細(xì)胞；4 ℃條件下裂解30 min，期間每隔5 min震蕩1次；BCA法測定蛋白質(zhì)濃度；上樣（按照每孔上樣量30 μg得出上樣體積）；凝膠電泳；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜；5%BSA室溫封閉2 h，孵育對應(yīng)抗體p-PI3K（1∶1000），PI3K（1∶1000）p-Akt（1∶1000），Akt（1∶1000）以及β-actin（1∶2000），4 ℃過夜，孵育對應(yīng)的羊抗兔二抗體或者羊抗鼠二抗體（1∶5000）1～2 h；搖床搖晃上加TPBS 洗滌3次，5 min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)水平以目的蛋白條帶灰度值與β-actin灰度值相比反映。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞miR-146a相對表達(dá)量比較

1.2.4 MTT檢測細(xì)胞增殖率 將消化后的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251按照96孔板密度為：1×10/孔接種，按照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行相關(guān)處理，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)6次，每孔加入MTT溶液10 μL（5 mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄去細(xì)胞上清，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO）震蕩10 min，使得充分溶解，利用酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度，以吸光度值反應(yīng)細(xì)胞的增殖活力。細(xì)胞增殖率（%）=各處理組細(xì)胞/對照組值×100%。

2.2 各組細(xì)胞增殖率比較

1.2.6 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲和遷移率 侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell小室（24孔，孔徑5.0 μm）的濾膜采用ECM gel覆蓋，小室加入0.5 mL內(nèi)含10%FBS培養(yǎng)基，對上室中加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸液，200 μL/孔，2×10/L，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h，4%的多聚甲醛固定，HE染色，400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察穿過膜細(xì)胞平均數(shù)。U251細(xì)胞侵襲率=（各處理組侵襲細(xì)胞數(shù)/對照組侵襲細(xì)胞數(shù)）×100%。遷移實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞常規(guī)處理，1000 r/min離心5 min，細(xì)胞重懸并計(jì)數(shù)；將小室放置于24孔板內(nèi)，并于下室加入完全培養(yǎng)基（含有10%FBS），小室的上室中加入1×10細(xì)胞，保證下部小室膜與培養(yǎng)基無氣泡，之后將24孔板防治培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)板后磷酸鹽緩沖溶液潤洗小室并擦拭上室殘留細(xì)胞，多聚甲醛固定約15 min，最后使用0.1%的結(jié)晶紫染色，洗滌、風(fēng)干，于400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。遷移指數(shù)=（各處理組遷移細(xì)胞數(shù)/對照組遷移細(xì)胞數(shù)）×100%。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率比較

由表6可知，當(dāng)油炸時(shí)間為2 min時(shí)，牛肉丁的組織狀態(tài)干硬適中而且緊密，色澤具有牛肉丁應(yīng)有的棕紅色色澤，有彈性，口感軟硬合適，外焦內(nèi)嫩。但是，當(dāng)油炸時(shí)間低于2 min時(shí)，牛肉丁未能脫水徹底，色澤偏淺；當(dāng)油炸時(shí)間大于2.5 min時(shí)，太過干硬，色澤發(fā)深，并且油炸時(shí)間過長，風(fēng)味和營養(yǎng)成分等有所散失。因此，通過對油炸時(shí)間的單因素分析，得出最佳油炸時(shí)間為2 min。

讀名著需要興趣，更需要毅力；復(fù)習(xí)名著需要引導(dǎo)，更需要方法。從“縱讀”、“橫讀”、“反讀”、“細(xì)讀”四個(gè)方面入手，可以引導(dǎo)學(xué)生讀得更深，在名著閱讀的路上走得更遠(yuǎn)。

2.4 各組細(xì)胞侵襲率和遷移率比較

與Control組相比，AVT組細(xì)胞侵襲率和遷移率均明顯降低（＜0.01）。與AVT組相比，AVT+miR-146a inhibitor組細(xì)胞侵襲率和遷移率均明顯升高（＜0.01），AVT+miR-146a NC組細(xì)胞侵襲率和遷移率無顯著性變化（＞0.05，圖4）。

在學(xué)前兒童體育游戲創(chuàng)編活動(dòng)設(shè)計(jì)中增加一些對抗類游戲，可活躍學(xué)前兒童大腦因子，刺激他們智力與體能的共同發(fā)展，實(shí)現(xiàn)全面發(fā)展目標(biāo)。

2.5 各組細(xì)胞PI3K/Akt信號通路蛋白相對表達(dá)量比較

與Control組相比，AVT組細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)均明顯降低（＜0.01）。與AVT 組相比，AVT+miR-146a inhibitor組細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)均明顯升高（＜0.01），AVT+miR-146a NC組細(xì)胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)無顯著性變化（＞0.05，圖5）。

3 討論

AVT為脂溶性他汀類新藥，可以透過血腦屏障，有利于膠質(zhì)瘤臨床治療中的實(shí)際應(yīng)用。既往研究證實(shí)AVT能夠通過阻斷JNK、MMP2的表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲。另外，AVT能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞VEGF、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)從而抑制膠質(zhì)瘤球體血管生成，并最終抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。以上研究給AVT抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性病變提供了新的啟發(fā)。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性病變涉及的生物學(xué)行為主要包括細(xì)胞凋亡、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等多環(huán)節(jié)復(fù)雜的生物學(xué)過程。miRNA是一類長度約22 nt的小分子非編碼RNA，眾多研究數(shù)據(jù)表明miRNA參與了包括腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)過程。因此，在腫瘤細(xì)胞研究中miRNA的生物學(xué)過程也是科研人員研究的熱點(diǎn)之一。miR-146a是位于人的5號染色體中miR-146中的一類。研究表明與癌旁組織相比，膠質(zhì)瘤癌組織中miR-146a表達(dá)顯著降低，轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長。另外，miR-146a能夠靶向抑制SMAD4基因表達(dá)，參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移。上述研究表明miR-146a在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。另外，既往研究也顯示AVT 能夠通過調(diào)控miR-146a抑制間充質(zhì)干細(xì)胞遷移。本研究首先通過RT-PCR檢測AVT對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-146a表達(dá)的影響。結(jié)果顯示AVT能夠促進(jìn)miR-146a表達(dá)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為檢測顯示AVT能夠抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步明確AVT通過調(diào)控miR-146a表達(dá)，從而影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitor，結(jié)果顯示AVT+miR-146a inhibitor組細(xì)胞miR-146a表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖，遷移和侵襲指數(shù)降低，凋亡增加，表明AVT是通過促進(jìn)miR-146a表達(dá)，發(fā)揮人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為調(diào)控作用。那么有關(guān)miR-146a下游的調(diào)控機(jī)制又是如何呢？以往研究證實(shí)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性病變中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。另外，PI3K/Akt信號通路的激活能夠促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶2表達(dá)增加，活性增強(qiáng)，從而介導(dǎo)細(xì)胞外基底膜膠原降解，并最終促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞向外周圍浸潤，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，表明PI3K/Akt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為變化中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。但是目前有關(guān)miR-146a/PI3K/Akt信號在AVT抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用及其調(diào)控關(guān)系尚不清楚。本研究通過Western blot檢測顯示AVT組細(xì)胞p-PI3K、p-Akt表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitor后p-PI3K、p-Akt表達(dá)升高，細(xì)胞增殖，遷移和侵襲指數(shù)增加，凋亡降低。表明AVT能夠通過促進(jìn)miR-146a表達(dá)抑制PI3K/Akt信號，從而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為。以往研究證實(shí)miR-146a可以通過抑制PI3K/Akt信號通路促進(jìn)心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡。miR-146a能夠負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號促進(jìn)甲狀腺濾泡狀癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。在骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中PI3K基因的3'-UTR是miR-146a的靶點(diǎn)，而PI3K蛋白和mRNA表達(dá)以及下游Akt的激活在轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后明顯降低。本研究結(jié)果與既往研究共同表明miR-146a能夠負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究通過探究AVT對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其對miR-146a/PI3K/Akt信號通路的作用。結(jié)果顯示AVT能夠抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)控miR-146a/PI3K/Akt信號通路相關(guān)。以上研究結(jié)果初步證實(shí)了AVT對膠質(zhì)瘤的抑制作用及其可能的作用機(jī)制。但是本研究存在一定的局限性，即未在臨床上研究AVT對膠質(zhì)瘤患者的治療效果及對miR-146a/PI3K/Akt的影響。在后續(xù)的研究中將通過探究AVT對膠質(zhì)瘤患者的影響，以期為臨床治療提供更多的分子機(jī)制。