黃迪海，盛曉丹，劉 霞，黃 兵，亓麗紅，張?jiān)佥x，秦卓明,*

(1. 山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，濟(jì)南 250100；2. 濟(jì)南市動(dòng)物生物藥品工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250100；3. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，濟(jì)南 250100)

轉(zhuǎn)移因子(Transfer Factor，TF)是由動(dòng)物淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，能夠?qū)⒐w的特異性免疫信息遞呈給受體淋巴細(xì)胞，使其致敏從而激發(fā)受體細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在國(guó)內(nèi)主要作為免疫增效劑使用，對(duì)于天然免疫和獲得性免疫均有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[1]。動(dòng)物脾轉(zhuǎn)移因子一般含有多肽、核糖、氨基酸、核苷酸、微量元素等多種成分，商品化的TF口服溶液通常把多肽、核糖含量作為質(zhì)控指標(biāo)，但缺乏相應(yīng)的理論支撐。目前，有關(guān)脾轉(zhuǎn)移因子多肽成分的研究報(bào)道較少[2]，尤其是缺乏多肽種類(lèi)、功能及其序列的研究。為此，本文應(yīng)用質(zhì)譜色譜法(LC-MS)對(duì)獸用雞脾和豬脾TF的多肽進(jìn)行鑒定，篩選與免疫相關(guān)的多肽進(jìn)行比較和分析，為轉(zhuǎn)移因子及多肽藥物的研發(fā)提供思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料 獸用雞脾TF、獸用豬脾TF，由山東省健牧生物藥業(yè)有限公司通過(guò)凍融、透析法制備，多肽含量≥1 mg/mL，核糖含量≥30 μg/mL；Millipore 10 kD超濾離心管。

1.2 方法 TF溶液用10 kD超濾管10000 r/min離心處理，收集通過(guò)的濾液，冷藏；委托中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，按照文獻(xiàn)[1]的方法，進(jìn)行溶液內(nèi)酶解(Trypsin，20 h)，抽提酶解肽段，應(yīng)用LC-MS法采集多肽碎片的質(zhì)量電荷比，應(yīng)用BIOWORKS軟件搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，得到鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)果，查詢Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選具有免疫活性的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)與多肽的鑒定概況 獸用雞脾和豬脾TF分別檢測(cè)到多肽片段656條和1194條，對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)512種、554種，包含有特征的蛋白448種、485種，其中，與免疫相關(guān)的蛋白分別有30種、40種(表1)。

表1 雞脾和豬脾TF中的多肽及其分子量分布Tab 1 Peptides and their molecular weight distribution in chicken spleen-derived and pig spleen-derived TF

此外，多肽片段對(duì)應(yīng)的完整蛋白還具有生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)、生物酶解、營(yíng)養(yǎng)代謝以及維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)等多種活性。

2.2 免疫活性蛋白質(zhì)及多肽序列

2.2.1 細(xì)胞免疫作用 在雞脾和豬脾TF中，與細(xì)胞免疫活性相關(guān)的蛋白質(zhì)共21種蛋白。其中，雞脾有8種、豬脾有16種，二者均含有淋巴細(xì)胞胞質(zhì)蛋白(LCP)、白細(xì)胞介素-16(IL-16)和胸腺肽β4(TMSB4X)3種蛋白。在細(xì)胞免疫的感應(yīng)階段，涉及9種蛋白，其中，雞脾2種，豬脾7種(表2)。在細(xì)胞免疫的反應(yīng)階段，共涉及11種蛋白，其中，雞脾5種，豬脾6種(表3)。在效應(yīng)階段，共涉及4種蛋白，其中，雞脾1種，豬脾3種(表4)。

表2 TF中與細(xì)胞免疫感應(yīng)階段有關(guān)的多肽Tab 2 Peptides in TF associated to the cellular immune sensing phase

表3 TF中與細(xì)胞免疫反應(yīng)階段有關(guān)的多肽Tab 3 Peptides in TF associated to the stage of cellular immune response

續(xù)表

表4 TF中與細(xì)胞免疫效應(yīng)階段有關(guān)的多肽Tab 4 Peptides in TF associated to the effector stage of cellular immunity

2.2.2 體液免疫 參與體液免疫調(diào)節(jié)的蛋白有11種，其中，雞脾有6種，豬脾有5種，二者均含有烯醇酶(ENO1)(表5)。

表5 TF中與體液免疫有關(guān)的多肽Tab 5 Peptides involved in humoral immunity in TF

2.2.3 其他免疫調(diào)節(jié)作用

2.2.3.1 先天免疫 涉及先天免疫調(diào)節(jié)作用的有15種蛋白，其中豬脾有9種，雞脾有7種，二者均含有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(表6)。

表6 TF中與先天免疫有關(guān)的多肽Tab 6 Peptides involved in innate immunity in TF

續(xù)表

2.2.3.2 多種免疫活性 涉及多種免疫調(diào)節(jié)作用的有9種蛋白，其中，雞脾有4種、豬脾有5種，二者均含有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT1)(表7)。

表7 TF中與多種免疫有關(guān)的多肽Tab 7 Peptides associated with multiple immunity in TF

2.2.3.3 抗腫瘤活性 涉及多種免疫調(diào)節(jié)作用的有9種蛋白，雞脾4種，豬脾5種(表8)。

表8 TF中與抗腫瘤有關(guān)的多肽Tab 8 Polypeptides associated with antitumour in TF

續(xù)表

3 討 論

TF中的多肽成分比較復(fù)雜，相關(guān)研究尚處于探索階段。Kirkpatrick C H[3]制備了牛源和鼠源特異性TF，測(cè)序發(fā)現(xiàn)其均含有多肽LLYAQDL/VEDN，且能抑制受體遲發(fā)性超敏反應(yīng)的表達(dá)。黃靜芳等[4]在豬脾臟制備的脾氨肽口服凍干粉中鑒定出胸腺肽β4，占其多肽總量的0.117%。陳艷菊等[5]從抗乙肝TF中分離到多肽與核苷酸的復(fù)合物，該多肽由15種氨基酸組成。本文通過(guò)對(duì)獸用雞脾和豬脾TF的多肽鑒定，確定了其含有的潛在免疫活性多肽的氨基酸序列，其氨基酸數(shù)量為5～24個(gè)，多肽分子量為599.2784～2507.8258 Da。這些多肽對(duì)應(yīng)70余種免疫相關(guān)蛋白質(zhì)，其中，雞脾和豬脾蛋白分別占其總蛋白數(shù)的5.86%和7.22%，二者均含有IL-16、TMSB4X、LCP、ENO1、GAPDH、STAT1等六種蛋白質(zhì)。多肽序列對(duì)相關(guān)蛋白質(zhì)的覆蓋率為0.29%～81.2%，其中，覆蓋率較高的是胸腺肽β4(81.2%)和抗菌肽(31.54%)。結(jié)合黃靜芳的報(bào)道，推斷胸腺肽是TF的主要成分之一，但不同工藝制備的TF，其多肽成分、含量有所差異，可能與脾臟來(lái)源、粉碎細(xì)度、凍融次數(shù)、透析或超濾的孔徑和時(shí)間等因素有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，TF的免疫活性蛋白質(zhì)中，涉及細(xì)胞免疫21種、先天免疫15種、體液免疫11種、多種免疫活性8種、抗腫瘤9種，這些蛋白主要通過(guò)某些信號(hào)通路發(fā)揮作用，如：TCR或BCR介導(dǎo)的信號(hào)通路、非受體酪氨酸激酶信號(hào)途徑、JAK-STAT、cGAS-STING、及NF-κB信號(hào)通路等。

研究表明，某些活性肽可以口服發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，比如：脯-甘氨酸環(huán)二肽[6]、膠原三肽[7]、牡蠣肽[8]、胸腺蛋白肽[9]、環(huán)孢素A等。研究發(fā)現(xiàn)，多肽口服進(jìn)入胃和小腸，有的被消化酶、氨肽酶等降解為游離氨基酸和小肽；有的不被降解，通過(guò)細(xì)胞緊密連接的細(xì)胞旁路徑、被動(dòng)擴(kuò)散、內(nèi)吞作用或載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被小腸吸收[10]。進(jìn)入細(xì)胞的小肽一部分被胞漿中的肽酶水解為游離氨基酸，用于細(xì)胞本身代謝合成或被運(yùn)至體循環(huán)；一部分具有抗水解酶活性的多肽可直接通過(guò)基底側(cè)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)體完整地轉(zhuǎn)運(yùn)至體循環(huán)發(fā)揮作用，后被血漿中的可溶性蛋白酶降解為氨基酸[11]。雞脾和豬脾轉(zhuǎn)移因子中含有免疫活性蛋白的多肽片段達(dá)100多種，但尚不能確定哪些多肽片段具有口服免疫活性，還需要進(jìn)一步通過(guò)多肽合成和免疫學(xué)試驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。

除多肽外，TF中還包含核糖、微量元素、游離氨基酸以及核苷酸等多種成分。其中核糖在TF中的含量不低于30 μg/mL，核糖是RNA的組成物之一，也是ATP及NADH等生化代謝所需分子的原料，因其分子量較小，一般不具備免疫原性；微量元素和游離氨基酸是基本營(yíng)養(yǎng)代謝所需，鋅、銅具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，但其含量?jī)H有0.49 μg/mL和0.04 μg/mL[12]，正常劑量難以發(fā)揮免疫功能。TF中核苷酸含量達(dá)200～300 μg/mL[13]，其免疫活性成分可能是尿嘧啶類(lèi)化合物[14]，錢(qián)微等[15]也證實(shí)了對(duì)早期玫瑰花結(jié)形成具有顯著促進(jìn)作用的TF成分中含有鳥(niǎo)苷酸、尿嘧啶和尿苷。TF中的核苷酸可能具有口服免疫活性，因?yàn)橥庠词澄顳NA在小鼠胃腸道中是不完全降解的，其堿基片段可在小鼠進(jìn)食后的8 h在血液中檢測(cè)到，24 h內(nèi)可在淋巴細(xì)胞中檢出，24 h后發(fā)生降解[16]。外源DNA口服后，經(jīng)非序列依賴性DNA結(jié)合蛋白內(nèi)吞入細(xì)胞核，一部分發(fā)生降解，未降解的DNA則插入細(xì)胞基因組DNA中，可能導(dǎo)致某些外源基因的表達(dá)，也可能被機(jī)體通過(guò)甲基化方式進(jìn)行控制和清除[17]。TF中的核苷酸主要來(lái)自脾臟本身，也可能來(lái)自脾臟攜帶的微生物，其種類(lèi)和序列有待于應(yīng)用PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序方法進(jìn)行鑒定，進(jìn)而研究其體內(nèi)外的生物活性。