間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有強(qiáng)大分泌功能的多能干細(xì)胞，顯著的組織修復(fù)功能和廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能使其研究熱度在近年來不斷增加。盡管MSCs具有良好的臨床應(yīng)用潛力，但MSCs回輸是否會(huì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展仍有爭(zhēng)議，而且有較多報(bào)道建立在對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行傳統(tǒng)二維(2D)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，這種培養(yǎng)方法與體內(nèi)細(xì)胞生存環(huán)境有明顯差異。三維(3D)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)被認(rèn)為可以使細(xì)胞在更接近生態(tài)位的環(huán)境中生長(zhǎng)，利于其生理形態(tài)和功能的維持，在3D培養(yǎng)條件下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)也能更好地模擬其體內(nèi)生長(zhǎng)過程。本研究建立了食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)細(xì)胞系KYSE450的3D成球培養(yǎng)方法，同時(shí)觀察了不同濃度臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)培養(yǎng)上清液對(duì)其成球的影響，為MSCs在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用墊定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

EliteGro

-Adv(NHR010059，Biomedical EliteCell Corp)、MSCBM培養(yǎng)基(MSC12104，達(dá)優(yōu))、RMPI-1640培養(yǎng)基(Biological Industries)、Y-27632(hydrochloride，PeproTech)、Matrigel(BD)、胎牛血清(Gibco)、0.25%胰蛋白酶/EDTA(T1320，索萊寶)、高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(Molecular Devices，IXM-c)。

UCMSCs為鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)室自主分離所得，符合國(guó)際公認(rèn)的MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)，使用通過了我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：2022098)。UCMSCs使用無血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

KYSE450來自鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心。對(duì)凍存細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇及培養(yǎng)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞胰酶消化計(jì)數(shù)備用。利用本課題組建立的類器官培養(yǎng)方法進(jìn)行體外ESCC細(xì)胞系KYSE450成球培養(yǎng)。具體方法:KYSE450細(xì)胞用Matrigel(冰上操作，4 ℃以下為液態(tài))重懸，預(yù)冷槍頭將含有細(xì)胞的膠體迅速接種在96孔板中，每孔約5 μl。將96孔板在培養(yǎng)箱中放置30 min，待Matrigel固化后加入100 μl含Y27632的類器官培養(yǎng)基(organoid medium，OM)。OM使用市售的DMEM/F12培養(yǎng)基，在其中加入生長(zhǎng)因子，包括EGF、R-spondin 1、Noggin等。培養(yǎng)過程中每隔48 h更換培養(yǎng)基，同時(shí)使用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)每24 h對(duì)96孔板中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行拍照。

將復(fù)蘇的原代UCMSCs常規(guī)培養(yǎng)至P3并收集培養(yǎng)上清液，用透析袋透析脫鹽，上清液和滅菌去離子水的比例1∶100，換水3次，透析24 h，隨后將透析后的上清液用凍干機(jī)去除水分，獲得凍干粉(-20 ℃保存?zhèn)溆?。用PBS配制凍干粉濃縮液，按照不同比例加入OM培養(yǎng)基中，使上清液凍干粉終濃度分別為3 000 μg/ml、300 μg/ml、30 μg/ml、3 μg/ml。KYSE450接種于96孔板當(dāng)天記為Day 0，單一使用OM培養(yǎng)24 h后加入含不同濃度上清液的OM培養(yǎng)基。用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)觀察各濃度組的細(xì)胞成球情況并拍照，利用系統(tǒng)自帶工具測(cè)量腫瘤細(xì)胞球直徑。

T表示協(xié)同集聚對(duì)區(qū)域經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的總效應(yīng)，當(dāng)ln innit＞1.081時(shí)，T＞0，說明只有在技術(shù)創(chuàng)新能力達(dá)到一定值 （1.081）時(shí)，協(xié)同集聚才會(huì)對(duì)區(qū)域經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)產(chǎn)生正向影響，如果創(chuàng)新能力低于1.081，協(xié)同集聚的區(qū)域經(jīng)濟(jì)效應(yīng)為負(fù)。通過對(duì)ln inn的403個(gè)觀察值進(jìn)行排序，發(fā)現(xiàn)只有武漢和長(zhǎng)沙在2005～2017年內(nèi)ln inn全都大于1.081，說明這兩個(gè)城市的協(xié)同集聚對(duì)區(qū)域經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的總效應(yīng)始終為正。而發(fā)展相對(duì)落后的城市，如上饒、吉安、撫州等城市的ln inn在考察期內(nèi)從未超過1.081這一門檻，說明這些城市協(xié)同集聚對(duì)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的總效應(yīng)一直為負(fù)。

2 結(jié)果

本研究在前期實(shí)驗(yàn)中測(cè)得生理狀態(tài)UCMSCs上清液濃度約3 000 μg/ml，是細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的最大生理濃度，因此，本實(shí)驗(yàn)將上清液最大濃度設(shè)定為該濃度。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，不同濃度組的細(xì)胞球直徑逐漸增大(見圖2A)。Day 1～Day 5不同濃度組的細(xì)胞球直徑均有增加，Day 6除3 000 μg/ml組外，其余各組細(xì)胞球均出現(xiàn)崩解，OM組崩解程度較高(見圖2B)。Day 6后對(duì)3 000 μg/ml組繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞球在培養(yǎng)第12天仍能保持完整形態(tài)(見圖2C)。

Vector Informatik GmbH公司成立于1988年，總部位于德國(guó)斯圖加特。Vector是全球領(lǐng)先的分布式系統(tǒng)開發(fā)工具、網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)測(cè)試驗(yàn)證工具和嵌入式軟件組件供應(yīng)商，為汽車電子電氣系統(tǒng)設(shè)計(jì)，總線網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)、建模、仿真、分析、測(cè)試以及ECU的開發(fā)、測(cè)試、標(biāo)定和診斷等過程提供一系列強(qiáng)有力的軟硬件工具和源代碼，支持CAN、LIN、MOST、FlexRay、以太網(wǎng)、SAEJ1939、OSEK/VDX和AUTOSAR等多種總線、協(xié)議和標(biāo)準(zhǔn)。

使用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)對(duì)固定視野采集圖像，結(jié)果顯示,Day 1有少量距離接近的細(xì)胞匯合成球，單個(gè)細(xì)胞可通過分裂成球。隨后可見腫瘤細(xì)胞球直徑逐漸增大，球體的邊緣光滑清晰，折光性強(qiáng)，內(nèi)部細(xì)胞生長(zhǎng)緊湊；Day 5及以后大部分球體發(fā)生崩解，邊緣凹凸不平，球體內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散，少量細(xì)胞從球體中脫落(見圖 1)。

Day 2和Day 5時(shí)3 000 μg/ml組的細(xì)胞球直徑大于OM組(

=0.014，

=0.031)。Day 6時(shí)3 000 μg/ml組直徑大于其余各組，并與OM組、30 μg/ml組、3 μg/ml組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

=0.000、

=0.007、

=0.001)；OM組細(xì)胞球直徑則小于其余各組，且與3 000 μg/ml組、300 μg/ml組、30 μg/ml組差異顯著(

=0.000、

=0.000、

=0.008)。

3 討論

盡管MSCs在組織損傷修復(fù)、免疫相關(guān)疾病中表現(xiàn)出了明確的療效，但MSCs與腫瘤之間的相互作用，尤其是MSCs細(xì)胞移植治療對(duì)腫瘤患者的影響，仍存在爭(zhēng)議。腫瘤分泌細(xì)胞因子募集MSCs，而MSCs分泌CXCL12/CXCR4環(huán)路相關(guān)因子也能促使其自身向腫瘤遷移

。MSCs對(duì)腫瘤的作用與該治療方法的安全性有關(guān)，有研究表明，MSCs參與了腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironments，TMEs)的構(gòu)成

，并通過旁分泌和分化作用調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)程；MSCs還可通過抑制免疫、分化為腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞(tumor-associated stromal cells，TASCs)、促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤抗凋亡、血管生成及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)等過程來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)

。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多種成體來源的MSCs(脂肪、骨髓、臍帶、胎盤等)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，包括結(jié)腸癌

、乳腺癌

、胰腺癌

、前列腺癌

等。但這些結(jié)果多建立在2D培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，無法準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)作用。腫瘤細(xì)胞在2D環(huán)境中的生長(zhǎng)狀態(tài)與3D環(huán)境相差較明顯，在2D培養(yǎng)模式下進(jìn)行的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)僅是針對(duì)單一細(xì)胞群，忽視了腫瘤的立體結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)，3D培養(yǎng)在一定程度上可以模擬天然組織中細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的相互作用，這在干細(xì)胞培養(yǎng)和分化癌生物學(xué)，藥物和毒性篩選及組織工程中意義重大

。目前，3D模式的腫瘤成球培養(yǎng)及類器官培養(yǎng)越來越多地被應(yīng)用到了科研中

。

《魯迅先生石膏面型》《魯迅先生塑像》這兩件作品還有個(gè)現(xiàn)象耐人尋味。為逝者塑像是人類一種古老的視覺信仰。但是出于對(duì)死者的尊重和遺容的保護(hù)，在這種情形中死者畫像的觀者一般僅局限于家族成員或故交舊友范圍內(nèi)，同時(shí)它的傳播也限于宗廟墓室、廳堂居室等特定的相對(duì)封閉的空間里，由此產(chǎn)生的畫像數(shù)量相對(duì)有限，更不可能大量復(fù)制和廣泛傳播。但是，兩件魯迅雕塑《魯迅先生石膏面型》《魯迅先生塑像》分別于當(dāng)年的11月、12月公開發(fā)表在《作家》第2卷第2號(hào)、《文季月刊》第2卷第1號(hào)上。那么，到底是誰要公開傳播魯迅的遺容呢？

為了探索UCMSCs上清對(duì)KYSE450細(xì)胞球形成和發(fā)展的影響，本研究在對(duì)KYSE450進(jìn)行3D成球培養(yǎng)過程中加入了不同濃度的UCMSCs培養(yǎng)上清液凍干粉。凍干粉可以減少上清中鹽濃度對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，只保留上清液中主要的蛋白質(zhì)成分。此外，凍干粉可以配制高濃度的上清濃縮液，便于觀察不同濃度的上清液對(duì)腫瘤細(xì)胞成球的影響，且排除了OM培養(yǎng)基因體積增加被稀釋，從而影響細(xì)胞成球的可能。既往研究認(rèn)為，在成球培養(yǎng)中，由于單個(gè)細(xì)胞可經(jīng)過增殖形成細(xì)胞球，故球體總數(shù)的變化并不顯著

，本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)中也觀察到了類似現(xiàn)象。因此，實(shí)驗(yàn)中僅對(duì)腫瘤細(xì)胞球的直徑進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，最高濃度組的細(xì)胞球直徑較其他組更大，部分細(xì)胞球在培養(yǎng)第12天仍能保持完整形態(tài)。Dhiman等在其研究中對(duì)A459進(jìn)行了微流控3D培養(yǎng)，加入間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基后培養(yǎng)的5 d時(shí)間里，A459細(xì)胞球的平均直徑增加了15.7%，直徑和增長(zhǎng)速度顯著大于單一培養(yǎng)組

。另有研究發(fā)現(xiàn)，將腫瘤相關(guān)MSCs與A459共培養(yǎng)后，A459形成的細(xì)胞球形態(tài)最完美且隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而更緊密

。也有研究發(fā)現(xiàn)，加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后3D腫瘤微球在第1天就表現(xiàn)出了高度緊湊的形態(tài)，培養(yǎng)過程中球體致密程度大于無BMSCs組

。這些結(jié)果與我們的研究結(jié)果一致。由此可見，UCMSCs培養(yǎng)上清液對(duì)ESCC細(xì)胞系KYSE450的體外成球具有促進(jìn)作用，尤其是對(duì)細(xì)胞球大小和球體維持時(shí)間上有促進(jìn)作用。

[1]Quante M, Tu SP, Tomita H, et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth [J]. Cancer Cell, 2011, 19(2): 257-272. DOI: 10.1016/j.ccr.2011.01.020.

[2]Menon LG, Picinich S, Koneru R, et al. Differential gene expression associated with migration of mesenchymal stem cells to conditioned medium from tumor cells or bone marrow cells [J]. Stem Cells, 2007, 25(2): 520-528. DOI: 10.1634/stemcells.2006-0257.

[3]Li P, Gong Z, Shultz LD, et al. Mesenchymal stem cells: from regeneration to cancer [J]. Pharmacol Ther, 2019, 200: 42-54. DOI: 10.1016/j.pharmthera.2019.04.005.

[4]Rahmatizadeh F, Gholizadeh-Ghaleh Aziz S, Khodadadi K, et al. Bidirectional and opposite effects of na?ve mesenchymal stem cells on tumor growth and progression [J]. Adv Pharm Bull, 2019, 9(4): 539-558. DOI: 10.15171/apb.2019.063.

[5]Wu XB, Liu Y, Wang GH, et al. Mesenchymal stem cells promote colorectal cancer progression through AMPK/mTOR-mediated NF-κB activation [J]. Sci Rep, 2016, 6: 21420. DOI: 10.1038/srep21420.

[6]Kucerova L, Skolekova S, Matuskova M, et al. Altered features and increased chemosensitivity of human breast cancer cells mediated by adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells [J]. BMC Cancer, 2013, 13: 535. DOI: 10.1186/1471-2407-13-535.

[7]Cousin B, Ravet E, Poglio S, et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo [J]. PLoS One, 2009, 4: e6278. DOI: 10.1371/journal.pone.0006278.

[8]Cavarretta IT, Altanerova V, Matuskova M, et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells expressing prodrug-converting enzyme inhibit human prostate tumor growth [J]. Mol Ther, 2010, 18(1): 223-231. DOI: 10.1038/mt.2009.237.

[9]Edmondson R, Broglie JJ, Adcock AF, et al. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors [J]. Assay Drug Dev Technol, 2014, 12(4): 207-218. DOI: 10.1089/adt.2014.573.

[10]Gao D, Vela I, Sboner A, et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer [J]. Cell, 2014, 159(1): 176-187. DOI: 10.1016/j.cell.2014.08.016.

[11]Dhiman N, Shagaghi N, Bhave M, et al. Selective cytotoxicity of a novel trp-rich peptide against lung tumor spheroids encapsulated inside a 3D microfluidic device [J]. Adv Biosyst, 2020, 4(4): e1900285. DOI: 10.1002/adbi.201900285.

[12]Dhiman N, Shagaghi N, Bhave M, et al. Indirect co-culture of lung carcinoma cells with hyperthermia-treated mesenchymal stem cells influences tumor spheroid growth in a collagen-based 3-dimensional microfluidic model [J]. Cytotherapy, 2021, 23(1): 25-36. DOI: 10.1016/j.jcyt.2020.07.004.

[13]Yan C, Chang J, Song X, et al. Lung cancer-associated mesenchymal stem cells promote tumor metastasis and tumorigenesis by induction of epithelial-mesenchymal transition and stem-like reprogram [J]. Aging (Albany NY), 2021, 13(7): 9780-9800. DOI: 10.18632/aging.202732.

[14]Ferreira LP, Gaspar VM, Mano JF. Bioinstructive microparticles for self-assembly of mesenchymal stem cell-3D tumor spheroids [J]. Biomaterials, 2018, 185: 155-173. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2018.09.007.