阿托伐他汀通過(guò)NFATc1信號(hào)通路促進(jìn)大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合

王琮仁 孔長(zhǎng)庚 郭祥 金旭紅 吳多慶 范忠誠(chéng)

骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fractures,OPF)是臨床常見(jiàn)的骨科疾病，也是骨質(zhì)疏松癥終末階段，多見(jiàn)于絕經(jīng)后婦女及70歲以上老年人，發(fā)病率、致殘率均較高[1]。阿托伐他汀可抑制膽固醇合成，降低血液中脂蛋白膽固醇水平，常用于治療高膽固醇血癥及冠心病[2]。有研究認(rèn)為，阿托伐他汀可增加骨量并改善骨代謝指標(biāo)，促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥病人成骨[3]。本研究建立大鼠OPF模型，觀察阿托伐他汀對(duì)其治療作用，并探討可能機(jī)制。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

3月齡SPF級(jí)SD大鼠，雌性45只，體質(zhì)量(330±30)g，上海南方模式生物科技股份有限公司。許可證號(hào)SCXK(滬)2017-0010。

二、方法

1.藥物與試劑、儀器：阿托伐他汀鈣片，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051409，輝瑞制藥有限公司；兔抗大鼠活化T細(xì)胞核因子1(nuclear factor of activated T cells 1，NFATc1)、破骨細(xì)胞關(guān)聯(lián)受體(osteoclast associated receptor，OSCAR)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、I型膠原(I collagen，COL-I)一抗，美國(guó)R&D公司。EXA3000雙能X線骨密度儀，北京海富達(dá)科技有限公司；DM750顯微鏡，德國(guó)Leica公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)建立大鼠OPF模型[4]：40只大鼠背側(cè)入路于脊椎旁1 cm縱向切口，暴露卵巢后切除，術(shù)后注射青霉素；另取5只做假手術(shù)，僅暴露卵巢不切除，其余操作同建模大鼠。術(shù)后1周檢測(cè)建模大鼠骨密度，經(jīng)雙能X線骨密度儀分析脛骨干骺端骨密度，與假手術(shù)大鼠比較，明確模型制備成功。術(shù)后4周麻醉大鼠，左側(cè)股骨外側(cè)切取縱向切口，暴露股骨后線鋸鋸斷，克氏針沿髓腔固定斷肢，閉合傷口。(2)分組及給藥[5]：40只OPF模型大鼠隨機(jī)分為模型組，實(shí)驗(yàn)A、B、C組，各10只。術(shù)后次日，實(shí)驗(yàn)A、B、C組灌喂阿托伐他汀生理鹽水溶液5 ml(分別含阿托伐他汀10、20、40 mg/kg)，模型組灌喂等體積生理鹽水。每日1次，干預(yù)6周。(3)X光片觀察大鼠骨折愈合情況[6]：末次干預(yù)完成后次日，麻醉大鼠，經(jīng)X光掃描左側(cè)骨折股骨(50 kV、2.5 ms)，觀察骨折愈合情況。由2名以上經(jīng)過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的研究員進(jìn)行獨(dú)立雙盲評(píng)分。(4)生物力學(xué)測(cè)試檢測(cè)骨痂生物力學(xué)性能[7]：X光片拍照結(jié)束后處死大鼠，取左側(cè)股骨固定于兩端，以骨痂處為加載點(diǎn)，前端、后端跨距分別設(shè)置為8、20 mm，行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，記錄最大載荷、剛度。(5)HE染色觀察骨痂組織病理學(xué)變化[8]：生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，以骨折處為中心上下取8 mm×8 mm骨痂組織，分成兩份，一份置于-80 ℃冷凍，一份投入4%多聚甲醛中固定24小時(shí)，切片，HE染色，光鏡下觀察骨痂組織病理變化。(6)免疫印跡法檢測(cè)骨痂組織NFATc1、OSCAR、OCN、COL-I蛋白表達(dá)量[9]：取冷凍保存骨痂組織，裂解、離心后定量蛋白，取少量樣本與上樣緩沖液混合，變性、離心取上清，電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉2小時(shí)后與兔抗大鼠NFATc1、OSCAR、OCN、COL-I一抗(1∶500)混合，4 ℃冰箱過(guò)夜，洗膜后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育，2小時(shí)后洗膜、發(fā)光、顯影，成像儀分析蛋白條帶，以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1.X光片評(píng)分比較:與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組X光片評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且表現(xiàn)為劑量依賴性。見(jiàn)表1。

表1 各組X光片評(píng)分比較

2.生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果的比較:與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組最大載荷、剛度增加(P<0.05)，且表現(xiàn)為劑量依賴性。見(jiàn)表2。

表2 各組生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果比較

3.骨痂組織學(xué)觀察:HE染色結(jié)果顯示，模型組骨小梁方向性不明顯且較細(xì)，成骨不活躍；相較于模型組，實(shí)驗(yàn)A、B、C組骨小梁較粗，部分成熟，存在明顯礦化，骨性骨痂較多，部分可見(jiàn)軟骨性及纖維性骨痂形成，骨外膜下可見(jiàn)成骨細(xì)胞形成骨小梁，表現(xiàn)為劑量依賴性。

4.骨痂組織NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá)量的比較:與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組骨痂組織NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且表現(xiàn)為劑量依賴性。見(jiàn)表3，圖1。

表3 各組骨痂組織NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá)量比較

圖1 4組大鼠骨痂組織NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá)量

5.骨痂組織OCN、COL-I蛋白表達(dá)量的比較:與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組骨痂組織OCN、COL-I蛋白表達(dá)量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且表現(xiàn)為劑量依賴性。見(jiàn)表4，圖2。

表4 各組骨痂組織OCN、COL-I蛋白表達(dá)量比較

圖2 4組大鼠骨痂組織OCN、COL-I蛋白表達(dá)量

討論

OPF是指不受外力或在輕微外力下導(dǎo)致的脆性骨折，多為粉碎性，可造成嚴(yán)重功能損傷[10]。骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多認(rèn)為與內(nèi)分泌失調(diào)、必需元素?cái)z入不足、成骨-破骨細(xì)胞失衡及遺傳等因素相關(guān)，其中成骨-破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)失衡被認(rèn)為是重要機(jī)制之一[11]。骨折愈合是骨折處骨痂組織重建過(guò)程，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞分別調(diào)節(jié)骨形成與骨吸收過(guò)程，二者平衡促成骨骼更新，但骨質(zhì)疏松病人破骨細(xì)胞增多而成骨細(xì)胞分化較少，骨折處骨形成受阻，愈合困難。

本研究結(jié)果顯示，OPF大鼠模型經(jīng)阿托伐他汀干預(yù)后X光片評(píng)分升高，最大載荷、剛度增加，且表現(xiàn)為劑量依賴性，提示阿托伐他汀可促進(jìn)骨折愈合，提升骨骼生物力學(xué)性能。阿托伐他汀是膽固醇合成限速酶，可抑制骨吸收相關(guān)酶活性，抑制破骨細(xì)胞生成分化，提升骨形成蛋白表達(dá)并提高其活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及骨骼礦化，從而促進(jìn)骨形成。Zhou等[12]研究認(rèn)為，阿托伐他汀可抑制破骨細(xì)胞形成、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而增加去卵巢兔模型骨骼機(jī)械參數(shù)，如最大載荷、剛度及能量吸收力，改善骨骼微結(jié)構(gòu)，提示阿托伐他汀具有抗骨質(zhì)疏松活性。

OSCAR是破骨細(xì)胞形成與分化過(guò)程中關(guān)鍵蛋白因子，作為免疫球蛋白受體，可相關(guān)銜接蛋白結(jié)合，使磷脂酶Cγ活化從而激活鈣離子信號(hào)分子，促進(jìn)NFATc1表達(dá)。NFATc1是破骨細(xì)胞形成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄蛋白，可調(diào)控抗酒石酸磷酸酶、降鈣素受體、蛋白酶K等破骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)，其同時(shí)可與OSCAR啟動(dòng)區(qū)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)OSCAR表達(dá)，形成正反饋效應(yīng)，與相關(guān)因子共同作用，促進(jìn)骨吸收。Kwak等[13]發(fā)現(xiàn)，抑制OSCAR、NFATc1蛋白表達(dá)可抑制體外小鼠破骨細(xì)胞分化，抑制其功能，治療骨吸收過(guò)度導(dǎo)致的炎癥性骨病。COL-I是組成細(xì)胞外基質(zhì)的主要有機(jī)成分，同時(shí)在成骨分化過(guò)程中促進(jìn)成骨相關(guān)基因OCN的表達(dá)，OCN是由成熟骨細(xì)胞分泌的非膠原蛋白，通常聚集在骨礦化峰期后，其與COL-I被認(rèn)為是骨形成中的重要生物學(xué)標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，OPF大鼠模型經(jīng)阿托伐他汀干預(yù)后NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá)量降低，OCN、COL-I蛋白表達(dá)量升高，且表現(xiàn)為劑量依賴性，提示阿托伐他汀對(duì)OPF促進(jìn)愈合的作用可能是通過(guò)抑制NFATc1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。