盧安，王向宇，閆儀，王堅(jiān)成

（北京大學(xué)藥學(xué)院，北京 100191）

基因療法是一種富有前景的臨床疾病治療策略。它能夠以特定序列的方式靶向致病基因，對(duì)各種危及生命的疾病進(jìn)行更加精準(zhǔn)和個(gè)性化的治療[1]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中內(nèi)源性RNA干擾（RNA interference，RNAi）途徑能夠精確調(diào)節(jié)胞內(nèi)的基因表達(dá)。小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）作為RNAi療法的經(jīng)典工具之一，能夠“沉默”具有互補(bǔ)序列的特定基因的表達(dá)，從而用于特定疾病的治療[2]。目前已有3款siRNA藥物獲得美國(guó)食品和藥品監(jiān)督 管 理 局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)上市，包括patisiran（商品名：Onpattro），givosiran（商品名：Givlaari），lumasiran（商品名：Oxlumo）；另外還有數(shù)十款siRNA藥物處于臨床試驗(yàn)階段[3]。目前已獲批上市及處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)的siRNA藥物見(jiàn)表1。與小分子藥物或單克隆抗體藥物相比，siRNA通過(guò)與靶標(biāo)基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)方式結(jié)合并發(fā)揮基因沉默效應(yīng)；小分子和單克隆抗體藥物則需要識(shí)別特定蛋白的復(fù)雜空間構(gòu)象，并與其特異性結(jié)合才能發(fā)揮作用[4]。許多疾病因無(wú)法找到高活性、高親和力以及特異性的靶標(biāo)位點(diǎn)，而無(wú)法通過(guò)小分子和單克隆抗體藥物進(jìn)行治療。然而，siRNA具有靶向任意基因的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，這一特點(diǎn)使其開(kāi)發(fā)周期變得更短，治療應(yīng)用范圍變得更廣，尤其針對(duì)目前臨床上難治性疾病和遺傳性疾病的治療，具有比小分子藥物或單克隆抗體藥物更加顯著的優(yōu)勢(shì)[5]。

表1 已獲批上市及處于Ⅲ期臨床試驗(yàn)的siRNA藥物Table 1 siRNA drugs approved for clinical use or undergoing phase III clinical trial

為實(shí)現(xiàn)siRNA藥物的臨床轉(zhuǎn)化，研究者在核酸化學(xué)、分子藥劑學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、基因組學(xué)、免疫學(xué)等方面進(jìn)行深入探索[6]。除通過(guò)化學(xué)修飾的手段對(duì)siRNA藥物的穩(wěn)定性、免疫原性、脫靶效應(yīng)等問(wèn)題進(jìn)行改善之外，安全有效的遞送載體設(shè)計(jì)成為siRNA藥物成功應(yīng)用于體內(nèi)疾病治療的關(guān)鍵因素[7]。遞送載體可以直接影響siRNA到達(dá)靶細(xì)胞中發(fā)揮效應(yīng)以及基因沉默效率[8]。此外，遞送載體所含輔料成分的安全性及毒性是決定siRNA治療窗口的另一個(gè)重要因素。因此，探索和開(kāi)發(fā)高效安全的siRNA遞送系統(tǒng)是目前siRNA成藥及其產(chǎn)業(yè)化的重要研究目標(biāo)[9]。本文結(jié)合siRNA體內(nèi)應(yīng)用過(guò)程中的生物學(xué)屏障特點(diǎn)，分析各類非病毒載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、功能特征、遞送效率及臨床轉(zhuǎn)化潛力，探討其從實(shí)驗(yàn)室走向臨床的有效路徑。

1 RNA干擾療法的發(fā)展歷史

盡管多款siRNA藥物已經(jīng)獲得批準(zhǔn)上市，但RNAi療法的發(fā)展還是經(jīng)歷了許多起伏。圖1描述了RNAi療法的發(fā)展歷程[10]。1998年，Craig Mello等研究人員利用雙鏈RNA有效地沉默了秀麗隱桿線蟲(chóng)中的靶基因表達(dá)，首次創(chuàng)造了“RNAi”概念。3年后，Thomas Tuschl等研究人員證明了化學(xué)合成的siRNA能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效的基因沉默。這標(biāo)志著RNAi開(kāi)始轉(zhuǎn)向藥學(xué)方面的研究。由OPKO Health公司開(kāi)發(fā)的siRNA治療藥物bevasiranib于2004年成為首次進(jìn)入第1階段臨床研究的候選藥。此后，該領(lǐng)域迎來(lái)了蓬勃的發(fā)展。2006年，RNAi發(fā)現(xiàn)者Andrew Fire和Craig Mello獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，這進(jìn)一步吸引了來(lái)自基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和制藥行業(yè)的大量研究團(tuán)隊(duì)和資金。2008—2012年，siRNA藥物的開(kāi)發(fā)面臨穩(wěn)定性差、潛在的免疫原性、攝取率低以及缺乏理想的藥物遞送系統(tǒng)等成藥方面的問(wèn)題；加之2008年全球經(jīng)濟(jì)環(huán)境的影響，siRNA藥物的研究開(kāi)發(fā)一度處于艱難發(fā)展時(shí)期。然而，該領(lǐng)域的創(chuàng)新生物技術(shù)公司，如美國(guó)阿爾尼拉姆生物技術(shù)公司、加拿大楊梅生物制藥公司、美國(guó)箭頭制藥公司以及蘇州瑞博生物技術(shù)股份有限公司等，一直堅(jiān)持不懈地致力于克服siRNA成藥存在的技術(shù)障礙，研究提高RNAi分子的穩(wěn)定性和特異性的方法，降低其脫靶效應(yīng)和肝毒性，以及實(shí)現(xiàn)更安全、有效的體內(nèi)遞送技術(shù)途徑。隨著遞送和修飾技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步，RNAi研發(fā)領(lǐng)域從2013年開(kāi)始迅速?gòu)?fù)蘇，直到2018年第1款siRNA藥物成功上市，標(biāo)志了RNAi時(shí)代的到來(lái)。隨后又有2款siRNA藥物獲批上市。該領(lǐng)域的研究已經(jīng)展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景[11]。

圖1 RNAi療法的發(fā)展歷程[10]Figure 1 Development of RNAi therapy[10]

2 小干擾RNA成藥面臨的的挑戰(zhàn)

siRNA作為RNAi療法重要的效應(yīng)分子，可以在mRNA水平對(duì)靶標(biāo)蛋白介導(dǎo)基因沉默效應(yīng)。其機(jī)制為：外源性導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的雙鏈siRNA首先與含有Ago蛋白的核酶復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。激活后的RISC在ATP的供能下可以將siRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)打開(kāi)。單鏈siRNA尋找同源mRNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)。然后對(duì)靶標(biāo)mRNA進(jìn)行切割降解，從而阻斷靶基因蛋白的表達(dá)，發(fā)揮基因沉默效應(yīng)[12]。

盡管siRNA的作用機(jī)制表明其在臨床應(yīng)用及制藥行業(yè)中有著巨大的應(yīng)用前景，但其在體內(nèi)的遞送仍然面臨著許多挑戰(zhàn)[13]。裸露的siRNA被注射進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)在短時(shí)間內(nèi)被血漿中或組織中的核酶降解。此外，腎臟快速清除縮短了siRNA分子在血液循環(huán)中的半衰期[14]。游離的siRNA相對(duì)分子質(zhì)量較大（13 000 ~ 15 000），且含有大量的負(fù)電荷，難以自行穿越細(xì)胞膜并在胞漿內(nèi)發(fā)揮RNAi效應(yīng)[15]。另外，血液中游離的siRNA分子的免疫原性也是限制其臨床應(yīng)用的主要原因之一，使其在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)[16]。除少數(shù)能夠直接攝取游離siRNA的細(xì)胞 （視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）外，大多數(shù)細(xì)胞無(wú)法直接內(nèi)化siRNA，故需要對(duì)其進(jìn)行修飾或設(shè)計(jì)合適的載體將其遞送到靶細(xì)胞中發(fā)揮作用[17-18]。雖然病毒載體在核酸遞送方面表現(xiàn)出轉(zhuǎn)染效率優(yōu)勢(shì)，但其在臨床疾病治療過(guò)程中存在潛在的免疫原性、致突變等安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，開(kāi)發(fā)安全高效的siRNA非病毒載體成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

3 小干擾RNA的非病毒載體

除針對(duì)疾病靶標(biāo)mRNA設(shè)計(jì)的有效siRNA序列之外，siRNA藥物的成功研發(fā)還取決于另一個(gè)關(guān)鍵因素——安全有效的遞送載體。理想的非病毒載體應(yīng)該具有siRNA高負(fù)載效率，血液循環(huán)中保護(hù)siRNA穩(wěn)定，組織靶向蓄積能力，細(xì)胞高效攝取和釋藥等特征；同時(shí)載體的可量化生產(chǎn)的制備工藝也是關(guān)鍵因素。目前，已上市或處于臨床試驗(yàn)中的siRNA非病毒載體主要包括脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）、N-乙酰 半乳 糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNac）-siRNA共軛物、高分子聚合材料、仿生載體等。文中將討論各類siRNA非病毒載體的設(shè)計(jì)策略，重點(diǎn)介紹其siRNA組裝模式以及臨床發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3.1 脂質(zhì)納米顆粒

在過(guò)去的20多年，LNP因其納米級(jí)的尺寸范圍、高效的封裝能力、成熟的制備工藝以及足夠的產(chǎn)品穩(wěn)定性等特點(diǎn)在納米技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要作用[19]。目前已有數(shù)十款基于LNP技術(shù)的納米藥物獲得FDA批準(zhǔn)上市[20]。因此，將LNP技術(shù)應(yīng)用于siRNA的遞送對(duì)于其臨床轉(zhuǎn)化具有重要意義。

具有臨床轉(zhuǎn)化潛力的LNP-siRNA遞送系統(tǒng)所需的基本特征包括有效地將siRNA包封在低表面電荷以及直徑不大于100 nm的LNP中，并且能夠在靜脈給藥后將封裝的siRNA遞送至靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮基因沉默效應(yīng)[21]。就包封而言，常見(jiàn)的帶正電脂質(zhì)材料可通過(guò)靜電相互作用輕易地與siRNA進(jìn)行結(jié)合，但由于載體表面殘余的正電荷引起體內(nèi)免疫激活使該類系統(tǒng)在體內(nèi)引起顯著的毒性反應(yīng)。為避免這個(gè)問(wèn)題，研究者們開(kāi)發(fā)了可電離的脂質(zhì)材料。這類脂質(zhì)因其獨(dú)特理化性質(zhì)在siRNA遞送中具有優(yōu)勢(shì)[22]。首先，在酸性條件下，該類脂質(zhì)分子帶有正電荷，可以將帶負(fù)電荷的siRNA壓縮包埋在脂質(zhì)納米顆粒中；其次，該類脂質(zhì)分子具有合適的pKa值（約為6.4）。在生理pH條件下，該脂質(zhì)所形成的LNP微粒的表面電荷近中性[9]。通過(guò)聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）化的脂質(zhì)分子進(jìn)一步修飾在LNP表面，可獲得直徑不大于100 nm的納米粒子；并且可通過(guò)改變PEG化脂材與核心脂材的比例調(diào)整粒子的大小[23]。但是，LNP表面的PEG外殼層阻礙了粒子與靶細(xì)胞之間的相互作用影響了siRNA在靶細(xì)胞內(nèi)吞效果。為解決這一問(wèn)題，研究者開(kāi)發(fā)了具有相對(duì)短尾鏈的C14-PEG化脂材[22]。該類脂質(zhì)分子在制備和儲(chǔ)存過(guò)程中能夠穩(wěn)定地與核心脂質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，但在靜脈注射后，該類PEG化脂質(zhì)分子與血漿中的脂蛋白顆粒進(jìn)行結(jié)合，并從原有的LNP系統(tǒng)中脫離，暴露出可與靶細(xì)胞進(jìn)行有效結(jié)合和攝取的非屏蔽載藥微粒。

鑒于可電離脂質(zhì)分子在siRNA遞送中表現(xiàn)出良好的遞送效率和耐受性，研究者對(duì)這一類可電離脂質(zhì)材料進(jìn)行了更為深入的研究，旨在獲得更加安全有效的LNP遞送系統(tǒng)[24]。研究人員設(shè)計(jì)和合成了300多種可電離脂質(zhì)分子，并且進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系的分析[25]。研究結(jié)果表明，LNP-siRNA復(fù)合物微粒的遞送效應(yīng)與可電離脂質(zhì)的pKa有顯著的相關(guān)性，最佳的pKa約為6.4。所含可電離脂材的pKa與6.4偏差越大，所形成的LNP-siRNA復(fù)合物微粒的基因沉默效力越低[26]。這一合適的pKa可能反映了脂材在中性條件下的低表面電荷（有利于避免循環(huán)中的快速清除）和在酸性條件下質(zhì)子化能力（有利于內(nèi)體逃逸）之間的平衡關(guān)系[26]。隨著研究的深入，研究者們篩選出更多有效的可電離脂材，其中4-（N，N-二甲基氨基）丁酸（6Z，9Z，28Z，31Z）-庚三十碳-6，9，28，31-四烯-19-基-酯（結(jié)構(gòu)如圖2所示，后被稱為DLin-MC3-DMA）表現(xiàn)出最佳的肝細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染效率。研究者發(fā)現(xiàn)將該類脂質(zhì)材料靜脈注射后，載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）在LNP表面的吸附作用顯著增強(qiáng)了LNP對(duì)肝臟，尤其是肝細(xì)胞的親和力[27]。ApoE可通過(guò)肝細(xì)胞表面的脂蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑觸發(fā)肝細(xì)胞對(duì)LNP的有效攝取?；谝陨涎芯?，Alnylam制藥公司于2018年8月開(kāi)發(fā)的首款siRNA藥物Onpattro獲得FDA批準(zhǔn)上市，用于治療由遺傳性疾病轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性引起的多發(fā)性神經(jīng)疾病[27]。這種藥物通過(guò)抑制肝臟中的轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）的表達(dá)起到治療作用。Onpattro是基于可電離脂質(zhì)DLin-MC3-DMA的LNP-siRNA系統(tǒng)，通過(guò)乙醇注入法和微流控技術(shù)可以得到siRNA高負(fù)載效率、粒徑?。ǎ?00 nm）、穩(wěn)定性好及低表面電荷的LNP載藥體系[28]。

圖2 DLin-MC3-DMA的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 2 Structure of DLin-MC3-DMA

Onpattro的成功上市為siRNA藥物的臨床轉(zhuǎn)化開(kāi)辟了道路，預(yù)示著基于RNAi療法的新紀(jì)元已經(jīng)到來(lái)。盡管Onpattro表現(xiàn)出相對(duì)較低的體內(nèi)毒性，但在臨床使用過(guò)程中仍存在明顯的靜脈輸注過(guò)敏反應(yīng)。因此，患者被要求在使用該藥物之前至少提前60 min給予皮質(zhì)類固醇、對(duì)乙酰氨基酚和抗組胺藥，以降低輸液相關(guān)不良反應(yīng)帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。由此可見(jiàn)，外源性的可電離陽(yáng)離子脂材也無(wú)法完全避免其電荷性質(zhì)引起的體內(nèi)安全風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 GalNac-siRNA共軛物

2019年底，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了另一款siRNA藥物Givlaari用于急性肝卟啉癥（acute hepatic porphyrias，AHP）患者的治療，采用皮下注射的給藥方式，批準(zhǔn)的給藥頻次為每月注射1次[10]。值得一提的是，Givlaari是Alnylam制藥公司全球第2款獲得FDA批準(zhǔn)的siRNA藥物，也是全球第1款獲得FDA批準(zhǔn)的GalNAc-siRNA共軛物，一種靶向氨基丙烯酸合成酶1（aminolevulinate synthase 1，ALAS1）的RNAi藥物。該藥采用了GalNAc共軛遞送技術(shù)，能夠特異性地與肝細(xì)胞表面的抗去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)吞后可有效下調(diào)ALAS1 mRNA水平，從而使神經(jīng)毒性中間產(chǎn)物氨基乙酰丙酸（aminolevulinic acid，ALA）和膽色素原（porphobilinogen，PBG）降低至正常水平[29]。

目前，對(duì)siRNA序列的堿基骨架結(jié)構(gòu)上基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾可以顯著增強(qiáng)其在血液循環(huán)中的抗酶解穩(wěn)定性；然而，化學(xué)穩(wěn)定性的提高未能解決siRNA不易穿透細(xì)胞膜屏障的問(wèn)題。Alnylam制藥公司的Monoharan團(tuán)隊(duì)將GalNAc以三價(jià)態(tài)的方式共價(jià)偶聯(lián)到siRNA的正義鏈3'末端得到GalNAc-siRNA共軛物[30]。該類GalNAc-siRNA共軛物結(jié)構(gòu)由3部分組成，分別為三價(jià)的GalNAc靶頭、連接臂以及siRNA分子（見(jiàn)圖3）。完整的GalNAc-siRNA共軛物可通過(guò)肝細(xì)胞表面高表達(dá)的ASGPR介導(dǎo)的網(wǎng)格蛋白參與的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。隨著內(nèi)體中的pH下降，GalNAc-siRNA共軛物從結(jié)合的ASPGR中釋放出來(lái)。隨后，ASGPR循環(huán)回到細(xì)胞表面；而GalNAc-siRNA共軛物保留在內(nèi)體中。GalNAc在1 h內(nèi)被內(nèi)體糖苷酶從siRNA上切割下來(lái)，連接臂在4 h內(nèi)被降解。絕大多數(shù)游離siRNA仍被捕獲在內(nèi)體中，而極少量（＜1%）能夠通過(guò)未知機(jī)制穿過(guò)內(nèi)體脂質(zhì)雙層膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并誘導(dǎo)RNAi反應(yīng)。與復(fù)雜的脂質(zhì)制劑不同，GalNAc-siRNA共軛物是一種顆粒更小，制備工藝更簡(jiǎn)單，且成分更加確定的肝靶向策略。完整的GalNAc-siRNA共軛物可以在固態(tài)寡核苷酸合成儀中合成，并通過(guò)質(zhì)譜儀對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制[31]。

圖3 GalNAc-siRNA共軛物結(jié)構(gòu)[30]Figure 3 Structure of GalNAc-siRNA conjugate[30]

GalNAc-siRNA共軛物已在臨床前嚙齒類動(dòng)物和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中進(jìn)行了深入研究。除了2款已經(jīng)上市的基于GalNAc-siRNA共軛物的siRNA藥物之外，目前由Alnylam，Arrowhead，Dicerna等生物制藥公司開(kāi)發(fā)的多項(xiàng)siRNA藥物臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，涉及慢性病、遺傳性疾病、肝感染性疾病等[32]。如inclisiran（ALN-PCSsc）是Alnylam制藥公司開(kāi)發(fā)的靶向前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶 菌 素9型（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）的GalNAc-siRNA共軛物，用于治療高膽固醇血癥。目前正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)（NCT03851705）[33]。由肝臟分泌進(jìn)入血液循環(huán)中的PCSK9蛋白可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合并增強(qiáng)肝臟低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）的降解，導(dǎo)致低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）在循環(huán)系統(tǒng)中的蓄積，從而引起高膽固醇血癥[34]。因此，抑制PCSK9的表達(dá)已成為減少LDL-C的新型治療策略。Inclisiran可通過(guò)沉默PCSK9基因有效減少LDL-C，并能夠保持劑量依賴的長(zhǎng)時(shí)間療效[35]。目前臨床使用的單克隆抗體可抑制PCSK9，但需要頻繁給藥。Inclisiran的優(yōu)勢(shì)在于只需每年注射2次即可將LDL-C的水平降低50%以上[36-37]。Inclisiran一旦在臨床試驗(yàn)中獲得成功，將顛覆現(xiàn)有的高膽固醇血癥治療模式。如今，GalNAc共軛技術(shù)已經(jīng)成為實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞靶向遞送的首選方案，在RNAi候選藥物研究中起到關(guān)鍵的作用，這一切的成功離不開(kāi)50多年來(lái)關(guān)于ASGPR以及核酸化學(xué)的研究工作。

3.3 陽(yáng)離子聚合材料

高分子聚合材料通常是由多個(gè)片段功能單元組合形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。為將其應(yīng)用于siRNA的遞送，研究者開(kāi)發(fā)了具有陽(yáng)離子基團(tuán)的聚合材料，通過(guò)靜電結(jié)合作用封裝siRNA實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)的有效遞送[38-39]。常見(jiàn)的陽(yáng)離子聚合材料包括聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）、樹(shù)枝狀聚酰胺-胺（poly- amindoamine，PAMAM）、聚氨基酯（polyβ-amino ester，PBAE）等[40]。PEI是應(yīng)用最為廣泛的陽(yáng)離子聚合材料，通過(guò)靜電相互作用提供強(qiáng)大的正電荷將siRNA壓縮在納米粒子中；同時(shí)PEI具有的質(zhì)子緩沖能力使其被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞后實(shí)現(xiàn)內(nèi)體逃逸[41]。1995年，Boussif等[42]首次報(bào)道了PEI對(duì)核酸藥物的胞內(nèi)遞送能力。研究表明，相對(duì)分子質(zhì)量為25 000的PEI轉(zhuǎn)染效率最高，被廣泛用作陽(yáng)離子聚合載體的金標(biāo)準(zhǔn)[43]。然而，PEI在生物體內(nèi)無(wú)法降解，從而造成體內(nèi)積聚。因此，較高的安全風(fēng)險(xiǎn)限制了其在臨床中的使用。PAMAM的特點(diǎn)是存在大量的可電離端基，這意味著其能夠有效結(jié)合大量的核酸藥物，并且增強(qiáng)內(nèi)體逃逸，但是由于其高正電荷而具有高毒性[44-45]。盡管上述陽(yáng)離子聚合材料都表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)染效率，但是這些材料潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)切斷了其向臨床轉(zhuǎn)化的道路?；陉?yáng)離子聚合肽的核酸遞送載體被認(rèn)為具有良好的生物相容性，包含賴氨酸、精氨酸和組氨酸殘基的各類陽(yáng)離子肽已經(jīng)用于核酸藥物的遞送[46]。STP705是圣諾制藥開(kāi)發(fā)的基于組氨酸-賴氨酸多肽共聚物的多肽納米顆粒，通過(guò)靶向沉默轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）和環(huán)氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）mRNA治療增生性瘢痕、非黑色素瘤皮膚癌和原位鱗狀細(xì)胞癌，目前正處于Ⅱ期臨床階段（NCT02956317）。

負(fù)載siRNA的陽(yáng)離子聚合物在到達(dá)治療靶點(diǎn)之前均會(huì)被遞送過(guò)程中的黏液糖蛋白、血清蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)、蛋白多糖和紅細(xì)胞等非靶細(xì)胞的陰離子成分所影響。研究者為了克服陽(yáng)離子聚合物在遞送過(guò)程中的問(wèn)題，設(shè)計(jì)了多種策略用于屏蔽載體表面的正電荷，或利用靶標(biāo)位置的pH、氧化還原、酶響應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)載siRNA微粒表面的電荷轉(zhuǎn)換[47]。Choi等[48]開(kāi)發(fā)了一類“l(fā)ayer by layer”的多功能siRNA載體，具有屏蔽正電荷的能力。該納米遞送系統(tǒng)由多層結(jié)構(gòu)組成，最外層是作為靶向作用的透明質(zhì)酸和CD抗體，最內(nèi)層為帶負(fù)電的siRNA。siRNA相鄰兩層設(shè)計(jì)為帶有特定功能的正電層（聚精氨酸），整體形成一個(gè)穩(wěn)定多層結(jié)構(gòu)。采用逐層吸附的方式將siRNA牢固地包封在納米結(jié)構(gòu)中，在體內(nèi)循環(huán)中可以保護(hù)siRNA免受核酶的破壞降解；同時(shí)非正電性的微粒表面性質(zhì)降低了整體的安全風(fēng)險(xiǎn)。Wang等[49]開(kāi)發(fā)了一種對(duì)微酸性的腫瘤微環(huán)境敏感的電荷可轉(zhuǎn)換聚合納米顆粒用于遞送siRNA。通過(guò)將2，3-二甲基馬來(lái)酸酐（2，3-dimethylmaleic anhydride，DMMA）部分修飾在陽(yáng)離子共聚物的氨基上，使形成的載體膠束吸附siRNA后在生理?xiàng)l件下保持帶負(fù)電狀態(tài)。當(dāng)?shù)竭_(dá)微酸性的腫瘤微環(huán)境時(shí)，DMMA響應(yīng)性脫落，膠束表面由負(fù)電荷轉(zhuǎn)換為正電荷，可以促進(jìn)siRNA的細(xì)胞攝取。

近年來(lái)，各類基于陽(yáng)離子聚合材料的多功能響應(yīng)性siRNA遞送載體發(fā)展迅速，在臨床前研究中表現(xiàn)出優(yōu)異的藥效，但是鮮有進(jìn)入臨床的案例。究其原因還是無(wú)法徹底解決陽(yáng)離子聚合材料在體內(nèi)的安全性問(wèn)題。因此，研究者開(kāi)始將關(guān)注點(diǎn)放在一些天然來(lái)源的仿生材料或設(shè)計(jì)非陽(yáng)離子遞送載體，試圖規(guī)避陽(yáng)離子聚合物所帶來(lái)的安全風(fēng)險(xiǎn)。

3.4 仿生載體

3.4.1 生物膜修飾仿生載體迄今為止，研究者已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一系列用于治療惡性腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)類疾病等siRNA載藥納米體系，但應(yīng)用于臨床的藥物較少。究其原因，這些納米載藥微粒通常在進(jìn)入機(jī)體內(nèi)被認(rèn)為是“異物”，機(jī)體防御系統(tǒng)會(huì)迅速作出反應(yīng)，將其排除在生理屏障之外或?qū)⑵鋸捏w內(nèi)進(jìn)行快速清除。2012年，Hu等[50]首次提出利用紅細(xì)胞膜修飾聚合物納米顆粒的仿生策略，在體內(nèi)表現(xiàn)出延長(zhǎng)的循環(huán)半衰期。近年來(lái)，基于生物膜工程的仿生策略在siRNA載體優(yōu)化研究中快速發(fā)展。采用生物膜包封的遞送策略賦予納米粒子延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間、逃避宿主免疫反應(yīng)和靶向特定部位的新特性。不同類型的生物膜具有不同的功能，血小板、紅細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等來(lái)源的生物膜都已被用來(lái)設(shè)計(jì)siRNA的遞送載體。Liu等[51]開(kāi)發(fā)了一種具有3層核殼結(jié)構(gòu)的仿生電荷轉(zhuǎn)化納米平臺(tái)。該平臺(tái)首先通過(guò)PEI吸附siRNA形成納米遞送系統(tǒng)的核心。檸檬酸接枝的聚賴氨酸作為納米遞送系統(tǒng)的第2層，也是電荷轉(zhuǎn)換部分，可以通過(guò)pH響應(yīng)實(shí)現(xiàn)載體的電荷轉(zhuǎn)換。腦靶向肽Angiopep-2修飾的紅細(xì)胞膜作為仿生系統(tǒng)的外殼，可以保護(hù)載體不受非特異性清除和免疫反應(yīng)的影響，從而增強(qiáng)對(duì)腦膠質(zhì)瘤疾病模型的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)。除了細(xì)胞膜以外，特定來(lái)源的細(xì)胞器膜也在仿生載體領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的功能優(yōu)勢(shì)?；诩?xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的特殊機(jī)制，筆者所在課題組提出腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜修飾的雜化型脂質(zhì)納米載體EhCv/siRNA NPs。該載體能夠調(diào)控siRNA在胞內(nèi)的時(shí)空命運(yùn)，介導(dǎo)內(nèi)吞體-高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，從而規(guī)避siRNA在內(nèi)體-溶酶體途徑的降解破壞（見(jiàn)圖4）[52]。與對(duì)照組相比較，腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜修飾的納米載體能夠顯著增強(qiáng)siRNA在胞內(nèi)的沉默效應(yīng)從而增強(qiáng)抗腫瘤療效?；谏锬すこ痰姆律f送策略開(kāi)辟了一條 siRNA臨床轉(zhuǎn)化的新道路，但是目前仍然存在生物膜成分復(fù)雜、制備工藝煩瑣、質(zhì)量不可控等問(wèn)題。

圖4 腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜修飾的雜化脂質(zhì)納米顆粒[52]Figure 4 Hybrid lipid nanoparticles modified by endoplasmic reticulum of tumor cells[52]

3.4.2 外泌體外泌體是一類由多種類型的細(xì)胞分泌的納米級(jí)脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外囊泡，可在不同細(xì)胞之間傳遞遺傳和生化信息，從而在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用?！巴饷隗w”一詞于1970年由Johnstone等[53]首次提出，并于2011年由Alvarez-Erviti等[54]首次發(fā)表外泌體對(duì)siRNA的遞送研究。外泌體彌補(bǔ)了現(xiàn)有siRNA遞送系統(tǒng)的缺陷，并可能代表未來(lái)基于siRNA療法的新途徑[55]。外泌體的優(yōu)勢(shì)在于獨(dú)特的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)、循環(huán)中的穩(wěn)定性、穿越生物屏障的內(nèi)在能力、潛在的靶向能力，更高的遞送效率、膜滲透能力以及更好的生物相容性、非免疫原性和安全性[56]。外泌體的理想粒徑為40 ~ 100 nm，使其能夠避免單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的快速腎臟清除和吞噬作用，并通過(guò)高通透性和滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應(yīng)增強(qiáng)腫瘤積累。外泌體顯示出輕微的負(fù)電荷，使其不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，在血液循環(huán)中表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。此外，作為天然來(lái)源的納米遞送系統(tǒng)，外泌體在體內(nèi)使用時(shí)與免疫系統(tǒng)的生物相容性更好，并且相比于人工合成的納米載體，更不易引起免疫反應(yīng)和毒性。鑒于外泌體具有穿越生物屏障的天然能力，利用外泌體作為siRNA的納米載體將有利于突破血腦屏障（blood brain barrier，BBB），并可能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面取得突破[8]。值得一提的是，眾多臨床試驗(yàn)表明外泌體相對(duì)安全。Liu等[57]開(kāi)發(fā)了一種“納米清道夫”。該載體為狂犬病病毒糖蛋白肽修飾的外泌體（來(lái)源于未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞），用于共遞送姜黃素和siRNA，能夠清除α-突觸核蛋白聚集體并降低它們?cè)谂两鹕∩窠?jīng)元中的細(xì)胞毒性。Zhou等[58]開(kāi)發(fā)了一種基于外泌體的雙重遞送生物系統(tǒng)。該載體由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體構(gòu)建，通過(guò)電穿孔包載galectin-9 siRNA，并用奧沙利鉑前藥進(jìn)行表面修飾。間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠顯著提高腫瘤靶向能力，增強(qiáng)藥物在腫瘤組織中的積累。siRNA和奧沙利鉑的聯(lián)合療法可以通過(guò)腫瘤抑制巨噬細(xì)胞極化、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞募集和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）下調(diào)引發(fā)抗腫瘤免疫，在癌癥治療中取得顯著療效。另外，美國(guó)MD安德森癌癥中心正在開(kāi)展一項(xiàng)基于間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞衍生的外泌體（iExosome）遞送KRAS G12D siRNA的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT03608631），用于治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者。其臨床前研究表明，該類工程化外泌體能夠在小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)，這可能是由于CD47介導(dǎo)“勿吃我”信號(hào)，使其能夠逃避巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬作用。與脂質(zhì)體相比，iExosome通過(guò)特異性靶向癌基因KRAS表現(xiàn)出更佳的腫瘤抑制活性，顯著增加胰腺癌模型小鼠的總生存期[59]。

如今，外泌體在臨床前和臨床試驗(yàn)階段已成功用于siRNA的遞送，以治療各類疾病，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、眼部疾病、肝臟和腎臟疾病。然而，為了最大限度發(fā)揮外泌體的臨床潛力，迫切需要進(jìn)一步的研究來(lái)解決許多有爭(zhēng)議的問(wèn)題。將基于外泌體的siRNA藥物從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化成臨床應(yīng)用，仍需面對(duì)諸多的挑戰(zhàn)，包括選擇合適來(lái)源的細(xì)胞系，探索具有高效率和穩(wěn)定產(chǎn)量的分離提取技術(shù)，高效的藥物封裝方法且不破壞外泌體的完整性，可產(chǎn)業(yè)化的制備工藝和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，更好地研究該類載體的內(nèi)在分子機(jī)制，提高對(duì)靶標(biāo)的定位能力。盡管外泌體在siRNA的遞送研究中取得了很大的進(jìn)展，但仍處于早期開(kāi)發(fā)階段。鑒于外泌體遞送領(lǐng)域的光明前景，研究者堅(jiān)信外泌體介導(dǎo)的siRNA藥物遞送將在未來(lái)進(jìn)入臨床。

3.5 DNA納米載體

脫氧核糖核酸（DNA）作為一類生物大分子，不但可以通過(guò)特定堿基序列傳遞遺傳信息，還可通過(guò)自組裝行為構(gòu)建超分子納米載體結(jié)構(gòu)。DNA納米載體具有生物可降解、易于修飾、結(jié)構(gòu)精確可控等特點(diǎn)，被廣泛用于生物成像、診斷和藥物遞送等[60]。DNA納米載體與siRNA具有同源性的優(yōu)勢(shì)，可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式有效地進(jìn)行組裝，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)siRNA的遞送。目前已經(jīng)有許多二維和三維的DNA納米結(jié)構(gòu)用于siRNA的遞送[61]。2012年，Lee等[62]首次報(bào)道了一類用于siRNA遞送的DNA四面體納米顆粒，可以將siRNA導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞并沉默胞質(zhì)中50%以上的靶基因。該DNA四面體納米顆粒的粒徑為28.6 nm，由186個(gè)Watson-Crick堿基對(duì)組成，每條邊有30個(gè)堿基對(duì)，中間留有一個(gè)缺口用于連接siRNA。由于DNA鏈易于變形，因此可以精確控制納米顆粒的大小以及納米顆粒表面上靶向配體（如肽和葉酸）的空間方向和密度（見(jiàn)圖5）。Liu等[63]構(gòu)建了一種支鏈反義DNA和siRNA共組裝形成的核酸納米顆粒。首先通過(guò)無(wú)銅點(diǎn)擊反應(yīng)將一對(duì)DBCO修飾的分支反義鏈（7AS1/7AS2）分別連接到疊氮修飾的β-環(huán)糊精上，然后通過(guò)DNARNA雜交將3'端接頭修飾的siRNA與上述的一對(duì)分支反義鏈修飾的β-環(huán)糊精進(jìn)行結(jié)合，共組裝形成7AS1/siRNA/7AS2復(fù)合物。Li等[64]開(kāi)發(fā)了一種基于DNA納米技術(shù)的策略，通過(guò)聚合物納米框架中DNA發(fā)夾的級(jí)聯(lián)雜化交聯(lián)反應(yīng)（hybrid crosslinking reaction，HCR），實(shí)現(xiàn)DNA載體在納米尺度下的時(shí)空可編程組裝以及siRNA的精確遞送。儲(chǔ)存在DNA發(fā)夾環(huán)中的勢(shì)能可以克服納米骨架中的空間位阻效應(yīng)，從而啟動(dòng)DNA發(fā)夾的級(jí)聯(lián)HCR，實(shí)現(xiàn)siRNA的高效負(fù)載。體內(nèi)外研究表明，該類DNA載體可以顯著下調(diào)相關(guān)mRNA和蛋白質(zhì)的水平。

圖5 核酸納米載體[62]Figure 5 Nucleic acid nanosystem[62]

DNA納米技術(shù)經(jīng)歷了30多年的發(fā)展，具有構(gòu)建多功能納米載體的成熟技術(shù)，在siRNA遞送領(lǐng)域擁有重要的研究?jī)r(jià)值，其具備的強(qiáng)大遞送效率和特異性靶點(diǎn)響應(yīng)識(shí)別能力為新型siRNA遞送系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)提供了可能。但是，基于DNA的納米載體系統(tǒng)在用于生物診斷和治療時(shí)仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。目前，DNA納米載體尚未有臨床轉(zhuǎn)化的報(bào)道。

3.6 磷酸鈣納米粒

磷酸鈣作為一種生物相容性良好的載體材料，在siRNA遞送方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[65]。早在1973年，磷酸鈣納米粒子就被用于核酸藥物的遞送[66]。siRNA分子鏈中的磷酸基團(tuán)可以和鈣離子形成磷酸鈣納米粒，但是該類納米粒存在粒子不穩(wěn)定的問(wèn)題，長(zhǎng)期存放容易發(fā)生粒子的聚集沉淀，限制了其向臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的發(fā)展[67]。為解決磷酸鈣納米粒穩(wěn)定性差的問(wèn)題，研究者采取了多種策略，最主要的方法是將磷酸鈣/siRNA形成的納米沉淀作為核心，通過(guò)外層材料的覆蓋阻止納米顆粒的粒徑增長(zhǎng)，這些材料主要包括脂質(zhì)材料、PEG及其衍生物、聚糖材料等[65]。筆者所在課題組合成了阿侖膦酸鈉修飾的透明質(zhì)酸，利用其結(jié)構(gòu)的磷酸基團(tuán)能夠與siRNA結(jié)合形成磷酸鈣納米沉淀，利用透明質(zhì)酸衍生物的高分子特性，使其能夠覆蓋在磷酸鈣表面形成穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu)[68]。該載體能夠通過(guò)透明質(zhì)酸介導(dǎo)的CD44受體特異性結(jié)合而靶向腫瘤細(xì)胞，增強(qiáng)納米粒子的攝取能力，同時(shí)利用磷酸鈣本身具有的酸性溶蝕效應(yīng)實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸，最終在胞質(zhì)內(nèi)實(shí)現(xiàn)siRNA的基因沉默效應(yīng)。盡管磷酸鈣納米粒用于siRNA的遞送取得了一定進(jìn)展，但實(shí)現(xiàn)該類載體的臨床轉(zhuǎn)換仍需要解決許多問(wèn)題。

3.7 其他非陽(yáng)離子載體

為規(guī)避陽(yáng)離子載體潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，各類基于非陽(yáng)離子載體的siRNA遞送系統(tǒng)被廣泛研究[69]。Xu等[70]開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)將siRNA疏水化來(lái)改變其固有特性的簡(jiǎn)易策略。首先，siRNA與鹽酸阿霉素通過(guò)簡(jiǎn)單混合的方式可以形成疏水性復(fù)合物，使其能夠被封裝在非陽(yáng)離子PEG-聚乳酸（polylactic acid，PLA）膠束中用于全身遞送。該策略還可以推廣到其他具有大疏水結(jié)構(gòu)域的鹽酸鹽抗癌藥物。這種簡(jiǎn)便的策略有效地避免了陽(yáng)離子納米載體的使用，為siRNA的遞送提供了新的途徑。Kim等[71]開(kāi)發(fā)了一種用于遞送siRNA的非陽(yáng)離子軟性多酚納米膠囊，稱為“Nanosac”。載有siRNA的Nanosac是通過(guò)用siRNA和聚多巴胺涂覆介孔二氧化硅納米粒子，并洗去二氧化硅核心而產(chǎn)生。與剛性對(duì)照載體相比較，Nanosac的柔性特性提高了對(duì)腫瘤組織的滲透能力。作為靶向程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）的siRNA載體，Nanosac通過(guò)免疫檢查點(diǎn)阻斷顯著抑制CT26腫瘤的生長(zhǎng)。這些結(jié)果支持該載體在全身性遞送siRNA用于實(shí)體瘤治療中的效用。

4 結(jié)語(yǔ)

siRNA的基因沉默效應(yīng)代表了一種有前途的基因治療方法。盡管siRNA的化學(xué)修飾可以提高功效并減少其脫靶效應(yīng)和副作用，但從siRNA成藥發(fā)展歷程來(lái)看，安全高效的遞送載體無(wú)疑是推動(dòng)siRNA藥物獲批上市的關(guān)鍵因素?；贕alNAcsiRNA共軛物遞送技術(shù)的肝靶向平臺(tái)，目前的已批準(zhǔn)上市或正在開(kāi)展臨床試驗(yàn)的系列siRNA藥物絕大多數(shù)集中在肝細(xì)胞表達(dá)致病基因的適應(yīng)證，如高脂血證、乙型肝炎等。近年來(lái)，隨著遞送載體的不斷創(chuàng)新設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)，研究人員逐漸將siRNA藥物研發(fā)的注意力轉(zhuǎn)移到除肝臟以外的其他病灶部位的治療應(yīng)用，包括腫瘤以及病毒性感染等。另外，值得一提的是，獲FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于冠狀病毒治療的mRNA疫苗的成功研發(fā)，關(guān)鍵因素也同樣涉及高效安全的遞送載體[72-73]。隨著生物技術(shù)和遞送載體的不斷深入研究，RNAi療法在未來(lái)將會(huì)在臨床疾病治療中發(fā)揮更大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>