黃曉燕，李榮瑋，劉雁鳴，梁晟，李瑞蓮

湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，湖南省藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)工程技術(shù)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410001

婦科止帶膠囊具有收斂止帶、清熱燥濕等功效，臨床上常用于治療濕熱型赤白帶等癥［1］。本品為中藥復(fù)方制劑，由椿皮、龜甲、阿膠等7 味藥材組成，處方中龜甲制備方法為加水煎煮，故在提取過(guò)程中能生成龜甲膠成分。

目前，市場(chǎng)上驢皮、龜甲原料供應(yīng)緊缺，價(jià)格昂貴，某些不法生產(chǎn)企業(yè)為了謀取更高的經(jīng)濟(jì)效益，可能出現(xiàn)將馬皮充當(dāng)正品膠類(lèi)投料造假摻偽等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響著患者的用藥安全。為了保證膠類(lèi)藥材的質(zhì)量及打擊摻偽造假，藥品監(jiān)管部門(mén)陸續(xù)出臺(tái)一系列的檢驗(yàn)檢測(cè)方法［1-4］。婦科止帶膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2020 年版一部，正文項(xiàng)下收載有阿膠的特征肽鑒別。本品雖有阿膠的鑒別項(xiàng)目，但無(wú)檢測(cè)雜皮投料的項(xiàng)目，難以對(duì)馬皮造假和摻假的現(xiàn)象進(jìn)行檢查和監(jiān)管。因此，本研究根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)［5-9］報(bào)道中的測(cè)定方法，采用超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）識(shí)別技術(shù)，建立了馬皮源成分的限量檢查方法，并對(duì)收集到的婦科止帶膠囊樣品進(jìn)行測(cè)定，以便為含膠類(lèi)中成藥產(chǎn)品質(zhì)量控制和科學(xué)監(jiān)管提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AE240 電子分析天平（METTLER）；SBL-30DT超聲波清洗器（寧波新芝有限公司）；Ultimate3000-TSQ 液質(zhì)聯(lián)用儀（DIONEX）。

1.2 試藥

馬源寡肽A 對(duì)照品（批號(hào)：112035-202002，純度：90.5%）；阿膠對(duì)照藥材（批號(hào)：121274-201904）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。所用甲酸、乙腈為質(zhì)譜純，胰蛋白酶為質(zhì)譜級(jí)（Sigma 公司），水為蒸餾水，試驗(yàn)用的其他試劑均為分析純。8 批婦科止帶膠囊樣品均從市場(chǎng)上購(gòu)得（企業(yè)A，樣品批號(hào)：1803002、1906001，規(guī)格：每粒裝0.3 g；企業(yè)B，樣品批號(hào)：1905002、1901001、1811005、1807004、1805003，規(guī)格：每粒裝0.3 g；企業(yè)C，樣品批號(hào)：20200501，規(guī)格：每粒裝0.46 g）。陰性樣品按處方自行制備而得。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為35 ℃，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，5% A；5～10 min，5% →20% A；10～12 min，20%→50% A；流速為0.3 mL/min。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI+模式，離子源溫度110 ℃，毛細(xì)管電壓為3.1 kV，鞘氣流速600 L/h，去溶劑化溫度350 ℃，掃描模式為MRM。選擇m/z 386.4（雙電荷）→377.3（定量用）、m/z 386.4（雙電荷）→322.3 為檢測(cè)離子對(duì)，碰撞能量為25 V，檢測(cè)離子對(duì)的MRM 色譜峰的信噪比均不得小于10∶1。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

阿膠基質(zhì)溶液的制備：精密稱(chēng)取阿膠對(duì)照藥材粉末，用1%碳酸氫銨水溶液溶解制成每1 mL 含2 mg 的基質(zhì)溶液，即得。

精密稱(chēng)取馬源寡肽A 對(duì)照品10.05 mg，置于50 mL 容量瓶中，用阿膠基質(zhì)溶液溶解并稀釋至刻度，即得對(duì)照品貯備液。取馬源寡肽A 對(duì)照品貯備液，用阿膠基質(zhì)溶液稀釋制成0.2 μg/mL 的溶液，取適量該溶液，用微孔濾膜（孔徑0.22 μm）過(guò)濾，精密量取100 μL，加入制備好的胰蛋白酶溶液10 μL（1 μg/μL），混勻，水浴恒溫（37 ℃）酶切處理12 h，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取婦科止帶膠囊樣品20 粒內(nèi)容物，研勻，取約0.3 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL 容量瓶中，加1%碳酸氫銨水溶液約45 mL，置于超聲波清洗儀中提?。üβ?40 W，頻率40 kHz）30 min 使樣品溶解，用1%碳酸氫銨水溶液稀釋至刻度，搖勻，取適量上清液，用微孔濾膜（孔徑0.22 μm）過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液100 μL，加入胰蛋白酶溶液10 μL，同對(duì)照品制備方法進(jìn)行酶切處理，即得。

2.5 陰性樣品溶液制備

稱(chēng)取自行制備的缺阿膠、龜甲的陰性樣品約0.3 g，同供試品制備方法制成陰性樣品溶液。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下條件，吸取馬源寡肽A 對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液與婦科止帶膠囊供試品溶液各5 μL，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果婦科止帶膠囊中其他藥味對(duì)膠類(lèi)特征肽測(cè)定無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同溶液中馬源寡肽A特征離子色譜圖:A.馬源寡肽A對(duì)照溶液；B.陰性樣品溶液；C.樣品溶液

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取馬源寡肽A 對(duì)照品溶液，于配制后的0、4、12、24 h，分別按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下條件測(cè)定。結(jié)果馬源寡肽A 的峰面積值RSD 為5.2%。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 按“2.1”及“2.2”項(xiàng)下條件，吸取馬源寡肽A 對(duì)照品溶液，連續(xù)6 次測(cè)定。結(jié)果馬源寡肽A 定量離子對(duì)的峰面積值RSD 為4.9%，儀器精密度較好。

2.6.4 線性關(guān)系 吸取適量對(duì)照品貯備液，制成含0.036 38、0.072 76、0.181 9、0.363 8、0.727 6 μg/mL 的系列溶液，依法測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)為對(duì)照品的量，縱坐標(biāo)為定量離子對(duì)峰面積值，結(jié)果回歸方程：Y=1.0×106X+21 161，r=0.997 8，結(jié)果表明在0.036 38～0.727 6 μg/mL 范圍內(nèi)，馬源寡肽A 摻入量與色譜峰面積呈線性關(guān)系。

2.6.5 檢出限 取馬源寡肽A 對(duì)照品貯備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)择R源寡肽A 肽定量離子對(duì)色譜圖信噪比為3∶1 計(jì)算檢出限，檢出限為1.8 ng/mL。

2.6.6 回收率試驗(yàn) 取婦科止帶膠囊樣品（批號(hào)：1905002，未檢出馬源寡肽A）6 份，每份稱(chēng)取約0.3 g，分別加入0.363 8 μg/mL 的對(duì)照品溶液25 mL，再加1%碳酸氫銨水溶液約20 mL，同“2.4”項(xiàng)下方法制備溶液，采用馬源寡肽A 定量離子對(duì)依法測(cè)定，平均回收率為93.59%，RSD 為3.69%，結(jié)果表明回收率較好，方法可行。

表1 回收率試驗(yàn)

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果

取婦科止帶膠囊樣品，照“2.4”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”及“2.2”方法測(cè)定。結(jié)果3 家企業(yè)的8批樣品均未檢出馬源寡肽A。

3 討論

3.1 基質(zhì)效應(yīng)考察

為了考察樣品中的基質(zhì)對(duì)待測(cè)成分的影響，分別以相應(yīng)濃度的阿膠、陰性樣品溶液為基質(zhì)，配制參比溶液，并與以碳酸氫銨溶液為溶劑的參比溶液進(jìn)行比較，結(jié)果以阿膠基質(zhì)和以陰性樣品基質(zhì)所得的參比溶液響應(yīng)值接近，為了便于標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，選擇以阿膠基質(zhì)進(jìn)行參比溶液的制備。

3.2 限度的擬定

為了避免發(fā)生客觀原因驢皮中混入微量馬皮造成結(jié)果誤判的情況，規(guī)定馬皮源成分的檢出比例十分有必要。參考文獻(xiàn)中的相關(guān)限度規(guī)定［8-9］，將婦科止帶膠囊樣品馬皮源成分檢查的限度定為5%，即大于5%可判定為存在馬皮源摻偽，小于或等于5%可判定為不存在摻偽。由于0.2 μg/mL 的對(duì)照品約相當(dāng)于5%的馬皮源成分，故擬定馬皮源檢查的參比溶液的限度為0.2 μg/mL。

3.3 樣品質(zhì)量分析

對(duì)婦科止帶膠囊的檢測(cè)結(jié)果顯示，8 批均未檢出馬皮源成分，說(shuō)明該品種暫未存在馬皮摻偽投料的情況。本研究建立的方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)便，可以有效控制和監(jiān)管馬皮摻偽投料的不法行為，為含膠類(lèi)制劑的科學(xué)監(jiān)管和質(zhì)量控制提供保障。