葛根中內(nèi)源性組分葛根素的生物效應(yīng)

郭 嫻，郭 嵐，徐夢佳，陳錦萍，萬益群

(南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031)

葛根(RadixPueraria)，又名甘葛、粉葛、葛藤等，是豆科植物葛的塊根。我國是葛類植物的主要生產(chǎn)地，資源豐富，主要分布在湖北、湖南、山西等地區(qū)[1-2]。葛根是一種常用的中藥，味甘性涼。據(jù)《本草綱目》記載：“葛根乃陽明經(jīng)藥，兼入脾經(jīng)，脾主肌肉......野葛性甘、辛、涼。有解肌退熱，透滲，生津止渴，升陽止瀉之功。常用于表證發(fā)熱，項背強痛，麻瘆不透，熱病口渴，陰虛消渴，熱瀉熱痢，脾虛泄瀉”[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，葛根具多重生物活性，如抗炎[5]、降血壓[6]、降血糖[7]、抗腫瘤[8]以及抗氧化等作用[9]。有研究表明,葛根中主要含有葛根苷、香豆素、生物堿、三萜類化合物、氨基酸以及異黃酮類化合物等組分[10-11]，其中以異黃酮類物質(zhì)含量最多，主要包括葛根素、大豆苷和大豆苷元等。在日常生活中，葛根也可作為食品來使用。

隨著葛根的廣泛應(yīng)用，其安全性也受到人們的廣泛關(guān)注，有關(guān)其不良反應(yīng)的報道逐漸增多。張玲[12]等人對國內(nèi)1994年以來關(guān)于葛根素注射劑所導(dǎo)致溶血反應(yīng)的27篇病例報道中的48例病人進行分析，發(fā)現(xiàn)溶血反應(yīng)多發(fā)生于以往曾用過葛根素或連續(xù)用藥一周以上的病人，以急溶血性貧血為主要表現(xiàn)，血液免疫學(xué)檢查可見葛根素特異性抗體。許焱[13]等人研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可導(dǎo)致急性腎衰竭，其機制可能為多方面的，但主要為腎小管壞死，與此同時，免疫復(fù)合物在腎臟沉積誘發(fā)炎癥反應(yīng)引起腎小球及腎間質(zhì)損傷，也可能同時使腎衰竭加重。朱玉珍[14]等在一例葛根素注射液引起急性溶血和腎衰竭的病例中，分別做了直接、間接抗球蛋白實驗，實驗結(jié)果顯示，葛根素進入體內(nèi)后與組織細(xì)胞膜松散結(jié)合，形成一種異己抗原，使敏感個體產(chǎn)生相應(yīng)的藥物抗體，病人紅細(xì)胞嚴(yán)重受到損害。我國食品藥品監(jiān)督管理局在2004年11月發(fā)布了“關(guān)于修訂葛根素注射劑說明書的通知”，要求相關(guān)企業(yè)盡快修訂說明書和包裝標(biāo)簽，并要求生產(chǎn)企業(yè)、醫(yī)生和患者高度重視葛根素引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)等[15]。因此，系統(tǒng)地研究評估葛根中的主要組分葛根素的毒性，對合理食用葛根具有重要的指導(dǎo)意義。

本文以Balb/c小鼠作為實驗動物，根據(jù)《中國藥典》2020年版規(guī)定，葛根中主要功效成分為葛根素，且含量不得少于2.4%，成年人每日葛根臨床用量約為10-15 g，即每公斤體質(zhì)量成人對葛根素的攝入量約為4～6 mg[4]。以成人對葛根素的最大攝入量為基準(zhǔn)，小鼠與人體表面積折算系數(shù)約為9.01[16]來確定給藥劑量，通過急性經(jīng)口毒性實驗，探究一定劑量的葛根素對小鼠的主要臟器(包括肝臟、腎臟、心臟)的影響，為正確使用葛根提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

葛根素(AR，95%)購自上海源葉生物公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、總膽紅素(Total Bilirubin,T-BIL)、間接膽紅素(Indirect Bilirubin,I-BIL)、直接膽紅素(Direct Bilirubin,D-BIL)、肌酐(Creatinine,CREA-J)、尿酸(Uric Acid,UA)、尿素(Urea,UREA)、乳酸脫氫酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)、羥丁酸脫氫酶(Hydroxybutyric Dehydrogenase,HBDH)、肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)和肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase Isoenzyme,CK-MB)等試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；二甲苯、鹽酸和氨水(AR)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；10%福爾馬林中性固定液購自雨露實驗器材有限公司；聚乙二醇400(PEG 400，AR)購自天津恒興試劑有限公司；蘇木素-伊紅染液購自武漢市皮諾飛生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GL-21M型冷凍離心機購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司；BS-380型全自動生化分析儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；JJ-12J型脫水機、JB-P5型包埋機和JB-L5型凍臺均購自武漢俊杰電子有限公司；RM2016型病理切片機購自上海徠卡儀器有限公司；KD-P型組織攤片機購自金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；10212432C型載玻片及蓋玻片購自江蘇世泰儀器制造有限公司；NIKON ECLPSE CI型正置光學(xué)顯微鏡和NIKON DS-U3型成像系統(tǒng)均購自日本尼康有限公司。

1.3 實驗動物

健康級Balb/C種小白鼠，雌雄各半，4～6周齡，體重(20±2)g，由南昌市樂悠生物科技有限公司提供。在試驗前所有小鼠均適應(yīng)環(huán)境7 d，溫度控制在(24±2)℃，相對濕度為55%±10%，自由飲水進食，光照條件為12 h白晝，12 h黑夜。

1.4 方法

1.4.1 毒性評估實驗

健康級Balb/C小鼠20只，按性別、體重隨機分為2組，即為對照組和給藥組，每組10只，雌雄各半，雌雄分籠飼養(yǎng)。給藥組灌胃葛根素，劑量為6000 mg·kg-1，對照組灌胃等體積的聚乙二醇 400(PEG 400)。以上各組小鼠均按體質(zhì)量10 mL·kg-1灌胃一次。小鼠在給藥前禁食不禁水12 h，給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，持續(xù)觀察7 d。每天觀察小鼠的飲食情況、毛色狀況、精神狀態(tài)等一般行為，并記錄小鼠的體重。若小鼠出現(xiàn)死亡情況，將立即對小鼠進行解剖，并肉眼觀察小鼠主要臟器病理形態(tài)變化。7 d后對小鼠進行眼眶靜脈叢處取血并處死，血液進行生化分析，分離完整的心臟、肝臟和腎臟，用生理鹽水清洗后濾紙吸干，進行稱重，然后將組織固定在10%福爾馬林中性固定液中，進行組織病理學(xué)研究。

1.4.2 小鼠血清分析

各組小鼠在實驗第7 d后禁食不禁水12 h處死。經(jīng)小鼠眼眶靜脈叢取血，待血液靜置1 h后于4℃、3000 r·min-1的條件下離心。分離的血清樣本用全自動生化分析儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(T-BIL)、直接膽紅素(D-BIL)、間接膽紅素(I-BIL)、尿素(UREA)、尿酸(UA)、肌酐(CREA-J)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和羥丁酸脫氫酶(HBDH)等生化指標(biāo)的含量。

1.4.3 組織病理學(xué)研究

小鼠取血后脫頸處死并解剖，取出其心臟、肝臟、腎臟，并肉眼觀察有無異常變化。在稱重后用10%福爾馬林固定液固定24 h以上后進行脫水、包埋、切片、蘇木素伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下進行病理學(xué)形態(tài)研究。

1.4.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS26.0版統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，各組計量數(shù)均以ˉX±S表示，采用單因素方差分析考察其顯著性，組間進行兩兩比較，采用LSD方法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，以P<0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠體質(zhì)量的影響

對小鼠飲食和活動情況進行了觀察。對照組和給藥組有若干只小鼠在灌胃后當(dāng)天出現(xiàn)行動遲緩、炸毛等癥狀，且在4 h后癥狀消失，其他小鼠未出現(xiàn)異常癥狀，且在7 d觀察期內(nèi)，未出現(xiàn)小鼠死亡情況，并且各小鼠進食飲水、毛色狀態(tài)和行動狀況均正常，說明葛根素對小鼠的一般生長情況沒有較大影響。

在實驗期間對小鼠進行了稱重，并對各組數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，與對照組比較，給藥組小鼠在灌胃葛根素前后體質(zhì)量未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，表明葛根素對小鼠正常的生長情況無影響。

表1 葛根素對小鼠體重變化的影響(n=5)

2.2 小鼠主要臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)是小鼠臟器與體重的比值，當(dāng)小鼠臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。因此本實驗對各組小鼠的主要臟器指數(shù)進行了分析，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，與對照組相比，給藥組小鼠的心臟、肝臟、腎臟指數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)，表明葛根素對小鼠臟器指數(shù)無明顯影響。

表2 葛根素對小鼠臟器指數(shù)變化的影響(n=5)

2.3 小鼠肝功能、腎功能和心功能的影響

對小鼠血清的各生化指標(biāo)(包括肝功能、腎功能和心功能指標(biāo))按1.4.2方法進行分析。結(jié)果表明，與對照組小鼠比較，給藥組雌性小鼠尿素(UREA)含量由5.80顯著上升至 6.93 mmol·L-1(P<0.05，見圖1-a)；給藥組雌雄小鼠心臟生化指標(biāo)LDH水平由472.60和520.60 U·L-1分別下降至411.15和 300.21 U·L-1(P<0.01，見圖1-b)；給藥組雄性小鼠血清中HBDH含量由193.60顯著下降為130.01 U·L-1(P<0.01，見圖1-c)；而其他各生化指標(biāo)值與對照組相比均沒有顯著的差異。因上述結(jié)果表明，當(dāng)小鼠灌胃該實驗劑量的葛根素后，小鼠的一些腎功能指標(biāo)和心功能指標(biāo)會發(fā)生一些變化。

注：*表示與對照組之間具有顯著性差異(P<0.05)；#表示與對照組之間差異十分顯著(P<0.01)。

2.4 小鼠臟器組織病理分析

對小鼠的臟器(包括肝臟、心臟和腎臟)按1.4.3方法進行處理，并進行病理學(xué)形態(tài)研究，結(jié)果見圖2-圖4。由圖2可見，對照組雌雄小鼠的肝臟和給藥組雌雄小鼠的肝臟均呈現(xiàn)一定程度的嗜酸性變，因此相比對照組小鼠肝臟而言，給藥組雌雄小鼠肝臟基本沒有受到損傷；由圖3可見，給藥組雌雄小鼠心臟除存在局灶嗜酸性變外還伴有部分心肌溶解，周圍心肌細(xì)胞壞死；由圖4可見，對照組雌雄小鼠腎臟存在少許嗜酸性變，而給藥組雌雄小鼠存在局灶嗜酸性變和腎小管間質(zhì)局灶性出血。以上病理學(xué)形態(tài)分析結(jié)果表明，該實驗劑量的葛根素對小鼠的肝臟幾乎不產(chǎn)生影響，而對小鼠的心臟和腎臟均有一定程度的影響。

a-對照組雄性；b-對照組雌性；c-給藥組雄性；d-給藥組雌性。

a-對照組雄性；b-對照組雌性；c-給藥組雄性；d-給藥組雌性。

a-對照組雄性；b-對照組雌性；c-給藥組雄性；d-給藥組雌性。

3 結(jié)論

對小鼠一次性灌胃劑量為6000 mg·kg-1葛根素后，各組小鼠一般活動狀態(tài)良好，且未出現(xiàn)死亡。進一步對小鼠血清的各生化指標(biāo)進行分析，結(jié)果表明，雌性小鼠的腎臟生化指標(biāo)UREA水平顯著低于對照組雌性小鼠，且給藥組雄性小鼠心臟生化指標(biāo)LDH、HBDH和雌性小鼠的LDH值與對照組相比顯著降低。對小鼠心臟、肝臟和腎臟進行組織病理學(xué)分析，結(jié)果顯示該劑量的葛根素對小鼠心臟及腎臟具有較輕微影響。因此，本文實驗劑量6000 mg·kg-1為大于葛根臨床劑量的100倍。由實驗結(jié)果可知，此劑量下葛根素的攝入量對人體健康沒有影響。以上研究結(jié)果為葛根素進一步慢性毒性實驗提供了重要的實驗依據(jù)，并為指導(dǎo)人們安全使用葛根提供了一定的理論依據(jù)。