申少華， 劉迎娣， 王子愷， 李春濤， 李 聞

1.中國人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100853； 2.北京市順義區(qū)醫(yī)院消化內(nèi)科

梗阻性黃疸(obstructive jaundice，OJ)，也稱梗黃，在臨床上較多見，很多疾病均可引起梗黃。膽道梗阻后，因腸道失去膽汁，腸道菌群失調(diào)，腸黏膜屏障遭到破壞，易發(fā)生腸源性細菌異位，進而引起全身感染。并且此時肝臟Kupffer細胞的免疫功能受到抑制，清除內(nèi)毒素的能力下降[1]。以上這些因素最終導致內(nèi)毒素血癥的形成。

我們的研究屬于梗黃系列基礎研究。目前解除膽道梗阻有膽汁內(nèi)引流術和膽汁外引流術兩種方法。我們之前的研究表明，膽汁內(nèi)引流術優(yōu)于外引流術主要在于膽汁酸可促進細胞免疫功能恢復[1]。多數(shù)學者的研究表明，膽汁內(nèi)引流術效果優(yōu)于外引流[2]。但膽汁內(nèi)引流術解除梗黃優(yōu)于外引流術的機制尚不十分清楚。膽汁內(nèi)引流術與外引流術的根本區(qū)別在于膽汁是否重新進入腸道，膽汁酸在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中扮演重要角色[3-4]，膽汁酸通過其受體分子信號傳導通路介導的免疫調(diào)節(jié)作用越來越受到關注和重視。

Gadaleta等[5]研究發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥可能通過病原識別受體通路下游轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的作用，抑制FXR激活和表達；FXR和NF-κB之間在腸道水平存在交互調(diào)節(jié)。

病原模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)在啟動和調(diào)節(jié)天然免疫及誘導獲得性免疫中也起到重要作用，其中TLR4是Toll樣受體家族(Toll like receptors，TLRs)最早被發(fā)現(xiàn)的，并且近些年被大量研究，在迅速識別和對抗外界致病性病原微生物引發(fā)的免疫應答中扮演著重要的角色[6]。本研究就梗黃、內(nèi)外引流術后和激動劑處理后回腸黏膜TLR4和FXR受體表達的變化，初步探討膽汁酸受體與PRRs家族之間的免疫調(diào)控網(wǎng)絡，為指導臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料實驗動物：體質(zhì)量25～35 g的健康雄性昆明小鼠100只購自維通利華科學院實驗動物中心。小鼠在中國人民解放軍總醫(yī)院肝膽外科實驗室動物房飼養(yǎng)，進食水不受限制，普通動物飼料飼養(yǎng)。用恰當型號灌胃針進行灌胃。收集標本時所有動物均為過量乙醚麻醉。本研究得到倫理委員會批準(批號：2016-x11-01)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立：將昆明小鼠常規(guī)喂養(yǎng)1周后，隨機分為四組：梗黃組(OJ組)、膽汁外引流組(ED組)、膽汁內(nèi)引流組(ID組)和假手術組(SH組)，每組15只。另外40只小鼠用同樣方法分成四組，每組10只。每組再均分為激動劑組：FXR激動劑GW4064(美國Abmole Bioscience公司)和對照組：0.5%羧甲基纖維素鈉CMC-Na(美國Sigma公司)，每組各5只，OJ組、SH組分別在第1次手術前1 d開始灌胃，ID組和ED組分別在引流術前1 d開始灌胃，均至取標本當天結(jié)束，其他手術處理及標本制備同第一部分。所有手術過程均采用98%氧氣和28%異氟烷吸入性麻醉。動物模型的建立均是在顯微鏡下完成。這個模型和我們之前課題組李聞等建立的梗黃內(nèi)外引流大鼠模型[7]是一脈相承的，部分細節(jié)因為小鼠體型小而進行了改良(見圖1)。

注：A:分離膽管;B:SH組;C:OJ組;D～E:ED組;F:ID組。

1.2.2 標本制備：SH組和OJ組在手術后第9天處死小鼠并采集標本，ID組和ED組在行引流術后第9天處死小鼠并采集標本。小鼠于取材前禁食12 h，以乙醚持續(xù)麻醉。固定小鼠于手術板，備皮后常規(guī)消毒鋪巾。距回腸末端分別取2 cm、5 cm和5 cm回腸組織，其中2 cm回腸組織置入10%中性福爾馬林溶液固定至少24 h，兩份5 cm回腸組織用外科剪沿縱軸剪開，然后用無菌的載玻片刮取腸黏膜組織，分別置入已標記好的無菌無RNA酶的凍存管中。迅速放入液氮后，盡快轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存待用。回腸離體后應在10 min內(nèi)完成標本制備。

1.2.3 檢測指標：(1)SH組、OJ組稱取手術前后小鼠的體質(zhì)量；ID組、ED組稱取二次手術前后的體質(zhì)量，計算前后體質(zhì)量差值。(2)肝功檢測：于取標本日用1 ml注射器心臟取血，離心取上層血清約0.5 ml用來檢測肝功：ALT、TBIL、DBIL、ALP。多功能酶標儀連續(xù)檢測即可計算出各個值。(3)病理學檢測：HE染色病理學觀察分析：將制成的肝組織蠟塊切成約4 μm厚度的切片，進行HE染色，光鏡觀察并顯微照相，最終比較四組小鼠回腸黏膜炎癥情況。(4)蛋白質(zhì)印跡分析(Western blotting)：使用RIPA裂解液及PMSF提取總的蛋白，取各組20 μg混合總蛋白以10% SDS-PAGE凝膠電泳分離。電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉封閉過夜，分別加入FXR(1∶2 000，Abcam，ab129089)、TLR4(1∶1 000，Abcam，ab22048)和β-actin一抗(1∶2 000，Abcam，ab8227)于封閉袋中4 ℃孵育過夜；二抗室溫孵育1 h。最后在凝膠成像系統(tǒng)顯影中得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參計算比較目標蛋白表達量。(5)實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：用SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen，cat. No: 18080-051)，按產(chǎn)品說明書進行實驗操作，取2 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。引物設計來自北京賽百盛公司，Actin引物序列上游引物：5′-CAGAAGGAGATTACTGCTCTGGCT-3′，下游引物：5′-GGAGCCACCGATCCACACA-3′；FXR引物序列上游引物：5′-CGGCGGAGATTTTCAATAAG-3′，下游引物：5′-GAAACTGAACATCGGGGTTAT-3′；TLR4引物序列上游引物：5′-TTCAGAACTTCAGTGGCTGG-3′，下游引物：5′-TGTTAGTCCAGAGAAACTTCCTG-3′。Roche 480型熒光定量PCR儀(瑞士Roche)，25 μl反應體系熒光染料法，95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min此步驟收集熒光信號，40個循環(huán)，反應完成后同在60～95 ℃進行融解曲線分析，每10 s升高1 ℃。內(nèi)參和目的片段分別同批擴增，每組設置3個復孔，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量及一般情況SH組小鼠皮膚、飲食、活動量及尿、便正常，體質(zhì)量增加明顯，與OJ組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與ED組、ID組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；OJ組小鼠皮膚發(fā)黃，毛發(fā)粗亂無光澤，尿色深黃，大便干結(jié)、量少，呈現(xiàn)便秘狀態(tài)，結(jié)腸內(nèi)糞塊零星分布，飲食、活動量減少，體質(zhì)量略增加，與ID組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與ED組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。膽汁引流術后小鼠一般狀態(tài)均好轉(zhuǎn)。與其他三組比較，ED組小鼠體質(zhì)量明顯下降。ID組與OJ組比較，實驗小鼠基本狀態(tài)改善，體質(zhì)量略增加(見表1)。

表1 各組小鼠手術前、后體質(zhì)量及二者差值結(jié)果Tab 1 Pre- and post-surgery weights and the differences between them in each group

2.2 肝功能梗黃小鼠肝功能變得很差。小鼠膽道梗阻后，肝功能指標ALT、TBIL、DBIL和ALP較SH組明顯升高，行膽汁內(nèi)外引流術后，ID和ED組小鼠上述各項肝功能指標顯著改善，與SH組比較，差異無統(tǒng)計學意義(見表2)。

表2 各組小鼠手術后肝功結(jié)果Tab 2 Liver function result in each group after surgery

2.3 回腸組織病理學SH組和ID組回腸黏膜組織基本正常。膽道梗阻后，可見輕度炎細胞浸潤。ED組小鼠回腸黏膜炎癥情況與OJ組類似(見圖2)。

圖2 四組小鼠回腸腸組織HE染色結(jié)果Fig 2 Histopathology of the terminal ileum (HE staining) in 4 groups of mice

2.4 回腸黏膜TLR4和FXR受體表達

2.4.1 四組小鼠腸黏膜FXR及TLR4蛋白及mRNA的表達水平：Western blotting方法檢測腸黏膜FXR和TLR4蛋白的表達水平。小鼠膽道梗阻后，腸黏膜FXR表達較SH組明顯升高(P<0.001)；膽汁外引流術后，F(xiàn)XR表達較稍有下降(P=0.001)，仍高于SH組水平(P<0.001)；然而膽汁內(nèi)引流術后，F(xiàn)XR表達明顯下調(diào)(P<0.001)，但尚未降到SH組水平(P=0.002)，效果好于外引流(P<0.001)(見圖3)。小鼠膽道梗阻后，腸黏膜TLR4表達較SH組明顯降低(P<0.001)；膽汁外引流術后，表達稍有增強(P=0.018)，但仍低于SH組水平(P<0.001)；膽汁內(nèi)引流術后，TLR4表達明顯上調(diào)(P<0.001)，但尚未升到SH組水平(P=0.007)，效果好于外引流(P=0.006)(見圖4)。

圖3 四組腸黏膜組織FXR蛋白表達比較Fig 3 Comparison of FXR protein expression in ileal mucosa in the 4 groups

圖4 四組腸黏膜組織TLR4蛋白表達比較Fig 4 Comparison of TLR4 protein expression in the ileal mucosa in the 4 groups

qRT-PCR法檢測四組小鼠腸黏膜FXR和TLR4 mRNA的表達水平。小鼠膽道梗阻后，腸黏膜FXR mRNA水平較SH組明顯升高(P<0.001)；膽汁外引流術后，F(xiàn)XR mRNA水平稍有上升(P=0.519)，仍高于SH組水平(P<0.001)；然而，膽汁內(nèi)引流術后，F(xiàn)XR mRNA水平明顯下調(diào)(P=0.066)，但尚未降到SH組水平(P=0.008)，效果好于外引流(P=0.023)(見圖5)。小鼠膽道梗阻后，腸黏膜TLR4 mRNA較SH組明顯降低(P<0.001)；膽汁外引流后，表達稍有增強(P=0.021)，仍低于SH組水平(P<0.001)；膽汁內(nèi)引流術后，TLR4 mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.001)，但尚未升到SH組水平(P=0.002)，效果好于外引流(P<0.001)(見圖6)。

圖5 四組腸黏膜FXR mRNA表達比較; 圖6 四組腸黏膜TLR4 mRNA表達比較Fig 5 Comparison of FXR mRNA expression in the ileal mucosa in the 4 groups; Fig 6 Comparison of TLR4 mRNA expression in the ileal mucosa in the 4 groups

2.4.2 CMC-Na和GW4064處理小鼠后腸黏膜TLR4蛋白及mRNA表達結(jié)果：Western blotting方法檢測腸黏膜TLR4蛋白的表達水平。對照組：小鼠膽道梗阻后，腸黏膜TLR4表達較SH組顯著降低(P<0.001)；膽汁外引流術后，表達稍有提高(P=0.083)，仍低于SH組水平(P<0.001)；膽汁內(nèi)引流術后，TLR4表達明顯升高(P=0.002)，但尚未升到SH組水平(P=0.014)，效果好于外引流(P=0.027)(見圖7)。激動劑組：OJ組、ED組、ID組、SH組腸黏膜TLR4表達四組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖8)。激動劑組中OJ組的TLR4蛋白表達與對照組中OJ組的比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.736)，而激動劑組中SH組的TLR4蛋白表達與對照組中SH組的比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.042)(見圖9)。

圖7 對照組中四組腸黏膜組織TLR4蛋白表達比較Fig 7 Comparison of TLR4 protein expression in the ileal mucosa in the 4 groups of the vehicle group

圖8 激動劑組中四組腸黏膜組織TLR4蛋白表達比較Fig 8 Comparison of TLR4 protein expression in the ileal mucosa in the 4 groups of the GW4064 group

圖9 分別比較OJ組和SH組中對照組和激動劑組的腸黏膜TLR4蛋白水平Fig 9 Comparison of TLR4 protein expression levels in the ileal mucosa in the vehicle and GW4064 groups of the OJ and SH groups

qRT-PCR檢測腸黏膜TLR4 mRNA的表達水平。對照組：小鼠膽道梗阻后，腸黏膜TLR4 mRNA表達較SH組明顯降低(P=0.034)；膽汁外引流術后，TLR4 mRNA表達水平稍有上升(P=0.822)，仍低于SH組水平(P=0.049)；膽汁內(nèi)引流后，TLR4 mRNA表達明顯上調(diào)(P=0.127)，但尚未升到SH組水平(P=0.480)(見圖10)。激動劑組：OJ組、ED組、ID組、SH組腸黏膜TLR4 mRNA表達在四組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖11)。激動劑組中OJ組的TLR4 mRNA表達與對照組中OJ組的比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.736)，而激動劑組中SH組的TLR4 mRNA表達與對照組中SH組的比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.043)(見圖12)。

3 討論

由于小鼠具有膽囊，與人類的生理結(jié)構(gòu)和功能相對更接近，并且小鼠敲基因的技術相對于大鼠更成熟，因此，使用小鼠可以為后續(xù)進一步研究奠定基礎。目前利用小鼠梗黃模型來進行實驗研究的報道少見，而我們成功地建立了小鼠梗黃及膽汁內(nèi)外引流的模型。這個模型和我們課題組之前建立的大鼠梗黃模型[7]是一脈相承的，部分細節(jié)因小鼠體型小而進行了相應的改良，優(yōu)點包括二次引流術時粘連較輕、術中出血量少、術后引流管不易堵塞和可以長期存活以供研究。這個模型的成功建立可以通過膽汁內(nèi)外引流術后肝功能的全面恢復和腸道炎癥緩解證明。我們主要研究了膽汁內(nèi)外引流術對OJ小鼠腸道中FXR與TLR4表達的影響，并通過FXR激動劑灌胃治療探討FXR和TLR4之間可能的調(diào)控機制。

因FXR可識別和結(jié)合生理水平的膽汁酸，F(xiàn)XR也因此被稱為膽汁酸受體。FXR在肝臟、腎臟、腎上腺和小腸組織中高表達[8]，在回腸中FXR mRNA含量最高[9]。FXR調(diào)節(jié)體內(nèi)膽汁酸的水平，同時參與機體內(nèi)脂代謝和糖代謝，并起著重要的調(diào)節(jié)作用[9-10]。FXR也可以保護腸黏膜，OJ時，F(xiàn)XR可通過反饋性調(diào)節(jié)膽汁酸代謝來發(fā)揮保護肝細胞并抑制腸道細菌增殖、移位等重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠膽道梗阻后，OJ組小鼠較SH組小鼠FXR水平明顯升高，可能原因是膽道梗阻后，膽汁酸的腸肝循環(huán)被中斷，膽汁酸無法流入腸道，所以膽汁酸配體FXR表達水平反饋性升高，以促進膽汁酸代謝，從而保護腸黏膜。梗黃小鼠進行外引流術后，膽汁引流到體外，膽汁同樣無法流入腸道，F(xiàn)XR受體表達也反饋性地略升高；梗黃小鼠進行內(nèi)引流術后，膽汁酸從膽腸吻合口重新流入腸道，F(xiàn)XR受體也稍升高，但是更和SH組接近。FXR蛋白表達水平和mRNA水平在OJ組、ED組、ID組、SH組大體上逐漸遞減。

機體固有免疫細胞可通過病原PRRs直接識別微生物的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)并與之結(jié)合，進而被激活并啟動機體免疫防御反應。PRRs包括TLRs和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體家族(nucleotide binding oligomerzation domains，NODs)。TLR4可通過啟動天然免疫調(diào)節(jié)獲得性免疫，在一系列免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用，所以在研究中我們檢測TLR4表達水平。在人體內(nèi)TLR4主要表達于天然免疫細胞(如巨噬細胞、樹突細胞)和非免疫細胞(如腸上皮細胞、成纖維細胞、腎臟系膜細胞)上[11]。TLR4可以識別多種內(nèi)源性和外源性配體，外源性配體主要涉及內(nèi)毒素，包括革蘭氏陰性細菌細胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)[12]。TLR4是天然免疫系統(tǒng)中的Ⅰ型跨膜受體[13]，可非特異性地與PAMPs結(jié)合，啟動信號轉(zhuǎn)導，最終導致核因子NF-κB激活，引發(fā)多種炎癥介質(zhì)表達，因而TLR4可通過啟動天然免疫調(diào)節(jié)獲得性免疫，在一系列免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠膽道梗阻后，TLR4表達水平均較SH組明顯下降，并且表達水平在OJ組、ED組、ID組和SH組中逐漸升高，四組之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義。本研究發(fā)現(xiàn)，梗黃后腸黏膜TLR4表達水平下降，考慮可能原因是，梗黃初期手術后LPS刺激TLR4反應性升高[14]，隨著梗黃時間延長，腸源性細菌移位造成“腸源性膿毒癥”進而引起內(nèi)毒素耐受，最終導致TLR4水平下降。所謂內(nèi)毒素耐受即在體外或體內(nèi)，第一次受LPS刺激后，如果不久再次受到LPS沖擊，機體免疫應答會明顯減弱[15]。

Gadaleta等[5]分別從細胞、組織和動物水平分別給予炎癥刺激(TNF-α/IL-1β)和NF-κB的亞單位p50或p65處理，均發(fā)現(xiàn)腸道FXR活性降低，下游基因表達下降。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR也可以抑制炎癥[16-18]，二者相互抑制，進而可能導致惡性循環(huán)，降低的FXR活性對炎癥抑制作用減弱，進而形成慢性腸道炎癥。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠梗黃后回腸末段黏膜FXR表達水平反饋性升高，但既往文獻[19]表明，梗黃后FXR活性降低，其靶基因IBABP和FGF15/19等表達明顯降低，進而對腸道炎癥抑制作用減弱，腸道促炎癥因子活化的NF-κB信號通路可能會增強，但由于上述多種原因可能造成腸黏膜固有免疫功能受到抑制，進而TLR4介導的LPS活化NF-κB信號通路中的TLR4表達受到抑制，TLR4表達水平下降。我們的推測在文章另一部分通過分別用FXR激動劑和安慰劑處理四組小鼠后回腸黏膜TLR4表達的情況得到了證明。

四組小鼠給予CMC-Na灌胃后TLR4表達水平趨勢和上述無任何處理的小鼠基本保持一致。小鼠給予GW4064灌胃后，四組之間TLR4表達差異消失，可能原因是四組小鼠腸道細菌的生長受到抑制，腸黏膜免疫屏障功能均得到了不同程度的恢復。Gadaleta等[18]證實結(jié)腸炎小鼠接受FXR的激動劑INT-747后，腸道炎癥反應減輕，結(jié)腸黏膜炎癥因子釋放降低，阻止了腸道通透性的增加。Inagaki等[3]研究發(fā)現(xiàn)也和我們基本一致。SH組小鼠分別給予GW4064和CMC-Na處理后，兩組之間TLR4表達水平差異有統(tǒng)計學意義，GW4064組低于CMC-Na組?？赡茉驗槟c道本身就不是無菌環(huán)境，TLR4維持在適度水平，給予GW4064處理后，致病菌、腸道炎癥進一步得到抑制，進而TLR4水平較對照組下降。OJ組小鼠分別給予GW4064和CMC-Na處理后，兩組之間TLR4表達水平差異無統(tǒng)計學意義，對照組可能原因是梗黃持續(xù)時間長機體固有免疫水平低下，而激動劑組可能因為腸道炎癥受到明顯抑制而降低。

以上關于FXR與TLR4相互調(diào)節(jié)的機制的推測有待我們進一步在細胞和組織水平驗證，需要進一步利用基因敲除小鼠和野生小鼠來對比觀察，并且觀察在不同時間點FXR、TLR4及其下游基因表達的變化，以進一步明確FXR和TLR4二者之間具體的免疫調(diào)控網(wǎng)絡。

本實驗發(fā)現(xiàn)膽汁內(nèi)引流效果好于外引流。主要不同在于膽汁內(nèi)引流術可以使腸道膽汁復現(xiàn)，膽汁酸可以促進腸上皮細胞增生，恢復緊密連接結(jié)構(gòu)正?；?，進而恢復腸道屏障功能。膽汁酸還抑制有害細菌生長，降低內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，腸道固有免疫功能也適當恢復，進而TLR4表達基本恢復至對照組水平。內(nèi)引流術后使腸道恢復膽汁，而外引流術后膽汁大量丟失，膽汁上述保護機制均缺失，甚至引起水電解質(zhì)紊亂和酸堿失衡。另外，膽汁內(nèi)引流術優(yōu)于膽汁外引流術也表現(xiàn)在小鼠體質(zhì)量術前、術后的差值上，外引流術后小鼠體質(zhì)量明顯降低，與其他三組比較，差異均有統(tǒng)計學意義。其主要原因是上述機制，其他原因為外引流術創(chuàng)傷確實較大。我們從小鼠回腸末段HE染色結(jié)果也可以看出內(nèi)引流術優(yōu)于外引流術，表現(xiàn)為內(nèi)引流組腸道炎癥較外引流組略輕。

多項研究[2,20]發(fā)現(xiàn)，膽汁內(nèi)引流術優(yōu)于膽汁外引流術，我們與這些研究主要的不同在于我們證明膽汁酸通過調(diào)節(jié)FXR和TLR4在腸上皮細胞的表達來改善腸道功能。

小鼠梗黃形成后，腸道FXR升高，TLR4下降，膽汁內(nèi)引流和外引流均可逆轉(zhuǎn)這些改變，但內(nèi)引流效果優(yōu)于外引流。FXR激動劑通過活化FXR間接調(diào)控TLR4，從而保護腸黏膜。腸道內(nèi)膽汁酸是解釋這些現(xiàn)象的關鍵。

總之，膽汁內(nèi)引流術效果優(yōu)于外引流術的機制部分可能與腸黏膜組織FXR、TLR4受體的表達調(diào)控有關，具體機制仍待進一步深入研究。