司星宇，陳致，周千渝，陳卓，王紅球，*

(1 北京鑒知技術(shù)有限公司，北京 100084; 2 北京微量化學(xué)研究所，北京 100091)

1 引言

抗疲勞類保健品是可能含有違禁藥物的一類食品，每年涉及的食品安全刑事案件占比高，近五年涉及刑事案件2000余起，占到所有保健品相關(guān)案件的70%以上?？蛊陬惐＝∑分谐Ｒ妰煞N藥物的非法添加——西地那非和他達(dá)拉非。西地那非和他達(dá)拉非都屬于磷酸二酯酶5型抑制劑，分別是萬艾可(又稱偉哥，英文名Viagra?)和希愛力(英文名Cialis?)的主要活性藥物成分。其藥理作用是通過抑制cGMP 的代謝，促進(jìn)海綿體動(dòng)脈平滑肌舒張，進(jìn)而改善勃起功能障礙癥狀。目前這兩個(gè)藥物是國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市的治療男性性功能障礙的處方藥藥品，已知其主要副作用有面部潮紅、頭暈、頭痛、鼻塞和視覺異常等，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致死亡[1,2]。當(dāng)前，不法保健品商家為了提升其產(chǎn)品效果，經(jīng)常在所謂抗疲勞類保健品中添加西地那非、他達(dá)拉非類藥物成分，藥物對(duì)消費(fèi)者的健康構(gòu)成危害。這類抗疲勞類保健品在各種非正規(guī)渠道有大量消費(fèi)群體，潛在的社會(huì)影響巨大。公安和市場(chǎng)監(jiān)督部門為了能夠監(jiān)管相關(guān)案件和產(chǎn)品，須采取必要措施對(duì)保健品中非法添加藥物進(jìn)行快速篩查。故建立保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的檢測(cè)方法意義重大。

長(zhǎng)期以來，公安機(jī)關(guān)依賴專業(yè)的第三方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)涉案樣本進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確但是時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本均較高。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室通常采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)進(jìn)行保健品中西地那非、他達(dá)拉非的檢測(cè)。如國(guó)家食藥總局發(fā)布的食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS 201805《食品中那非類物質(zhì)的測(cè)定》中，超高效液相-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜方法西地那非檢出限是2～5 mg/kg，他達(dá)拉非檢出限是10～40 mg/kg[3]。HPLC-MS技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，是目前檢測(cè)保健品中西地那非及其類似物的常用方法和標(biāo)準(zhǔn)方法。但是此技術(shù)檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，設(shè)備昂貴，單次檢測(cè)成本高，且儀器操作復(fù)雜，需要專業(yè)的人員和有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)分析。目前，公安機(jī)關(guān)向第三方實(shí)驗(yàn)室往返送樣周期在兩周以上，如此長(zhǎng)的檢測(cè)周期難以實(shí)現(xiàn)保健品相關(guān)刑事案件的快速打擊。隨著各地公安對(duì)保健食品案件的重視程度不斷增加，公安機(jī)關(guān)對(duì)保健品非法添加藥物快速篩查技術(shù)的需求愈加迫切。

目前最為普及的西地那非和他達(dá)拉非快速檢測(cè)方法是表面增強(qiáng)拉曼光譜法(SERS)，已經(jīng)在市場(chǎng)監(jiān)督和公安機(jī)構(gòu)得到一定程度的推廣[4-7]。一般操作流程是使用提取劑做簡(jiǎn)單的樣品前處理，混合納米增強(qiáng)試劑進(jìn)行SERS檢測(cè)。拉曼的指紋光譜特性決定其特異性高，避免了假陽性的產(chǎn)生，另外SERS放大了拉曼散射信號(hào)，檢出限可達(dá)到mg/kg級(jí)別的靈敏檢測(cè)。目前，SERS技術(shù)用于保健品中非法添加藥物篩查還有一些局限性，一方面尚無法實(shí)現(xiàn)西地那非和他達(dá)拉非的同時(shí)檢測(cè)，沒有發(fā)揮出SERS多項(xiàng)篩查的優(yōu)勢(shì)。如果能夠?qū)烧吆蠟橥粰z測(cè)流程那么將為使用者帶來更多便利，另一方面對(duì)于添加量較低的樣品，SERS的檢測(cè)靈敏度與HPLC-MS方法相比還有一定差距。需要進(jìn)一步降低方法檢出限，以確保不發(fā)生漏檢。

本文在已有研究基礎(chǔ)上，建立了一種基于SERS的保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的同時(shí)檢測(cè)方法。該方法可同時(shí)對(duì)西地那非和他達(dá)拉非做多項(xiàng)篩查，檢出限為西地那非5 mg/kg，他達(dá)拉非10 mg/kg，檢出限水平與HPLC-MS方法相當(dāng)。方法可測(cè)膠囊、片劑類大部分抗疲勞類保健品。本文所報(bào)道檢測(cè)方法有助于SERS技術(shù)在公安等快檢場(chǎng)景的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑與儀器

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。乙酸乙酯、二氯甲烷、異丙醇、甲醇、乙醇、丙酮為分析純，購(gòu)買自北京百靈威科技有限公司。西地那非和他達(dá)拉非純度≥97%，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，信息見表1。SERS測(cè)試用到的SA50納米增強(qiáng)試劑和助劑購(gòu)于北京鑒知技術(shù)有限公司。

表1 西地那非和他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)品信息Table.1 Basic information of sildenafil and tadalafil standards

實(shí)驗(yàn)所使用的便攜式拉曼光譜儀為北京鑒知技術(shù)有限公司RS3000食品安全檢測(cè)儀。穩(wěn)頻激光光源發(fā)射波長(zhǎng)為785.01 nm，線寬<0.1 nm，能量≥350 mW，數(shù)據(jù)采集時(shí)間≥2 s；光譜分辨率≤8 cm-1；光譜響應(yīng)范圍50 cm-1～3200 cm-1。大龍移液器100 μL、1 mL和5 mL規(guī)格。渦旋振蕩器lab dancer購(gòu)買自德國(guó)IKA公司。離心機(jī)為恒諾可調(diào)迷你離心機(jī)，型號(hào)為ministar 10K，轉(zhuǎn)速3000～10000 rpm。電子天平型號(hào)為西杰BSM224，感量為0.0001 g。

2.2 西地那非、他達(dá)拉非同時(shí)檢測(cè)的樣品前處理步驟

取200 μL液體樣品或0.2 g固體樣品于2 mL離心管中，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋提取1 min，之后10000 rpm離心2 min，上清液待測(cè)；

取400 μL納米增強(qiáng)試劑和20 μL待測(cè)液于測(cè)樣小瓶中，再加入50 μL助劑，混勻放入RS3000樣品倉(cāng)測(cè)試。

整體檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)約為10分鐘。

2.3 結(jié)果判定

RS3000儀器軟件將測(cè)試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)中的西地那非或他達(dá)拉非進(jìn)行匹配計(jì)算。根據(jù)譜圖1582 cm-1(±10 cm-1)處特征拉曼光譜及內(nèi)置校準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品中的西地那非進(jìn)行結(jié)果判定：顯示測(cè)試結(jié)果并判定陰性或陽性。陰性代表該樣品不含有西地那非或低于5.0 μg/g或5.0 μg/mL，陽性則代表該樣品含有西地那非且大于等于5.0 μg/g或5.0 μg/mL。根據(jù)譜圖794 cm-1(±10 cm-1)處特征拉曼光譜及內(nèi)置校準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品中的他達(dá)拉非進(jìn)行結(jié)果判定：顯示測(cè)試結(jié)果并判定陰性或陽性。陰性代表該樣品不含有他達(dá)拉非或低于10.0 μg/g或10.0 μg/mL，陽性則代表該樣品含有他達(dá)拉非且大于等于10.0 μg/g或10.0 μg/mL。

3 結(jié)果與討論

3.1 西地那非和他達(dá)拉非同時(shí)檢測(cè)的樣品前處理步驟優(yōu)化

西地那非的SERS響應(yīng)比他達(dá)拉非強(qiáng)許多，因此檢測(cè)方法的優(yōu)化以他達(dá)拉非為主進(jìn)行。對(duì)提取試劑進(jìn)行了篩選，最終確定乙酸乙酯是最佳提取試劑。分別選用乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-鹽酸反萃取、異丙醇、甲醇、乙醇、丙酮等多種體系，對(duì)10 μg/g的他達(dá)拉非陰性加標(biāo)樣進(jìn)行提取，并完成2.2的檢測(cè)流程得到SERS譜圖(圖1)。他達(dá)拉非主要特征峰峰位如下：574 cm-1、794 cm-1、916 cm-1、986 cm-1、1232 cm-1、1360 cm-1、1478 cm-1、1556 cm-1等。結(jié)果顯示僅有乙酸乙酯的萃取體系才可以較好的得到他達(dá)拉非的8個(gè)特征峰，而其他體系均得到一些干擾峰。這一結(jié)果證明乙酸乙酯可以較為特異性的提取他達(dá)拉非，而不會(huì)引入過多干擾物影響后續(xù)SERS檢測(cè)。

圖1 選用不同提取劑對(duì)他達(dá)拉非陰性加標(biāo)樣品做萃取的最終檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 The Raman spctrum of tadalafil spiked samples using different extraction soluitons

對(duì)前處理過程中的樣品取樣量做了優(yōu)化，證明是使用0.2 mL樣本量為最佳值。分別取樣0.1、0.2、0.5 mL他達(dá)拉非陰性加標(biāo)樣品完成2.2的檢測(cè)流程，得到SERS譜圖(圖2)。當(dāng)取樣量為0.2 mL時(shí)794、986 cm-1等處的特征峰更為明顯，故選用0.2 mL為最佳取樣量。分析其原因，當(dāng)樣本量過大時(shí)，會(huì)給整個(gè)檢測(cè)體系引入過多雜質(zhì)影響。而樣本量過小則會(huì)導(dǎo)致他達(dá)拉非提取濃度過低。

圖2 改變陰性加標(biāo)樣品的取樣量進(jìn)行樣品前處理和檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 The Raman spctrum of tadalafil spiked samples with different sampling amount

3.2 西地那非與他達(dá)拉非同時(shí)檢測(cè)的檢出限

選用陰性加標(biāo)樣品測(cè)試西地那非和他達(dá)拉非的檢出限，最終結(jié)果西地那非檢出限為5.0 μg/g，他達(dá)拉非檢出限為10.0 μg/g。選用一種確認(rèn)不含有西地那非和他達(dá)拉非的陰性保健酒樣品，加標(biāo)不同濃度的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。與他達(dá)拉非不同，西地那非主要特征峰峰位有648 cm-1、814 cm-1、1236 cm-1、1398 cm-1、1528 cm-1、1582 cm-1等，在陰性加標(biāo)樣中主要是1528 cm-1、1582 cm-1兩個(gè)峰比較明顯。從這兩個(gè)峰來看，在5 μg/g

圖3 在陰性加標(biāo)樣品中添加不同濃度的西地那非和他達(dá)拉非后得到的SERS譜圖Fig. 3 The Raman spctrum of spiked samples with different concentrations of sildenafil and tadalafil

及以上濃度的加標(biāo)樣品中，1528 cm-1、1582 cm-1的SERS信號(hào)很明顯，達(dá)到了三倍S/N，空白樣品和2 μg/g加標(biāo)樣品中峰不明顯，故確定樣品中西地那非檢出限為5 μg/g。而他達(dá)拉非主要是574 cm-1、794 cm-1、986 cm-1、1360 cm-1幾個(gè)峰較為明顯。在10 μg/g及以上濃度的加標(biāo)樣品中四個(gè)峰的信號(hào)很明顯，達(dá)到了三倍S/N，空白樣品的5 μg/g加標(biāo)樣品中峰不明顯，故確定樣品中他達(dá)拉非檢出限為5 μg/g。在同時(shí)添加了5 μg/g西地那非和10 μg/g他達(dá)拉非的陰性加標(biāo)樣品中，最終得到的SERS譜圖能同時(shí)看到兩者的特征峰，互相沒有干擾，證明方法可以同時(shí)對(duì)西地那非和他達(dá)拉非進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 對(duì)實(shí)際樣品中的西地那非及他達(dá)拉非進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)

本文開發(fā)的方法可以對(duì)諸多類型的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，且可以對(duì)西地那非和他達(dá)拉非做同時(shí)篩查。從網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)購(gòu)買了兩款抗疲勞類保健品，并使用本文所建立的方法對(duì)兩個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中之一非法添加了他達(dá)拉非。所購(gòu)買的兩款保健品一種為棕色片劑，另一種為綠色膠囊制劑。用2.2的檢測(cè)流程對(duì)兩個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，得到的SERS譜圖見圖4，可見棕色片劑經(jīng)樣品預(yù)處理后的SERS譜圖與他達(dá)拉非的標(biāo)準(zhǔn)譜圖非常類似，幾乎可以找到每一個(gè)他達(dá)拉非特征峰，這說明該樣品中添加了大量的他達(dá)拉非類成分，RS3000也可以直接報(bào)出他達(dá)拉非報(bào)警。另一種膠囊經(jīng)樣品預(yù)處理后的SERS譜圖沒有看到西地那非和他達(dá)拉非的特征峰，說明其中不含有這兩種非法添加藥物。

圖4 對(duì)兩款抗疲勞類保健品進(jìn)行樣品預(yù)處理和檢測(cè)后得到的SERS譜圖Fig.4 The Raman spectrum of two healthcare products analyzed by the method reported in this paper

另一個(gè)案例是消費(fèi)者送樣了一種棕色含片糖果，聲稱有抗疲勞功效，經(jīng)SERS檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)其中含有他達(dá)拉非。圖5是用本文方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，RS3000自動(dòng)生成了檢測(cè)報(bào)告，從實(shí)測(cè)譜圖和標(biāo)準(zhǔn)譜圖的對(duì)比可以看出，樣品中可以找到他達(dá)拉非主要的特征峰，故判斷其中含有他達(dá)拉非，RS3000可以直接報(bào)出他達(dá)拉非報(bào)警。

圖5 某棕色含片的SERS檢測(cè)報(bào)告(RS3000自動(dòng)生成)Fig. 5 The test report of a brown candy analyzed by the method reported in this paper (report automatically generated by RS3000 Raman spectrometer)

從北京微量化學(xué)研究所獲得了18份保健品實(shí)際樣品，經(jīng)SERS檢測(cè)的結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的定性結(jié)果100%吻合。這些樣品已經(jīng)使用實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)方法完成了定性檢測(cè)，14份樣本含有西地那非而4份不含有(表2)。使用本文開發(fā)的西地那非和他達(dá)拉非同時(shí)檢測(cè)的SERS方法對(duì)這些樣品一一進(jìn)行了檢測(cè)，SERS的定性結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室定性結(jié)果完全吻合。這一比對(duì)實(shí)驗(yàn)證明本文的同時(shí)檢測(cè)方法具有很高的準(zhǔn)確性，可以與實(shí)驗(yàn)室方法相匹配。

表2 18個(gè)保健品實(shí)際樣品的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法和拉曼檢測(cè)結(jié)果對(duì)照Table.2 Test results of 18 healthcare products by laboratory standard methods and SERS

4 結(jié)論

本文建立了一種基于SERS的保健食品中非法添加西地那非和他達(dá)拉非的同時(shí)多項(xiàng)檢測(cè)方法。該方法可同時(shí)對(duì)西地那非和他達(dá)拉非做多項(xiàng)篩查，檢出限為西地那非5 mg/kg，他達(dá)拉非10 mg/kg，可測(cè)膠囊、片劑類大部分抗疲勞類保健品，檢出限和定性準(zhǔn)確度與HPLC-MS方法相當(dāng)。本文所研究的檢測(cè)方法顯著提升了西地那非和他達(dá)拉非SERS檢測(cè)方法的檢測(cè)效率和檢測(cè)靈敏度，有助于該技術(shù)在公安等快檢場(chǎng)景的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。