新型鴨呼腸孤病毒動(dòng)物感染模型的建立

羅 丹，劉 芮，高玉龍，李 凱，劉長(zhǎng)軍，祁小樂(lè)，崔紅玉，張艷萍，潘 青，高 立*，王笑梅,2*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009）

2006 年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)鴨脾壞死病（Duck spleen necrosis disease，DSND），該病是由新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus，NDRV）引起的一種以鴨脾臟表面出血或壞死為病變特征的疾病[1-3]。自2017 年以來(lái)，DSND 在山東、江蘇和河南等地區(qū)的養(yǎng)鴨場(chǎng)中時(shí)有暴發(fā)，有研究表明其致病性與先前報(bào)道的DSND 不同，呈不斷變異和增強(qiáng)態(tài)勢(shì)[4-6]。NDRV主要感染30 日齡以?xún)?nèi)的雛鴨，脾臟為其主要靶器官，感染日齡愈小，發(fā)病率和死亡率愈高。目前，該病已廣泛存在于我國(guó)水禽飼養(yǎng)地區(qū)，給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[7-12]。

然而，目前尚無(wú)商業(yè)疫苗用于新型鴨呼腸孤病毒病的防控。隨著NDRV 感染宿主范圍和地理位置的不斷擴(kuò)大，NDRV 疫苗的研發(fā)愈發(fā)重要，而動(dòng)物感染模型是評(píng)價(jià)疫苗效果的重要工具[13-18]，但相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期流行病學(xué)調(diào)查和致病性研究表明，2019 年分離的以脾臟腫脹壞死為特征的SD19/6201 株為NDRV 流行代表株[7-8]，因此本研究選用該病毒株建立了NDRV 的14 日齡和21 日齡雛鴨感染模型，確定了感染劑量、剖檢時(shí)間及發(fā)病指標(biāo)，為NDRV 疫苗免疫效果評(píng)價(jià)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料NDRV SD19/6201 株（MT829205～MT829214）由本實(shí)驗(yàn)室保存。SPF 麻鴨購(gòu)自國(guó)家禽類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫(kù)，飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器中，且本研究中涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已獲得黑龍江省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照科學(xué)技術(shù)部的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南》以及動(dòng)物道德準(zhǔn)則和批準(zhǔn)的規(guī)程操作。

TRIzol、Premix ExTaq（Probe qPCR）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；M-MLV Reverse Transcriptase 購(gòu)自Invitrogen 公司。

1.2 NDRV 動(dòng)物感染試驗(yàn)將120 只1 日齡SPF 雛鴨隨機(jī)分成6 組（1～4 組為感染組、5～6 組為對(duì)照組），每組20 只，飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器中。將SPF 雛鴨飼養(yǎng)至14 日齡時(shí)，組1 和組2 分別按105.0ELD50/0.1 mL/只和106.0ELD50/0.1 mL/只劑量經(jīng)腿部肌肉接種NDRV SD19/6201 株，組5 對(duì)照組經(jīng)腿部肌肉接種0.1 mL PBS；將SPF雛鴨飼養(yǎng)至21日齡時(shí)，組3和組4分別按105.0ELD50/0.1 mL/只、106.0ELD50/0.1 mL/只劑量經(jīng)腿部肌肉接種NDRV SD19/6201 株，組6 對(duì)照組經(jīng)腿部肌肉接種0.1 mL PBS。采用隔離器飼養(yǎng)，保證充足的飲水、采食和光照。

1.3 NDRV 感染SPF 鴨臨床癥狀及剖檢變化1.2中SPF 雛鴨感染后每天早晚各觀察一次，記錄發(fā)病和死亡情況，連續(xù)觀察7 d。分別在感染后第5 d（5 dpi）、7 dpi 自各組中隨機(jī)選取10 只雛鴨，頸靜脈放血迫殺后剖檢并觀察脾臟有無(wú)腫脹、出血點(diǎn)（斑）或黃白色壞死灶等病理變化。

1.4 NDRV 感染SPF 鴨脾臟組織病理學(xué)觀察將分別于感染后第5 d、7 d 采集的各組SPF 雛鴨的脾臟組織一部分按常規(guī)方法固定于福爾馬林溶液，制作病理切片，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察分析。另一部分-20 ℃保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)病毒載量的檢測(cè)。

1.5 各組鴨脾臟指數(shù)的測(cè)定在5 dpi、7 dpi 分別取6 組各其余10 只，稱(chēng)重后放血剖殺，采集脾臟稱(chēng)重，計(jì)算脾臟比重和脾臟指數(shù)（脾臟比重=脾臟重/體重，脾臟指數(shù)=感染組脾臟比重/對(duì)照組脾臟比重）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用GraphPad Prism 8 雙因素方差分析方法（Two-way-ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

1.6 各組鴨脾臟病毒載量檢測(cè)取1.4 中采集的各組雛鴨脾臟組織各1 g，研磨破碎后采用TRIzol 試劑進(jìn)行病毒RNA 提取，利用M-MLV Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，采用文獻(xiàn)[19]中NDRV 熒光定量引物和探針，參照文獻(xiàn)[20]中TaqMan 熒光定量RT-PCR 方法對(duì)各組雛鴨脾臟中的病毒載量進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次，并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 NDRV 感染SPF 鴨臨床癥狀及剖檢變化將NDRV SD19/6201 株分別感染SPF 雛鴨后觀察雛鴨臨床癥狀及剖檢變化。結(jié)果顯示，感染組雛鴨均表現(xiàn)為喜臥、精神稍有沉郁等臨床癥狀，無(wú)死亡，對(duì)照組無(wú)明顯異常。剖檢觀察可見(jiàn)，各感染組發(fā)病鴨脾臟出現(xiàn)腫大、表面有出血斑或壞死灶等特征性病變，而其他臟器和對(duì)照組各臟器均無(wú)明顯眼觀病變（圖1）。將脾臟出血或壞死等特征性病變作為NDRV 感染雛鴨的發(fā)病指標(biāo)，各組發(fā)病比率統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 NDRV感染鴨的發(fā)病率統(tǒng)計(jì)Table 1 Morbidity of animals infected with NDRV

14 日齡感染雛鴨，5 dpi 時(shí)低劑量感染組雛鴨剖檢病變以脾臟出血點(diǎn)/斑為主，脾臟病變比率為70%（圖1A）；高劑量感染組所有雛鴨脾臟均出現(xiàn)黃白色壞死灶，脾臟病變比率為100%。7 dpi 時(shí)雛鴨脾臟病變更加嚴(yán)重，甚至個(gè)別脾臟完全壞死，低高劑量組脾臟的病變比率分別為80%和90%。

與14 日齡雛鴨相比，21 日齡雛鴨感染后脾臟剖檢病變較輕（圖1），低劑量感染組雛鴨在5 dpi 和7 dpi 脾臟出現(xiàn)腫大、出血或壞死的比率明顯低于相同劑量的14 日齡雛鴨感染組；高劑量感染組雛鴨在5 dpi 和7 dpi 脾臟出現(xiàn)出血、壞死的比率均為80%，但7 dpi 脾臟黃白色壞死灶病變較5 dpi 更明顯。各對(duì)照組雛鴨未見(jiàn)異常，剖檢脾臟無(wú)任何病變（圖1B）。

圖1 NDRV感染雛鴨的脾臟剖檢病變Fig.1 Spleen lesion of ducklings infected with NDRV

以上結(jié)果表明，NDRV 感染引起的脾臟病變程度與感染鴨日齡呈負(fù)相關(guān)，與21 日齡雛鴨感染組相比，14 日齡雛鴨對(duì)NDRV 更易感，表現(xiàn)為感染雛鴨脾臟發(fā)病率更高，脾臟眼觀病變更嚴(yán)重。

2.2 NDRV 感染SPF 鴨脾臟組織病理學(xué)觀察在5 dpi、7 dpi 采集各組SPF 鴨的脾臟組織，制作病理切片后觀察組織病變，結(jié)果顯示感染組鴨均可見(jiàn)脾臟紅白髓界限不清，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，異嗜細(xì)胞浸潤(rùn)，呈局灶性壞死等。其中在7 dpi 時(shí)，高劑量感染組14 日齡雛鴨脾臟局部出現(xiàn)大面積壞死，伴隨蛋白樣滲出，巨噬細(xì)胞增生（圖2B、圖2C），21 日齡雛鴨脾臟組織內(nèi)淋巴細(xì)胞大量減少，脾臟紅髓可見(jiàn)異嗜細(xì)胞增生。對(duì)照組鴨脾臟組織正常。上述結(jié)果顯示，與14 日齡雛鴨感染組相比，21 日齡雛鴨感染組脾臟組織病變更輕（圖2E、圖2F），這與剖檢病變一致。表明以脾臟剖檢病變作為NDRV 感染模型發(fā)病指標(biāo)具有科學(xué)性。

圖2 高劑量NDRV感染雛鴨脾臟病理組織切片觀察結(jié)果（標(biāo)尺為100 μm）Fig.2 Results of histopathological section in spleen of the high dose NDRV infected ducklings(Scale is 100 μm)

2.3 各組鴨脾臟指數(shù)的測(cè)定結(jié)果各組鴨脾臟指數(shù)的測(cè)定結(jié)果顯示，14 日齡和21 日齡感染雛鴨在5 dpi 脾臟指數(shù)顯著或者極顯著高于對(duì)照組（P＜0.05 或P＜0.001；圖3A），在7 dpi 14 日齡雛鴨感染組脾臟指數(shù)與對(duì)照組脾臟指數(shù)無(wú)明顯差異，但脾臟壞死癥狀并未恢復(fù)（圖1A）；在5 dpi 和7 dpi 時(shí)21 日齡感染雛鴨脾臟指數(shù)均顯著或者極顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，P＜0.01 或P＜0.001；圖3B），但脾臟腫脹程度7 dpi 時(shí)較5 dpi 減輕。以上結(jié)果表明，NDRV 可引起感染雛鴨脾臟腫大，隨著感染時(shí)間的推移脾臟腫大程度變輕，但其壞死癥狀并未恢復(fù)。

圖3 NDRV感染后不同時(shí)間鴨的脾臟指數(shù)Fig.3 Index of spleen at different time points after NDRV infection

2.4 各組鴨脾臟病毒載量檢測(cè)結(jié)果利用熒光定量PCR 檢測(cè)方法對(duì)靶器官脾臟進(jìn)行病毒載量的檢測(cè)，結(jié)果顯示，在5 dpi 即可在各組感染雛鴨脾臟中檢測(cè)到大量病毒，且高劑量感染組雛鴨脾臟中病毒載量高于低劑量感染組雛鴨；在5 dpi 時(shí)14 日齡雛鴨（低日齡）各劑量感染組病毒載量明顯高于21 日齡雛鴨（高日齡）各劑量感染組；在7 dpi，除21 日齡高劑量感染組雛鴨脾臟中病毒載量稍高于5 dpi 外，其余各劑量感染組脾臟病毒載量均明顯低于5 dpi（圖4）。

圖4 NDRV感染雛鴨脾臟病毒載量的檢測(cè)Fig.4 Detection of viral loads in spleen of the NDRV infected ducklings

以上結(jié)果顯示，NDRV 在低日齡雛鴨脾臟中復(fù)制滴度明顯高于高日齡雛鴨，表明NDRV 在低日齡雛鴨脾臟中的復(fù)制能力更強(qiáng)，這可能是造成NDRV在不同日齡雛鴨上致病性差異的原因，即隨著雛鴨日齡的增大而對(duì)該病原易感性降低，抵抗力增強(qiáng)。

2.5 NDRV 動(dòng)物感染模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定通過(guò)以不同劑量NDRV 感染不同日齡雛鴨，以雛鴨脾臟特征性出血或壞死作為NDRV 感染的發(fā)病指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率，確定了NDRV 對(duì)14 日齡雛鴨的最佳感染劑量為105.0ELD50/0.1 mL，對(duì)21 日齡雛鴨的最佳感染劑量為106.0ELD50/0.1 mL，最佳迫殺時(shí)間均為7 dpi，此時(shí)脾臟黃白色壞死灶明顯，脾臟病變比率可達(dá)80%（8/10）。

3 討 論

NDRV 感染是嚴(yán)重危害我國(guó)水禽業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病之一。近年來(lái)，針對(duì)該病原的疫苗研發(fā)是目前的關(guān)注點(diǎn)，但如何對(duì)相關(guān)疫苗效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，一直是限制該病疫苗研發(fā)的瓶頸，而NDRV 動(dòng)物感染模型的建立是評(píng)價(jià)疫苗效果的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得9 株NDRV，對(duì)其主要保護(hù)性抗原基因σC 的遺傳進(jìn)化分析表明，NDRV SD19/6201 株為當(dāng)前流行代表株[7-8]。因此本研究以該病毒株建立動(dòng)物感染模型具有普適性。

NDRV 對(duì)雛鴨的致病與其日齡呈負(fù)相關(guān)，即雛鴨感染日齡越大，病毒對(duì)其致病性越弱[21]?；谠摬≡攸c(diǎn)，應(yīng)盡量選擇小日齡雛鴨進(jìn)行動(dòng)物感染試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，NDRV 感染1 日齡雛鴨后的10 d～14 d 為抗體高水平期，之后抗體水平開(kāi)始下降[8]。李靜等將NDRV-SDYC 株作為疫苗株，制備油乳劑滅活疫苗免疫1 日齡雛鴨后5 d 開(kāi)始產(chǎn)生抗體，14 d 和21 d 為抗體高水平期[22]，這與本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果基本一致。NDRV 主要侵害30 日齡以?xún)?nèi)的雛鴨，為了使其高峰抗體水平可覆蓋整個(gè)易感期，所以常在1 日齡或7 日齡免疫NDRV 候選疫苗，免疫后14 d 或21 d 抗體水平較高，此時(shí)進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)疫苗免疫效果較合理。因此，本研究以不同劑量NDRV SD19/6201 株感染14 日齡和21 日齡雛鴨，建立了NDRV 對(duì)14 日齡和21 日齡雛鴨的感染模型。

有研究報(bào)道湖北地區(qū)的鴨呼腸孤病毒感染主要以脾臟和法氏囊壞死為主要特征[23]；廣西、山東、廣東及江蘇等地的NDRV 分離株主要引起雛鴨脾臟腫大和壞死[24]。由于靶器官脾臟是NDRV 檢測(cè)和分離的首選臟器[25-26]，因此，雛鴨脾臟的病理變化是該病原感染模型建立的主要依據(jù)，雛鴨脾臟出血或壞死的特征性病變可作為NDRV 感染雛鴨的發(fā)病指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室前期在1 日齡雛鴨上開(kāi)展了NDRV 的動(dòng)物感染試驗(yàn)，分別在1 dpi、3 dpi、5 dpi、7 dpi、10 dpi、14 dpi 對(duì)雛鴨進(jìn)行剖檢觀察可見(jiàn)，在1 dpi～3 dpi 雛鴨脾臟病變以出血、腫脹為主，病變輕微；在5 dpi～10 dpi 雛鴨脾臟病變最嚴(yán)重，特別是在7 dpi和10 dpi，脾臟病變以黃白色壞死點(diǎn)、斑為主；在14 dpi 雛鴨脾臟壞死斑病變有所恢復(fù)，病變較輕微[8]。鑒于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在本研究選擇5 dpi 和7 dpi 2 個(gè)迫殺時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，最終確定了最佳迫殺時(shí)間為7 dpi，各感染組脾臟病變以黃白色壞死灶為主，能夠保證發(fā)病率統(tǒng)計(jì)的準(zhǔn)確性。與SD19/6201 株感染21日齡雛鴨相比，病毒感染14 日齡雛鴨脾臟出現(xiàn)出血或壞死的比率更高、病變更明顯，且脾臟病理變化更嚴(yán)重。提示14 日齡雛鴨對(duì)NDRV 更易感。Li 等人將NDRV 接種21 日齡櫻桃谷鴨的致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，21 日齡櫻桃谷鴨對(duì)NDRV 有很強(qiáng)的抵抗力[27]。本研究中21 日齡雛麻鴨對(duì)NDRV 的感染也呈現(xiàn)出一定的抵抗力，但106.0ELD50/0.1 mL/只的高接種劑量也能引起21 日齡雛麻鴨脾臟出現(xiàn)80%的病變比率，這可能與不同NDRV 分離株的致病力和被感染鴨的品種有關(guān)。本研究初期也曾嘗試建立6 周齡麻鴨的NDRV 感染模型，但該日齡麻鴨感染NDRV 后無(wú)任何臨床癥狀，各器官特別是靶器官脾臟也無(wú)任何剖檢變化，進(jìn)一步體現(xiàn)了該病原與鴨日齡呈負(fù)相關(guān)的致病特點(diǎn)，隨著鴨子日齡的增大對(duì)該病原的易感性明顯降低，抵抗力明顯增強(qiáng)。

綜上，結(jié)合NDRV 的致病特點(diǎn)，本研究確定了NDRV 對(duì)14 日齡雛鴨的最佳感染劑量為105.0ELD50/0.1 mL/只，21 日齡雛鴨最佳感染劑量為106.0ELD50/0.1 mL/只，最佳迫殺時(shí)間均為7 dpi，以脾臟出血、壞死為發(fā)病指標(biāo)，病變率為80%（8/10）。本研究首次建立了NDRV 對(duì)不同日齡雛鴨的動(dòng)物感染模型，該感染模型評(píng)價(jià)指標(biāo)直觀，可操作性強(qiáng)，也便于基層推廣應(yīng)用，為DSND 相關(guān)疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供重要依據(jù)。