栽培金雞菊EST-SSR分子標記開發(fā)與親緣關系分析

孫浩男， 李 蓉， 李明陽， 鄭 妍， 劉志杰， 張存石， 劉冬云，李 鶴

(河北農業(yè)大學園林與旅游學院， 河北 保定 071000)

金雞菊是菊科(Compositae)金雞菊屬(Coreopsis)植物的統(tǒng)稱，全屬約80多種，主要原產(chǎn)于北美洲和南美洲，我國在上個世紀就有引種部分金雞菊的記錄，中國植物志共記錄7種[1-2]。金雞菊種類繁多，適應性強，觀賞價值高，多用于盆栽、花園及道路景觀等，是出色的花卉資源。在我國，兩色金雞菊(C.tinctoria)也被稱作‘雪菊’，其干燥的頭狀花序也可泡茶飲用，具有一定的藥用價值和經(jīng)濟價值[3-4]，在我國栽培范圍較廣。目前，國內外學者對金雞菊野生資源的研究集中在系統(tǒng)發(fā)育、分類和資源調查上；對于栽培資源，主要集中在栽培繁殖、抗逆性、藥理和花期調控方面的研究[5-10]；栽培金雞菊品種繁多，育種背景復雜，其中涉及大量的種間雜交，此外，市場上的部分資源更是來歷不明，存在同物異名的現(xiàn)象，極大影響了栽培金雞菊的應用和推廣，急需對其開展分類鑒定和遺傳多樣性研究。

前人常用形態(tài)標記、細胞學標記和同工酶標記等手段對金雞菊屬進行遺傳多樣性研究。Jansen等人[11]發(fā)現(xiàn)，金雞菊屬在形態(tài)上具有豐富的遺傳多樣性，利用種子、葉子及花部等32個性狀可對11組的種進行一定劃分；2019年，國際植物新品種保護聯(lián)盟公布了44個描述金雞菊新品種的重要指標，而葉子和花部是其主要變異部位，也是栽培金雞菊主要的觀賞性狀[12]；Smith[13]經(jīng)過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，野生金雞菊的染色體基數(shù)包括x=6，7，8，9，10，12，13，14等多種類型，倍性主要為二倍體和四倍體；而孫浩男等[14]發(fā)現(xiàn)，栽培金雞菊的染色體數(shù)目為20～60不等，十分多變，籽播系的栽培金雞菊主要為二倍體，而無性系的的栽培金雞菊中含有大量的異源多倍體和非整倍體。1995年，Mesfin等[15]首次報導了原產(chǎn)于北美的金雞菊的花粉形態(tài)，其在花粉粒大小和脊柱長等方面具有豐富的遺傳多樣性。此外，同工酶標記也有說明了金雞菊屬具有豐富的遺傳多樣性[16-17]。

目前，用于研究金雞菊屬植物研究的分子標記較少。Czarnecki[18]利用AFLP標記對美國佛羅里達州的11個萊氏金雞菊(C.leavenworthii)野生居群進行研究，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性主要集中在居群間。梁玉[19]通過RAPD標記分析得出，入侵我國山東地區(qū)的大花金雞菊(C.grandiflora)在居群內表現(xiàn)的遺傳多樣性要大于居群間。Smith[20]篩選了10對SSR引物用于評估萊氏金雞菊在人工生產(chǎn)種子階段發(fā)生的遺傳漂變和遺傳流失，認為分子標記相比形態(tài)標記能夠更早地揭示其遺傳分化。樊叢照等[21]利用ISSR標記研究我國栽培的兩色金雞菊種質，發(fā)現(xiàn)其明顯存在地域性的遺傳分化。長期以來，也有眾多分類學家利用EST、ITS、rpl16、matK等序列用于金雞菊物種的分類和鑒定[22-23]。但這些試驗的研究對象主要為原產(chǎn)于北美的野生種和我國部分歸化的栽培種，較少涉及其它具有復雜遺傳背景的栽培金雞菊。

簡單重復序列標記(Simple Sequence Repeat)簡稱SSR，是基因組中由1～6個核苷酸組成的基本單位重復多次構成的一段DNA，SSR具有易于操作、重復性好、共顯性的特點，適用于植物鑒定與遺傳多樣性的研究，其可分為g-SSR和EST-SSR兩類，而后者開發(fā)成本低，周期短，在同屬植物中具有較好的通用性[24]。目前，我國栽培最為廣泛的金雞菊種質為劍葉金雞菊(C.lanceolata)、大花金雞菊和兩色金雞菊等相關種質。劍葉金雞菊‘斯丹泰勒’是劍葉金雞菊和大花金雞菊的種間雜交品種，具有花朵碩大、花色奇特且株型緊湊等優(yōu)點。本研究以劍葉金雞菊‘斯丹泰勒’的葉片進行轉錄組測序，分析其SSR位點分布頻率和特點，以此開發(fā)新的EST-SSR引物，并對課題組收集自國內外的100個金雞菊種質進行遺傳多樣性和親緣關系分析，旨在為栽培金雞菊從分子角度上進行分類劃分，同時為金雞菊種質的鑒定、雜交育種及指紋圖譜的構建等方面提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 轉錄組數(shù)據(jù)來源

轉錄組測序樣本采自劍葉金雞菊品種‘斯丹泰勒’，采樣時選取10片真葉期幼苗的所有葉片，設置3個重復，將葉片擦拭潔凈后交至北京諾禾致源科技公司進行Illumina 2代高通量無參轉錄組測序，通過Trinity拼接得到共42 958條Unigene。

1.2 轉錄組EST-SSR位點鑒別及SSR引物設計

采用MISA(1.0版，默認參數(shù))進行EST-SSR位點檢測；利用Primer 3(2.3.5版，默認參數(shù))進行引物設計；使用DNAMAN 8對正、反向引物進行檢測篩選，避免出現(xiàn)DNA頸環(huán)、引物二聚體等，最后從中隨機挑選50對SSR引物，分別利用6個親緣關系較遠的材料(金鬃-中國、‘雪菊’、大花-美國、玫紅-德國、三葉金雞菊和沙漠金雞菊)進行退火梯度試驗和多態(tài)性驗證試驗，篩選出合適的引物。引物由Thermo Fisher公司合成。

1.3 試驗材料及種植條件

植物材料為課題組收集的金雞菊種質資源共100個(表1)，包括國內外廣為栽培的原生種和栽培品種等97個，課題組自選育3個。

表1 供試的100個金雞菊種質的信息Table 1 Information of 100 tested Coreopsis germplasms

續(xù)表1

續(xù)表1

2019年4月下旬在日光溫室內對材料進行播種和扦插。籽播系材料使用128穴盤播種，基質為進口草炭、珍珠巖、蛭石比例8∶1∶1。無性系材料使用50深穴盤扦插，扦條選用枝條頂部2節(jié)嫩芽，插入基質為進口草炭、珍珠巖4∶1。6月上旬挑選根系飽滿的穴盤苗移栽于2加侖規(guī)格的花盆中，基質為國產(chǎn)草炭、椰糠、珍珠巖比例5∶1∶1，每種材料30株。9月上旬播種一年生材料，10月中旬上盆，方法同上。所有上盆材料每隔3個月施用1次奧綠1號緩釋肥，每次12 g。所有植物統(tǒng)一使用滴灌澆水，花后及時修剪保證復花，冷棚內過冬，統(tǒng)一修剪枯枝，2020年4月下旬統(tǒng)一移出室外。

1.4 DNA提取、PCR擴增與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2020年8月初統(tǒng)一采集植株葉片，植物基因組DNA試劑盒購買自康為世紀公司，具體步驟按說明書進行。使用Nano Drop 2000微量分光光度計檢測提取的金雞菊DNA濃度，并用1.5%瓊脂糖凝膠(1×TAE緩沖液，120 V，0.5 h)對DNA母液上樣檢測，最后使用滅菌去離子水將各材料的DNA母液稀釋至30 ng·μL-1備用。

使用20 μL PCR擴增反應體系：2×Es Taq Master Mix(康為世紀生物科技有限公司)10 μL；正、反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板2 μL，dd H2O 6 μL。

PCR反應程序：94oC預變性4 min；94℃變性30 s，退火(最適退火溫度下)30 s，72℃延伸30 s，32個循環(huán)，5 min終延伸，12℃保存。擴增產(chǎn)物使用8%非變形聚丙烯酰胺凝膠進行檢測，220 V電壓下電泳2.5 h，銀染后顯色、定影并進行拍照。

電泳圖上清晰條帶記為“1”，同位置無條帶或不易分辨的弱帶記為“0”，以此建立原始數(shù)據(jù)矩陣。計算各引物的擴增總帶數(shù)(Total amplified bands，TB)、多態(tài)性帶數(shù)(Number of polymorphic bands，PB)和多態(tài)性條帶百分比(Percentage of polymorphic bands，PPB)。使用NTsys 2.10e軟件，繪制UPMGA聚類圖。利用Popgene 32軟件計算各材料間的遺傳相似系數(shù)(Genetic similarity，GS)和遺傳距離(Genetic distance，GD)。

2 結果與分析

2.1 轉錄組中SSR位點的數(shù)量與分布

根據(jù)測序結果，對41 634 448 bp的轉錄組數(shù)據(jù)進行SSR檢測(表2和表3)，從5 470條序列中(占總數(shù)12.73%)共搜索出SSR位點6 546個，其中850條序列含有至少一條SSR位點，占總數(shù)的1.98%，431條序列具有復合型SSR位點，占總數(shù)的1.00%，平均6.36 kb基因具有一個SSR位點。

表2 劍葉金雞菊‘斯丹泰勒’轉錄組中檢測到的EST-SSR的基本信息統(tǒng)計Table 2 The statistic of EST-SSR in transcriptome of Coreopsis lanceolata ‘Sterntaler’

2.2 轉錄組SSR基序重復類型和頻率特征

SSR位點類型較為豐富(表3)，共包含117個種類，其中單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸數(shù)量較多，占比分別為46.80%，19.28%和30.13%，四核苷酸和六核苷酸占比極少，分別為1.80%和1.15%，五核苷酸占比最少，僅占0.77%。六核苷酸的重復類型最多，有53種，其次為五核苷酸和四核苷酸，分別為27種和21種。除單核苷酸外，二核苷酸的重復次數(shù)以6次和7次為主，三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸的重復次數(shù)以5次和6次為主，而六核苷酸內，重復次數(shù)為5的種類遠大于其它種類。

表3 劍葉金雞菊‘斯丹泰勒’轉錄組中EST-SSR位點類型、數(shù)量及分布頻率Table 3 Type,number and frequency of EST-SSR in transcriptome of Coreopsis lanceolata ‘Sterntaler’

在檢測的重復單元類型上(表4)，二核苷酸中占比最多的是AG/CT(57.30%)，最少的是CG/CG(0.48%)；三核苷酸中占比較多的是AAT/ATT(27.94%)、ACC/GGT(21.75 %)，ATG/ATG(18.26%)，AAG/CTT(12.22%)；四核苷酸中占比最多的是AAAG/CTTT(16.10%)，其次為AAAT/ATTT(13.56%)，ACAT/ATGT(12.71%)；五核苷酸和六核苷酸中占比最多的分別為AAAAC/GTTTT(16.07%)和ACCGCC/CGGTGG(5.33%)。重復次數(shù)介于5～70次，以5～10次為主，占總數(shù)的67.93%。

表4 劍葉金雞菊‘斯丹泰勒’轉錄組中EST-SSR基序的分布Table 4 Distribution of EST-SSR motif in transcriptome of Coreopsis lanceolata ‘Sterntaler’

2.3 EST-SSR引物設計與篩選

去除掉復合型SSR位點，在6 115條包含SSR的序列中設計得到4 499條對EST-SSR引物，從中隨機挑選50對引物進行擴增，其中22對引物的擴增效果較好。根據(jù)表5，22對引物的重復基元由二核苷酸至六核苷酸不等，退火溫度在56～64℃，最低的是Core04和Core12，最高的是Core08和Core16。22對引物共擴增出清晰的條帶166條，全部為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶數(shù)百分比為100%，每條引物的擴增條帶3～14個，平均擴增條帶7.55個，其中Core04和Core24最多(圖1)，而Core16的最少。

圖1 EST-SSR引物Core04和Core24部分PCR擴增電泳圖譜Fig.1 Partial PCR amplification electrophoresis of EST-SSR primers Core04 and Core24

表5 金雞菊EST-SSR引物的序列和擴增情況Table 5 Sequence of EST-SSR primers and their amplification of Coreopsis

2.4 親緣關系分析

根據(jù)22對EST-SSR引物的擴增結果，100個栽培金雞菊種質的遺傳相似系數(shù)介于0.542 2～1，平均為0.747 6。四個Lemonade系列的材料：‘熱帶檸檬汁’‘粉色檸檬汁’‘草莓檸檬汁’和‘櫻桃檸檬汁’彼此之間的遺傳相似系數(shù)均為1，‘日落夢想’和‘粉色夢想’也為1，而‘帝國陽光’和大花金雞菊之間具有最小的遺傳相似系數(shù)0.542 2。

遺傳距離介于0～0.947 0，平均為0.327 5。四個Lemonade系列材料之間的遺傳距離最小，而‘日落夢想’和‘粉色夢想’兩者之間也為0，親緣關系較近。有19組材料的遺傳距離為0.947 0，如大花金雞菊的兩個品種‘日出’與‘陽光’、大花金雞菊‘朝陽’與劍葉金雞菊‘斯丹泰勒’、同為Hardy Jewel系列的‘黃水晶’與‘紅寶石霜’、不同系列的‘菠蘿派’與‘日落夢想’、兩色-美國矮和‘不可思議矮’等。

2.5 聚類分析

根據(jù)UPGMA聚類結果(圖2)，在L1(D=0.460)處，100個金雞菊種質可劃分為七類，每一類大體由一定的原生種和相關種質組成，并與金雞菊屬下的分組有關：第Ⅰ類由大花金雞菊、劍葉金雞菊等金雞菊組下的原生種和以該組為主要親本的各品種組成；第Ⅱ類主要包括兩色組的兩色金雞菊、萊氏金雞菊及歧序組的玫紅金雞菊等原生種、品種和以它們?yōu)橹饕H本的品種；第Ⅲ類的包含11個金雞菊種質，主要包括輪葉金雞菊及其相關品種等；第Ⅴ類僅含有兩個原生種：大葉金雞菊和掌葉金雞菊，兩者和輪葉金雞菊同屬輪葉組；而三葉金雞菊(輪葉組)、皇冠金雞菊(金雞菊組)及沙漠金雞菊(異果組)則分別獨成一組。在L2(D=0.610)處，可進一步劃分為18個小組，幾乎能將所有原生種區(qū)別開。

圖2 供試的100個金雞菊種質資源的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA clustering map of 100 tested Coreopsis

3 討論

EST-SSR所在的基因轉錄區(qū)相對保守，在同屬內的植物中具有較好的通用性，雖然也可移植已發(fā)表的SSR引物用于同科不同屬，或同屬不同族植物，但引物的通用性一般較差，而且耗時耗力[25-26]。本試驗也測試了Smith根據(jù)萊氏金雞菊開發(fā)的10對SSR引物[22]，但通用性和多態(tài)性較不理想。根據(jù)本次轉錄組的數(shù)據(jù)分析，劍葉金雞菊‘斯丹泰勒’的SSR位點類型豐富，以三核苷酸重復類型為主，不同于亞洲蓮[24]的二核苷酸和紅豆杉[27]的六核苷酸，其占比最多的類型在同科植物上也存在很大不同[28-29]；平均6.36 kb包含一個SSR位點，高于萬壽菊(2.15 kb)[28]，與賽菊芋(6.79 kb)[29]較為接近。這些差異可能與物種和SSR位點搜索的標準不同有關，但也可能是采樣部位、發(fā)育時期等不同導致的。

栽培金雞菊大多源于遠緣雜交，具有復雜和豐富的遺傳背景[30]，孫浩男等[14]認為，栽培金雞菊的主要親本具有復雜的染色體基數(shù)和染色體倍性，由此導致栽培金雞菊中存在大量以二倍體、三倍體和四倍體為基礎的非整倍體和異源多倍體。電泳圖譜和條帶統(tǒng)計顯示，本次開發(fā)的22對引物均有較好的擴增效果，所擴增出的條帶全部具有多態(tài)性，有的引物在二倍體野生種和品種的同一位點上可擴增1～2個條帶，但在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ大類的多個遠緣雜交品種上可擴增出3～4個條帶，甚至更多，這與栽培金雞菊復雜的染色體倍性有關。個別EST-SSR引物不能在全部100個金雞菊種質上實現(xiàn)有效擴增，如異果組、輪葉組、兩色組、歧序組相關的材料，這可能是由于本次開發(fā)EST-SSR引物時所采用的轉錄組數(shù)據(jù)以金雞菊組的遺傳背景為主，引物的通用性存在一定局限。但對于同為金雞菊組的皇冠金雞菊來說，同樣存在擴增位點較少的問題，在聚類結果中未能劃到Ⅰ類，這可能與其異常的染色體數(shù)目和缺失相應的遺傳位點和有關。

楊占花等[31]認為，使用不同類型的SSR得到的聚類結果在大類群上區(qū)別不大，根據(jù)EST-SSR位點分析得到的UPMGA聚類圖可將100個栽培金雞菊種質分為7大類，前3類主要包括了絕大部分金雞菊組、兩色組、歧序組和輪葉組相關的種質，而大葉金雞菊、掌葉金雞菊、三葉金雞菊、皇冠金雞菊未能與同組的材料劃為一類，異果組的沙漠金雞菊更是獨為一類，這可能是由于它們與栽培金雞菊主要育種親本具有一定的遺傳距離，同時較少參與栽培金雞菊的育種。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前由世界各國育種家培育的金雞菊品種約200～300個，本次試驗收集的100個金雞菊種質是世界各國廣為栽培的種類，能夠覆蓋絕大部分栽培金雞菊類型，具有較好的代表性，從聚類結果看，栽培金雞菊主要由金雞菊組、兩色組、歧序組和輪葉組相關的種質培育而來，這與前人所報道的栽培金雞菊的主要親本較為一致[30]，不同組的金雞菊種質具有一定的遺傳距離，適合用于遠緣雜交。

對于一些親緣關系較近的種質，尤其是芽變產(chǎn)生的種類，多數(shù)分子標記難以做到區(qū)分，但也有一些學者開發(fā)出了合適的SSR、SRAP和S-SAP引物來區(qū)分桃[32]、柑橘[33]等植物的芽變品種。徐雷鋒等[34]認為，采用分子標記對種質進行鑒定和區(qū)分時，所用的標記并不一定連鎖重要的形態(tài)性狀。高源等[35]也認為，不能完全區(qū)分和鑒定種質、或區(qū)分和鑒定的結果不理想，與檢測的位點數(shù)不足有關。本次開發(fā)的22對引物仍有一定局限性，雖能較好地區(qū)分各個物種，并將大部分遠緣雜交品種進行歸類，但未能識別種下的各種質以及育種背景較為相近的雜交品種和相關的變異品種。Uri Dream系列是通過誘變培育的[36]，其中‘日落夢想’和‘粉色夢想’的遺傳相似系數(shù)為1，它們的舌狀花主花色都是粉色系，但前者具有橙色系的次花色，后者無次花色，而‘白色夢想’與兩者的遺傳相似系數(shù)為0.994 0，SSR位點可能發(fā)生了變異，它的舌狀花主花色是白色系，次花色為粉色系。Lemonade系列的四個材料彼此之間的遺傳相似系數(shù)也為1，它們的形態(tài)極為相似，但在舌狀花主花色方面差別較大，可明顯區(qū)分為為橙色系、粉色系、紅色系和紫色系。綜合來看，在實際應用中應將分子標記與形態(tài)標記充分結合才能對栽培金雞菊進行更加準確地描述和區(qū)分。

圖3 Lemonade系列和Uri Dream系列的頭狀花形態(tài)Fig.3 Flower heads of Lemonade series and Uri Dream series

4 結論

本研究基于劍葉金雞菊‘斯丹泰勒’的轉錄組數(shù)據(jù)，搜索出SSR位點6 546個，并以此為基礎成功開發(fā)出了22對EST-SSR引物，擴增出的166個條帶全部為多態(tài)性條帶。通過聚類分析，在遺傳距離為0.460時可將100個栽培金雞菊種質劃分為7類，能在一定程度上反映栽培金雞菊的育種背景，其遺傳相似系數(shù)介于0.542 2～1，平均為0.747 6。金雞菊組、兩色組、歧序組和輪葉組相關的種質可作為金雞菊遠緣雜交育種的材料。本研究為栽培金雞菊的鑒定、雜交育種及指紋圖譜的構建等方面提供了一定分子方面的參考。