鼻腔粘液纖毛傳輸系統(tǒng)由呼吸道表面的黏液痰及其下方的纖毛上皮層組成。通過(guò)建立人類原代上皮細(xì)胞的體外模型，以及探究介導(dǎo)上皮細(xì)胞功能變化的潛在機(jī)制，對(duì)于研究呼吸道上皮在微生物感染或吸入劑作用下的關(guān)鍵功能至關(guān)重要。氣液界面（ALI）培養(yǎng)的細(xì)胞在功能和結(jié)構(gòu)上均貼近體內(nèi)呼吸道上皮細(xì)胞的自然生長(zhǎng)狀態(tài)，為研究呼吸道上皮的功能和相關(guān)疾病奠定了良好的基礎(chǔ)。

有研究討論了上呼吸道原代培養(yǎng)的方法，然而均無(wú)法做到長(zhǎng)期體外培養(yǎng)及以及維持原代細(xì)胞的分化能力。類器官是體外3D培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞，通過(guò)自我更新自我組織形成具有類似于來(lái)源器官組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能及遺傳學(xué)特征的培養(yǎng)物。目前正常組織類器官主要來(lái)源于成體干細(xì)胞（包括祖細(xì)胞）及多能干細(xì)胞。與誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和多能干細(xì)胞（PSC）衍生的類器官發(fā)育模型相反，成體干細(xì)胞（ASC）衍生的上皮類器官概括了人體內(nèi)正常組織的損傷修復(fù)作用。目前，基本上所有ASC派生的類器官類型僅代表器官的上皮部分，并且不存在細(xì)胞間基質(zhì)，神經(jīng)和脈管系統(tǒng)。因此，ASC衍生的類器官在結(jié)構(gòu)上比PSC衍生的類器官具有更低的復(fù)雜性，原則上可以來(lái)自任何個(gè)體，衍生的類器官能夠在體外長(zhǎng)期擴(kuò)增，同時(shí)保持遺傳穩(wěn)定性。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)鼻粘膜類器官的研究主要用作疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究。未見使用Hans Clevers這一培養(yǎng)體系的鼻粘膜類器官的報(bào)道，本研究首次采用“擴(kuò)增-分化”分段式培養(yǎng)法培養(yǎng)分化可控的鼻粘膜類器官，體外模擬鼻粘膜上皮的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，以期為上呼吸道功能、相關(guān)疾病研究及病毒感染的基礎(chǔ)研究提供理想平臺(tái)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

本研究有關(guān)人鼻息肉及中鼻甲的實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)的監(jiān)督指導(dǎo)下完成（倫理批件號(hào)：NFSC-2020-157）。人鼻息肉及中鼻甲組織的獲取已獲得患者的知情同意。人鼻息肉組織及中鼻甲組織取自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院鼻科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)切除的慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉患者。

1.2 主要試劑和耗材

Transwell 板、鼠尾I型膠原（Corning）；IV型膠原酶、III型膠原酶（Worthington）；DNA酶、透明質(zhì)酸酶、分散酶、抗β-tubulin（sigma）；抗AE1/AE3、抗MUC5AC、抗P63抗體、山羊抗兔及兔抗鼠二抗（Abcam）。

比如，在實(shí)際的教學(xué)過(guò)程中，教師可以按照教學(xué)內(nèi)容，將其劃分成“寫作模塊”以及“閱讀模塊”，隨后教師可以在模塊中進(jìn)行細(xì)分，在閱讀模塊中，還可以存在以下幾種分支：閱讀理解、閱讀識(shí)字、文章分析以及結(jié)構(gòu)劃分等。

1.3 混合膠的配制

先 將100 μL 1X DMEM 與1 mL Advanced DMEM/F12混合，再加入875 μL I型膠原，最后加入15 μL 1 mol/L無(wú)菌NaOH溶液,至此，該混合物稱為混合膠原溶液，于4 ℃保存。將250 μL混合膠原溶液倒入transwell小室里的12 mm直徑的內(nèi)皿中，在37 ℃培養(yǎng)箱中固化30 min，備用。

1.4 類器官培養(yǎng)基的配制

不含Vit-A的B27，1×；N-acetylcysteine 1 mmol/L；EGF 50 ng/mL；Noggin 100 ng/mL；R-spondin1 250 ng/mL；Wnt3a 250 ng/mL；A83-01 500 nmol/L；Nicotinamide 10 mmol/L；Y-27632 10 μmol/L；Glutamax 1×；Gastrin 5 nmol/L；SB202190 10 μmol/L；青霉素鏈霉素混合液1×；IL-6 50 ng/mL；HEPES 1 mmol/L。

1.5 人鼻腔纖毛上皮細(xì)胞分離及培養(yǎng)

用含2%雙抗的HBSS溶液震蕩洗滌鼻息肉或中鼻甲手術(shù)剩余組織3～5次后將其置于冰上剪切至0.5 mm3以下。加入適量消化酶1（III型膠原酶300 U/mL+透明質(zhì)酸酶0.1 mg/mL溶于DMEM/F12），37 ℃恒溫消化2 h后再加入適量消化酶2（DNA酶5 mg/mL+分散酶5 mg/mL DMEM/F12）消化10 min，1500 r/min離心3 min，棄上清，加入HBSS溶液重懸。用100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾得鼻粘膜上皮細(xì)胞。用紅細(xì)胞裂解液去除其中的紅細(xì)胞，離心后將細(xì)胞沉淀等分為2組：連續(xù)“擴(kuò)增”培養(yǎng)組（EO組）及“擴(kuò)增-分化”分段培養(yǎng)組（DO組），分別加入預(yù)先配制的混合膠中鋪于上述備用的Transwell內(nèi)皿中，外皿中加入類器官培養(yǎng)基，置于37 ℃細(xì)胞孵箱中。EO組加入鼻粘膜類器官培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d，DO組加入鼻粘膜類器官培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后換為分化培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)基隔天更換1次，視類器官生長(zhǎng)情況進(jìn)行傳代。

1.6 光鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察

由于Transwell支持膜在濕潤(rùn)條件下呈透明狀，不產(chǎn)生自發(fā)熒光，所以不影響光學(xué)顯微鏡和熒光染色等技術(shù)手段對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察。光鏡下觀察并記錄鼻粘膜類器官生長(zhǎng)及分化過(guò)程。

1.7 短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）檢測(cè)

獲取需要進(jìn)行鑒定的來(lái)源組織及衍生的類器官后提取細(xì)胞DNA，通過(guò)多色熒光體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，DNA片段分離熒光信號(hào)檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析后導(dǎo)出基因分析圖譜，將受檢鼻粘膜類器官STR位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)與其對(duì)應(yīng)的來(lái)源組織基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)并分析結(jié)果。若兩者匹配度EV≥80%，則判定鼻粘膜類器官為來(lái)源組織的衍生培養(yǎng)物；若兩者匹配度56%＜EV＜80%，建議結(jié)合鼻粘膜類器官形態(tài)、各細(xì)胞群特異性分子標(biāo)記物鑒定等輔助手段進(jìn)行綜合判斷；若兩者匹配度EV≤56%，則判定鼻粘膜類器官與其對(duì)應(yīng)的來(lái)源組織不相關(guān)。

1.8 鼻粘膜類器官免疫組化染色

取兩組培養(yǎng)21 d的類器官固定于4%福爾馬林溶液中12 h，石蠟包埋，制成4 μm厚的切片，脫蠟水化后加入枸櫞酸鹽溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，再加封閉液（4%BSA+0.5%Triton），封閉1 h。敷一抗，4 ℃過(guò)夜，第2天PBS洗5 min/3 次，37 ℃條件下敷二抗1 h。PBS 沖洗后DAB顯色5～30 s，在顯微鏡下掌握染色程度。蘇木精復(fù)染5 min，鹽酸酒精分化2 s，流水沖洗15 min（返藍(lán)）。最后切片經(jīng)乙醇-二甲苯梯度脫水，在通風(fēng)櫥自然晾干再封片、鏡檢。每組染色均設(shè)立陰性對(duì)照（PBS液代替一抗），設(shè)立鼻粘膜組織為陽(yáng)性對(duì)照。所有切片采用盲法由3名高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立判定。

人才匱乏，已經(jīng)成為印刷業(yè)發(fā)展的制約瓶頸。癥結(jié)何在？出路何在？發(fā)展中的問(wèn)題只能在發(fā)展中解決，辦法總比困難多。

納入該院收治的糖尿病骨折76例，采用數(shù)字抽選法將其分為對(duì)照組和研究組各38例。其中常規(guī)組38例患者，男24例，女 14例，年齡45～67歲，平均年齡（56.02±5.41）歲，糖尿病病程 3～11 年，平均（6.98±1.51）年，下肢骨折25例，髖骨骨折13例；研究組38例患者，男 22 例，女 16 例，年齡 47～63 歲，平均年齡（55.41±5.23）歲，糖尿病病程 2～13 年，平均（7.56±2.14）年，下肢骨折27例，髖骨骨折12例。對(duì)比兩組患者性別、年齡及糖尿病病程一般資料后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組護(hù)理結(jié)果具有可比性。

誘導(dǎo)分化后的鼻粘膜類器官PAS染色呈陽(yáng)性結(jié)果，染色部位主要位于鼻粘膜類器官中的杯狀細(xì)胞（圖8）。

關(guān)于“霍李比武”的事，具體發(fā)生在何時(shí)已經(jīng)不可靠了，只知道肯定是在1900-1909年之間。在金恩鐘先生所著的《國(guó)術(shù)名人錄》一書中有關(guān)于霍元甲與李瑞東比武的描述：

類器官培養(yǎng)基主要細(xì)胞因子：R-Sponding1、Noggin、不 含Vit A 的B27、A83-01、SB202190（peprotech）、N-acetylcysteine、Nicotinamide（sigma）等；分化培養(yǎng)基：PneumaCult-ALI medium(STEMCELL)。

1.9 掃描及透射電鏡觀察

將兩組培養(yǎng)21 d的人鼻粘膜類器官連同Transwell支持膜一同切下并用2.5%的戊二醛固定，由南方醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室電鏡室常規(guī)制作電鏡標(biāo)本，JEOL JSM石000F型掃描電鏡下拍攝照片，觀察細(xì)胞形態(tài)及分化情況。

1.10 過(guò)碘酸雪夫（PAS）染色

ALI培養(yǎng)第21天，掃描電鏡可見鼻粘膜類器官細(xì)胞表面覆蓋微絨毛或纖毛，細(xì)胞間緊密連接，透射電鏡可見微絨毛或纖毛的超微結(jié)構(gòu)。DO組觀察到纖毛上皮細(xì)胞分化良好，成簇狀分布，鼻粘膜類器官具有纖毛功能（圖5A、B）；EO組觀察到纖毛上皮細(xì)胞分化程度低下，表面以微絨毛分布居多（圖5C、D）。將EO組與DO組培養(yǎng)第21天的鼻粘膜類器官分別制成石蠟切片后，免疫組化染色顯示，相比EO組，DO組類器官纖毛細(xì)胞數(shù)［(7.95±1.81)%(27.04±5.91)%，＜0.05］及杯狀細(xì)胞數(shù)［(14.46±0.93)%(39.85±5.43)%，＜0.05）］占比更大，基底細(xì)胞占比無(wú)明顯差異［(56.91±14.12)%(53.42±15.77)%，＞0.05，圖6、7）］。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

在EO組、DO組各選取至少3個(gè)樣本中任意100個(gè)類器官記錄其在培養(yǎng)第7天及第16天的空泡類器官數(shù)。培養(yǎng)第7天，兩組大多為“實(shí)心”細(xì)胞團(tuán)，DO組與EO組類器官空泡數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；培養(yǎng)第16天，DO組大多為“空心”細(xì)胞團(tuán)（類器官空泡數(shù)為54.67±13.26），EO組大多為“實(shí)心”細(xì)胞團(tuán)（類器官空泡數(shù)為21.67±8.57），DO組空泡數(shù)比例大于EO組，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，圖3）。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下鼻粘膜類器官的生長(zhǎng)形態(tài)變化

EO組：光鏡連續(xù)拍照可見在整個(gè)干性培養(yǎng)過(guò)程中，鼻粘膜類器官一直處于“低分化”干性增殖狀態(tài)（圖1）。起初鼻粘膜類器官中空結(jié)構(gòu)逐漸減小，上皮細(xì)胞不斷擴(kuò)增，形成邊緣清晰且致密的細(xì)胞團(tuán)后直徑逐漸增大。選取至少3個(gè)樣本中任意60個(gè)類器官記錄，其在培養(yǎng)第16天的直徑（176.97±10.14 μm）為第7天（80.40±17.54 μm）的2倍左右。

DO組：光鏡連續(xù)拍照可見鼻粘膜類器官近似呈圓球形（圖2），在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中直徑不斷增大，選取同上相應(yīng)樣本中任意60個(gè)類器官記錄，其在培養(yǎng)第16天的直徑（138.05±10.00 μm）為第7天（77.47±16.09 μm）的1.5倍左右。7 d干性培養(yǎng)期內(nèi)，起初成活的上皮細(xì)胞不斷擴(kuò)增生長(zhǎng)形成邊緣清晰的致密細(xì)胞團(tuán)。分化培養(yǎng)初期，內(nèi)部漸呈現(xiàn)類似腺腔的中空結(jié)構(gòu)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，分化程度增加，細(xì)胞極性增加。類器官中空結(jié)構(gòu)不斷增大，伴有細(xì)胞分泌或壞死物質(zhì)，逐漸形成排列規(guī)則的環(huán)狀壁,內(nèi)緣出現(xiàn)類似刷狀緣結(jié)構(gòu)（圖2）。

全部埋入型孤石的受力情況如圖10所示，計(jì)算基本假定與部分出露孤石相同，僅多假設(shè)了邊坡整體失穩(wěn)前，孤石B在周圍土體內(nèi)部無(wú)旋轉(zhuǎn)性。

比較EO組、DO組培養(yǎng)第7天、第16天類器官空泡數(shù)比例，以及培養(yǎng)第21天兩組間類器官中所包含的各細(xì)胞類群比例。使用SPSS26.0 軟件及GraphPad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

國(guó)務(wù)院扶貧辦、中國(guó)人民銀行等部門有關(guān)負(fù)責(zé)同志在論壇上發(fā)言。全國(guó)脫貧攻堅(jiān)獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)?wù)叽?，以及中?guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院、湖南省永順縣等有關(guān)負(fù)責(zé)人介紹了產(chǎn)業(yè)扶貧的經(jīng)驗(yàn)做法。

2.2 人鼻粘膜類器官來(lái)源性檢測(cè)

將人鼻粘膜類器官與其來(lái)源組織同時(shí)進(jìn)行STR檢測(cè)，結(jié)果顯示：來(lái)源組織細(xì)胞中無(wú)三等位基因或四等位基因，未發(fā)現(xiàn)受到其他人類細(xì)胞系污染；衍生的鼻粘膜類器官中無(wú)三等位基因或四等位基因，未發(fā)現(xiàn)受到其他人類細(xì)胞系污染。鼻粘膜類器官的等位基因與來(lái)源組織細(xì)胞的等位基因匹配度EV為100%（圖4，表1）。

2.3 體外3D培養(yǎng)的鼻粘膜類器官的鑒定及纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞分化情況

鼻粘膜類器官石蠟切片烤片脫蠟后；PAS 滴染20 min；自來(lái)水沖洗10 min；Schiff氏液10 min；流水沖洗5 min；蘇木素染核8 min（細(xì)胞核染色過(guò)深可用鹽酸酒精分化）；流水沖洗5 min；常規(guī)脫水、透明、封固。

式中，Yit=(LNLCCCit,LNPgdpit,LNLIIVit)T表示第i個(gè)城市第t年的3×1維內(nèi)生變量，即土地綜合承載力變量、人均GDP變量、地均第二、第三產(chǎn)業(yè)增加值變量。其中，i表示城市；j表示滯后期數(shù)；t表示年份。Yi,t-j表示滯后j期的變量；α0表示截距項(xiàng);αj表示滯后期系數(shù)矩陣;φi表示固定效應(yīng)向量;φit表示時(shí)間效應(yīng)向量;γit表示隨機(jī)誤差向量。

2.4 人鼻粘膜類器官分泌功能的鑒定

定性結(jié)果判定：凡是在鼻粘膜細(xì)胞質(zhì)、胞核和胞膜內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒均判定為陽(yáng)性；半定量結(jié)果判定：所有切片采用盲法由2名高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立判定。鏡下觀察，出現(xiàn)棕褐色染色即判定為陽(yáng)性結(jié)果，鏡下隨機(jī)選擇切片中5個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野統(tǒng)計(jì)150細(xì)胞，分別計(jì)算β-tubulin、MUC5AC、p63染色陽(yáng)性的細(xì)胞比例，近似為該細(xì)胞類群所占比例，至少完成3個(gè)生物樣本實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。染色陽(yáng)性的細(xì)胞比例≤25%為弱陽(yáng)性，26%～50%為陽(yáng)性，≥51%為強(qiáng)陽(yáng)性。

2.5 不同取材部位組織衍生的鼻腔呼吸區(qū)粘膜類器官的對(duì)比

鼻息肉、中鼻甲衍生的鼻腔呼吸區(qū)粘膜類器官經(jīng)光鏡及HE染色觀察均為空泡狀細(xì)胞團(tuán)（圖9），免疫組化染色結(jié)果顯示均包含基底細(xì)胞（P63）、杯狀細(xì)胞（MUC5AC）、纖毛細(xì)胞（β-tubulin）等主要細(xì)胞組成成分（圖10），培養(yǎng)結(jié)果差異不大，考慮到倫理和樣本來(lái)源的廣泛性的問(wèn)題，本研究大多采用鼻息肉組織進(jìn)行培養(yǎng)。

3 討論

本研究成功地誘導(dǎo)了鼻粘膜類器官的分化，并開發(fā)了分化程度可控的形態(tài)和功能上高度模擬人類鼻粘膜上皮的鼻粘膜類器官模型。既往研究中，鼻粘膜體外模型主要分為2D原代細(xì)胞模型、腫瘤細(xì)胞系及器官外植體模型。盡管2D永生化細(xì)胞系可以用作體外研究呼吸道的模型，但它們無(wú)法分化成由極化纖毛和產(chǎn)生粘液的細(xì)胞共同組成的異質(zhì)細(xì)胞群，與原代細(xì)胞相比，這些細(xì)胞系表現(xiàn)出遺傳和表型差異，無(wú)法模擬體內(nèi)鼻粘膜的生理結(jié)構(gòu)及功能，從而限制了其適用性；器官外植塊培養(yǎng)技術(shù)盡管具有一定的組織結(jié)構(gòu)和分化能力，但是由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，培養(yǎng)過(guò)程中遺傳變異和不可控的環(huán)境變量，導(dǎo)致器官型外植體模型的可重復(fù)性不高。現(xiàn)有的原代細(xì)胞培養(yǎng)模型可傳代次數(shù)少的限制，需要從供體中重復(fù)收集組織，這可能會(huì)由于樣本收集中的遺傳差異或時(shí)間差異而引入生物變異性。

豐收的季節(jié)，田野的風(fēng)光如畫，田邊小徑將金色稻田分割成不同色塊，小鎮(zhèn)如同在油畫中一般。在低處，看熟透的稻穗，看到的是豐收的喜悅；在高處，看漫山翠綠、稻田金黃、潔白的房屋迎著朝陽(yáng)，看到的是希望。

與在二維環(huán)境中培養(yǎng)的常規(guī)原代細(xì)胞模型不同，類器官是由干細(xì)胞和分化細(xì)胞組成的自組織3D 細(xì)胞模型，其相對(duì)應(yīng)的“干性和功能性”，能夠很好地彌補(bǔ)以上不足。類器官來(lái)源于組織中具有分化潛能的干細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于早期發(fā)育階段，總體偏“幼稚”，與分化成熟的來(lái)源組織相比差異較大，這是制約類器官模型的一個(gè)重要缺陷。本研究圍繞干細(xì)胞增殖與分化這一矛盾，在國(guó)內(nèi)首次采用“擴(kuò)增-分化”分段式培養(yǎng)法，成功建立了一種基于ALI的鼻粘膜類器官誘導(dǎo)分化模型。該技術(shù)體系穩(wěn)定性高、可操作性強(qiáng)，大多類器官已連續(xù)培養(yǎng)1月以上仍保持良好的生物學(xué)特性。

近些年研究發(fā)現(xiàn)，呼吸道氣管粘膜上皮基底細(xì)胞可能具有干細(xì)胞的功能，這些干細(xì)胞能分化成其他粘膜上皮細(xì)胞，比如杯狀細(xì)胞、柱狀纖毛細(xì)胞和柱狀非纖毛細(xì)胞。研究結(jié)果提示，單個(gè)氣管上皮基底細(xì)胞在培養(yǎng)基中可以分化成整個(gè)粘膜上皮層，在前人研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步說(shuō)明呼吸道基底細(xì)胞具有干細(xì)胞或始祖細(xì)胞的特點(diǎn)：自我更新和分化的功能。隨著研究深入，有學(xué)者報(bào)道鼻腔呼吸上皮基底細(xì)胞可能同樣具有干細(xì)胞/始祖細(xì)胞的功能。有研究揭示了鼻腔呼吸上皮基底細(xì)胞具有分化成纖毛細(xì)胞的能力。本研究中EO組鼻粘膜類器官呈現(xiàn)一個(gè)由“空心球”轉(zhuǎn)變?yōu)椤皩?shí)心球”的過(guò)程，其根本在于所使用的類器官培養(yǎng)基為干性培養(yǎng)基，其所含細(xì)胞因子主要作用為促進(jìn)干細(xì)胞細(xì)胞增殖以及存活而不進(jìn)入分化。鼻粘膜組織經(jīng)消化后收集得到的細(xì)胞既包含假?gòu)?fù)層柱狀上皮層的纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和基底細(xì)胞也包含固有層的血管內(nèi)皮細(xì)胞和腺體細(xì)胞，因此在培養(yǎng)第1天，可在鏡下觀察到實(shí)心球和空泡狀的腺腔樣結(jié)構(gòu)。EO組鼻粘膜細(xì)胞在類器官培養(yǎng)基的作用下干性不斷增強(qiáng)，細(xì)胞不斷增殖，逐漸填滿中空結(jié)構(gòu)，直徑逐漸增大。由于兩組類器官均使用了氣液界面這一特殊培養(yǎng)體系，因此，EO組類器官也會(huì)有低程度的細(xì)胞分化，在免疫組化染色中能夠看到少量分化的纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。反之，DO組鼻粘膜類器官呈現(xiàn)一個(gè)由“實(shí)心球”轉(zhuǎn)變?yōu)椤翱招那颉钡倪^(guò)程，則是因?yàn)榍捌冢惼鞴倥囵B(yǎng)基使用期）細(xì)胞不斷增殖，直徑逐漸增大，后期（分化培養(yǎng)基使用期）細(xì)胞分化及細(xì)胞極化程度不斷增強(qiáng)，類器官逐漸形成細(xì)胞排列有序且具有纖毛功能和分泌功能的細(xì)胞團(tuán)。本研究發(fā)現(xiàn)DO組中纖毛細(xì)胞及杯狀細(xì)胞比例均明顯高于EO組，基底細(xì)胞比例沒(méi)有明顯差別，說(shuō)明“擴(kuò)增-分化”分段式培養(yǎng)出的類器官能夠維持良好的干細(xì)胞分化能力，同時(shí)分化程度更高，功能更加完善。有文獻(xiàn)研究的肺類器官“干性-分化”培養(yǎng)組纖毛細(xì)胞比例明顯高于“干性”培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MUC5AC表達(dá)高于“干性”培養(yǎng)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究與該研究結(jié)果趨勢(shì)基本一致。

除了鼻粘膜類器官的結(jié)構(gòu)，還需對(duì)其功能進(jìn)行鑒定。在光鏡下可觀察到膠滴中DO組鼻粘膜類器官在纖毛的擺動(dòng)作用下圍繞著一個(gè)方向持續(xù)旋轉(zhuǎn)，在掃描和透射電鏡中觀察到，DO組具有明顯的纖毛結(jié)構(gòu)。這表明“擴(kuò)增-分化”分段式培養(yǎng)的鼻粘膜類器官具有近似于鼻粘膜組織中的纖毛柱狀上皮細(xì)胞纖毛擺動(dòng)的功能，通過(guò)PAS糖原染色證明“擴(kuò)增-分化”分段式培養(yǎng)的鼻粘膜類器官具有近似于鼻粘膜組織中的杯狀細(xì)胞的分泌功能。

考慮到倫理和樣本來(lái)源廣泛性的問(wèn)題，本研究最先采用樣本來(lái)源最為廣泛的鼻內(nèi)鏡手術(shù)新鮮組織進(jìn)行鼻粘膜類器官培養(yǎng)。其中，鼻息肉手術(shù)剩余組織標(biāo)本在臨床上多見，而中鼻甲、下鼻甲等鼻粘膜來(lái)源的手術(shù)標(biāo)本較少見；此外，無(wú)論息肉還是正常鼻粘膜組織，所包含的基底細(xì)胞多向分化、自我更新和自組織潛能并未遭受破壞。在體外去除炎性因子及減弱感染性因素等微環(huán)境影響的干細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)，通過(guò)wnt/β-catenin信號(hào)通路激活以及培養(yǎng)基各種細(xì)胞因子的協(xié)同調(diào)控，基底細(xì)胞將經(jīng)歷重新分化過(guò)程，自我組裝形成具有類似鼻粘膜組織結(jié)構(gòu)的3D細(xì)胞產(chǎn)物。本研究發(fā)現(xiàn)從鼻息肉取材經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的類器官與中鼻甲取材的相對(duì)正常的粘膜組織培養(yǎng)出的鼻粘膜類器官相比，兩者鑒定結(jié)果差別不大，均包含鼻粘膜上皮中幾種主要細(xì)胞類型如基底細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、纖毛細(xì)胞。于是，本研究大多以鼻息肉組織作為樣本來(lái)源進(jìn)行培養(yǎng)。

綜上所述，本研究對(duì)人鼻粘膜類器官?gòu)牟±韺W(xué)、分子生物學(xué)等不同層面進(jìn)行鑒定，證明其具有近似于鼻粘膜組織結(jié)構(gòu)及功能，并且“擴(kuò)增-分化”分段式培養(yǎng)的鼻粘膜類器官成熟度更高。為人鼻粘膜類器官模型后續(xù)用于鼻粘膜纖毛功能、分泌功能，損傷修復(fù)機(jī)制，干細(xì)胞激活，腫瘤發(fā)生等機(jī)制及上呼吸道相關(guān)疾病的研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。