張 琛 馬季文* 汪軼麗 李 熙 祝 鑫 程茂基,3 陳麗娟**

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2.伊利蘇州乳業(yè)有限責(zé)任公司，蘇州 215028；3.安徽五糧泰生物工程股份有限公司，六安 237000)

隨著我國(guó)畜牧產(chǎn)業(yè)的快速增長(zhǎng)，飼料的需求不斷增大，其中優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料成為限制我國(guó)畜牧業(yè)快速發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，尤其是中美貿(mào)易關(guān)系的變化，使得蛋白質(zhì)飼料緊缺的問題更加突出[1]。棉籽粕中蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%以上[2]，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料，我國(guó)作為世界產(chǎn)棉大國(guó)，棉花年產(chǎn)量高達(dá)600萬t以上[3]，擁有豐富的棉籽粕資源。因此，棉籽粕的開發(fā)利用是解決我國(guó)蛋白質(zhì)飼料資源短缺的有效途徑之一，但棉籽粕在動(dòng)物飼料中的利用率僅為30%[4]，其中棉酚是畜禽飼料中使用棉籽粕的主要限制性因素[5]。棉酚包括游離棉酚(free gossypol，F(xiàn)G)和結(jié)合棉酚(bound gossypol，BG)，F(xiàn)G易與飼料(食品)中的蛋白質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分結(jié)合形成BG[6]，難以被機(jī)體吸收利用，大大降低了飼料(食品)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生不良風(fēng)味，從而降低口感，影響動(dòng)物采食量[7]。棉酚攝入后會(huì)損害人和動(dòng)物的生殖系統(tǒng)，抑制精子生成，影響精子存活率，擾亂雌性動(dòng)物發(fā)情周期，引起子宮萎縮，影響妊娠[8-10]。

目前針對(duì)棉籽粕中棉酚的清除方法主要有物理、化學(xué)以及微生物發(fā)酵法，其中物理和化學(xué)法主要是利用加壓及熱處理[11]、有機(jī)溶劑萃取[12]以及添加硫酸亞鐵(Fe2SO4)、過氧化氫(H2O2)、氫氧化鈣[Ca(OH)2]、尿素(CH4N2O)等方式[13]，使棉酚與棉籽蛋白、二價(jià)鐵離子(Fe2+)結(jié)合，將棉籽粕中的棉酚溶解在異丙醇、丙酮等有機(jī)溶劑中，或?qū)⒚薹友趸?、堿化、氨化等，最終使棉籽粕中棉酚含量降低，但物理和化學(xué)法均會(huì)在不同程度上導(dǎo)致棉籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值流失或引入新的污染物，并存在能耗大、成本高、環(huán)境污染等問題。因此，綠色環(huán)保、成本低、效果好、安全的微生物發(fā)酵法成為清除棉酚的研究重點(diǎn)[14-15]。研究顯示，黑曲霉(Asperqillusniger)、熱帶假絲酵母菌(Candidatropicalis)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等微生物具有清除棉酚的作用[16-19]，同時(shí)棉酚對(duì)好氧芽孢桿菌、乳酸菌等具有抑制作用[20]，且對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制效果要強(qiáng)于革蘭氏陰性菌[21]。關(guān)于乳酸菌在棉籽粕脫酚的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以此為出發(fā)點(diǎn)，欲篩選、馴化1株符合《飼料添加劑品種目錄(2013)》中規(guī)定的乳酸菌，并對(duì)其生物特性進(jìn)行研究，以期獲得1株適于棉籽粕生物發(fā)酵脫毒的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

腐殖質(zhì)土壤樣品：2020年2月中旬于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)大楊店棉花種植試驗(yàn)田(31°58′N，117°24′E)采集，去除殘落層，采集腐殖質(zhì)層，用于目標(biāo)菌株的分離。

棉籽粕樣品：牛、羊飼料原料專用棉餅(產(chǎn)地新疆哈密)，從石家莊松妙貿(mào)易有限公司采購(gòu)，用于棉籽粕發(fā)酵試驗(yàn)。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：戊糖片球菌ATCC33316(安徽五糧泰生物工程股份有限公司惠贈(zèng))、金黃色葡萄球菌ATCC25923和大腸桿菌ATCC8739(獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：按20 g/L添加瓊脂粉制備MRS固體培養(yǎng)基，按0.5%添加醋酸棉酚(AG，純度≥98%，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司)制備MRS液體培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種選育

富集：按樣品∶MRS液體培養(yǎng)基=1 g∶10 mL，將樣品浸沒在MRS液體培養(yǎng)基中，充分振蕩，常溫培養(yǎng)24 h。

篩選：取樣液經(jīng)稀釋后涂布于AG濃度為0.2 mg/dL的MRS固體培養(yǎng)基平板中，在37 ℃的條件下，厭氧培養(yǎng)1～7 d。待菌落長(zhǎng)出后，分別挑取不同菌落形態(tài)的菌株，進(jìn)行分離純化，將純化菌株接種至0.2 mg/dL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

馴化：取上述純化菌株接種至AG濃度為0.2 mg/dL的MRS固體培養(yǎng)基平板中，并按0.1 mg/dL的添加量逐步提高AG濃度至0.5 mg/dL。

1.2.2 菌種的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：觀察已純化后的單個(gè)菌落形態(tài)，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，選取革蘭氏陽性菌株。

生理生化鑒定：參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[22]進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，并使用杜氏小管進(jìn)行產(chǎn)氣試驗(yàn)；參照Nayak等[23]的方法對(duì)菌株溶血特性進(jìn)行分析，取穩(wěn)定期菌種，接種至0.5%羊血的血平板，于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，通過觀察菌落周圍是否有溶血環(huán)，若出現(xiàn)，則具有溶血性，反之則沒有溶血性。

分子生物學(xué)鑒定：取穩(wěn)定期菌液進(jìn)行基因組DNA提取，以基因組DNA為模板對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物，序列為：1492R(5’-RGYTACCTTGTTACGACTT-3’)和27F(5’-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3’)(上海凌恩生物科技有限公司合成)。PCR擴(kuò)增體系20 μL：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物(5 μmol/L)0.8 μL，下游引物(5 μmol/L)0.8 μL，DNA模板10 ng，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 min，35次循環(huán)；最后72 ℃ 10 min，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，回收所需PCR產(chǎn)物并送至上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定，將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，應(yīng)用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)特性的測(cè)定

按菌液2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃連續(xù)培養(yǎng)，每2 h取樣，連續(xù)取樣10次，測(cè)定600 nm處吸光度(OD600)值，繪制生長(zhǎng)曲線，并測(cè)定pH。

1.2.4 菌株耐熱性能的測(cè)定

取穩(wěn)定期菌液，4 000×g離心5 min，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌菌體沉淀3次后等體積重懸，分別于37、40、45、50、55 ℃條件下靜置培養(yǎng)30 min，以處理前的菌液作為對(duì)照，采用平板菌落法統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)，計(jì)算每個(gè)處理溫度下的菌體存活率。

1.2.5 菌株抑菌特性的測(cè)定

以金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC8739作為指示菌，對(duì)選育菌株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。取穩(wěn)定期各菌液，并調(diào)節(jié)濃度至1×106CFU/mL，用無菌拭子蘸取指示菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板中，用打孔器(直徑8 mm)在每個(gè)培養(yǎng)基上打出3個(gè)孔[24]，每孔注入20 μL供試菌菌液。37 ℃培養(yǎng)10～16 h后觀察并測(cè)量抑菌圈直徑(抑菌圈直徑不包括打孔器直徑)。

1.2.6 菌株發(fā)酵棉籽粕

取穩(wěn)定期OD600值=1.0的菌液，用PBS配制成2%的種子液；將干燥的棉籽粕經(jīng)粉碎過40目篩，取等量棉籽粕分為試驗(yàn)組、空白組、標(biāo)準(zhǔn)株組。試驗(yàn)組按棉籽粕∶種子液=1 g∶1 mL添加種子液，空白組添加等量無菌水；標(biāo)準(zhǔn)株組以戊糖片球菌ATCC33316作為模式菌株等量添加。各組均在37 ℃恒溫、密閉、避光的條件下靜置發(fā)酵7 d。

1.2.7 棉酚清除率的測(cè)定

將上述經(jīng)發(fā)酵處理的樣品進(jìn)行冷凍干燥、研磨，采用ISO法對(duì)FG、總棉酚(TG)含量進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)公式計(jì)算BG含量以及BG、FG清除率[25]。

BG含量(μg/g)=TG含量-FG含量；BG清除率(%)=100×(處理前樣品中BG含量-處理后樣中BG含量)/處理前樣品中BG含量；FG清除率(%)=100×(處理前樣品中FG含量-處理后樣中FG含量)/處理前樣品中FG含量。

1.2.8 發(fā)酵棉籽粕營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，分別按DB15/T 1458—2018[26]、GB/T 6435—2014[27]、GB/T 6432—2018[28]、GB/T 6438—2007[29]、GB/T 20806—2006[30]和NY/T 1459—2007[31]方法測(cè)定樣品的pH及干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、粗灰分(Ash)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維含量(ADF)含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用one-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 7.5軟件作圖分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

經(jīng)平板初篩和抑菌評(píng)估復(fù)篩，分離獲得1株供試菌株，命名為WTC1，由圖1可見，WTC1在MRS培養(yǎng)基及含0.5% AG的MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落呈乳白色，凸起，濕潤(rùn)，圓形，邊緣整齊，直徑為(3±1) mm。革蘭氏染色呈紫紅色陽性球菌，無芽孢。WTC1生理生化鑒定結(jié)果見表1，該菌可以在有氧環(huán)境下生長(zhǎng)，無觸酶反應(yīng)，葡萄糖不產(chǎn)氣，無溶血反應(yīng)，可以利用纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等常規(guī)糖，但不可利用山梨醇。結(jié)合鏡檢及生理生化特征，初步確定WTC1為球狀乳酸菌。

表1 WTC1生理生化鑒定結(jié)果

A：MRS培養(yǎng)基 MRS medium；B：含0.5%AG的MRS培養(yǎng)基 MRS medium containing 0.5% AG；C：革蘭氏染色結(jié)果 Gram staining result。

2.2 WTC1的16S rDNA鑒定

對(duì)WTC1進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定后，獲得大小為1 490 bp的片段(圖2)，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，顯示該菌株與戊糖片球菌基因序列同源性為99.06%～99.46%，取部分相似序列，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化，結(jié)果如圖3所示，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定結(jié)果，綜合分析WTC1為戊糖片球菌，并將純化高活性菌株進(jìn)行保藏。

M：標(biāo)記 marker。

Pediococcus pentosaceus strain：戊糖片球菌菌株。

2.3 WTC1生長(zhǎng)特性

根據(jù)測(cè)試結(jié)果，取平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別以O(shè)D600值、pH為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線、pH變化曲線，結(jié)果如圖4。在0～2 h，WTC1處于延滯期，菌體量無明顯增長(zhǎng)；在2～8 h，菌體進(jìn)入旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體量呈現(xiàn)幾何型增長(zhǎng)；在8～24 h，菌體量增長(zhǎng)減緩進(jìn)入穩(wěn)定期。在0～2 h，菌液pH維持在6.2左右，在2～6 h，菌液pH大幅下，8 h后菌液pH下降幅度趨于平緩，最終維持在3.8左右。由此可知，該菌株的生長(zhǎng)與pH密切相關(guān)，菌株在生長(zhǎng)期快速增殖，分泌大量有機(jī)酸，使pH降低；在穩(wěn)定期pH趨于恒定，停止增殖。

圖4 WTC1生長(zhǎng)曲線與pH曲線

2.4 WTC1耐熱性

由圖5可見，WTC1在試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)均有細(xì)胞存活，但存活率隨試驗(yàn)溫度升高而下降，各組間存在顯著差異(P<0.05)，其中37 ℃時(shí)存活率最高，為99.72%；50 ℃時(shí)存活率低至12.51%；37～45 ℃時(shí)存活率均大于70%。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7同。

2.5 WTC1抑菌性能

由表2和圖6可見，WTC1對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有較好的抑制作用。

A：金黃色葡萄球菌 S. aureus；B：大腸桿菌 E. coli。

表2 WTC1抑菌性能

2.6 WTC1發(fā)酵棉籽粕對(duì)棉酚的清除效果

由圖7可見，經(jīng)發(fā)酵處理后，F(xiàn)G和BG含量均有不同程度地減少。其中，WTC1組FG和BG清除率分別為87.15%、22.83%，均顯著高于空白組和標(biāo)準(zhǔn)株組(P<0.05)；標(biāo)準(zhǔn)株組FD清除率為22.47%，顯著高于空白組(P<0.05)；標(biāo)準(zhǔn)株組和空白組BG清除率分別為1.64%、1.26%，無顯著差異(P>0.05)。

圖7 不同處理棉籽粕中FG、BG清除率

2.7 WTC1發(fā)酵對(duì)棉籽粕發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表3可見，與空白組相比，WTC1組和標(biāo)準(zhǔn)株組pH和中性洗滌纖維含量均顯著降低(P<0.05)，干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)含量顯著增加(P<0.05)，其余指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。WTC1組和標(biāo)準(zhǔn)株組之間發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。

表3 WTC1發(fā)酵對(duì)棉籽粕發(fā)酵品質(zhì)的影響

3 討 論

戊糖片球菌是《飼料添加劑品種目錄(2013)》中規(guī)定可添加使用的微生物菌種，飼料經(jīng)戊糖片球菌發(fā)酵后pH降低，可抑制發(fā)酵飼料其他雜菌生長(zhǎng)，降低發(fā)酵飼料干物質(zhì)損失，同時(shí)提高發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[32]。戊糖片球菌廣泛應(yīng)用于家禽、反芻動(dòng)物的飼喂及畜禽生產(chǎn)中[33-34]。本研究從環(huán)境中選育獲取的戊糖片球菌對(duì)棉酚有較強(qiáng)的耐受性，無溶血現(xiàn)象，安全性高，符合預(yù)期目標(biāo)，具有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值。

豐富的有機(jī)酸可以通過降低胃腸道pH，抑制有害微生物繁殖，促進(jìn)有益菌的增殖，激發(fā)食欲，促進(jìn)動(dòng)物采食量，緩解腹瀉等問題[35-36]。經(jīng)抑菌試驗(yàn)驗(yàn)證，WTC1對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有良好的抑制作用，這與前人的研究結(jié)果[37]一致，經(jīng)MRS培養(yǎng)液培養(yǎng)WTC1 8 h可將溶液pH維持在3.8，在發(fā)酵棉籽粕中WTC1可將發(fā)酵體系pH維持在4.2，且與商品菌株的發(fā)酵pH及相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成分無差異，表明本試驗(yàn)所獲菌種可滿足飼料發(fā)酵的相關(guān)需求。

棉酚性質(zhì)活潑，穩(wěn)定性差，會(huì)緩慢降解[38-39]，在發(fā)酵過程中，棉酚的自然降解會(huì)引起棉籽粕中FG、BG含量的變化，同時(shí)棉籽粕中原有微生物也有可能分泌相關(guān)物質(zhì)引起FG和BG含量的變化，最終體現(xiàn)在空白組FG和BG含量減少。通過設(shè)置空白組，可排除棉酚自身降解及棉籽粕原有微生物對(duì)測(cè)試結(jié)果的干擾。標(biāo)準(zhǔn)株組FG清除率顯著高于空白組，而BG清除率與空白組沒有顯著差異，但WTC1組FG和BG清除率顯著高于空白組和標(biāo)準(zhǔn)株組，表明戊糖片球菌具有清除FG的作用。已有研究篩選出嗜酸乳桿菌、乳酸菌BLCC2-0092、植物乳桿菌LR002等適于棉籽粕發(fā)酵的優(yōu)良乳酸菌菌種[40-42]，與芽孢桿菌、酵母菌等菌種復(fù)配后發(fā)酵棉籽粕中可清除60%～92%的FG，但沒有對(duì)BG的清除作用進(jìn)行報(bào)道。本試驗(yàn)所獲得的戊糖片球菌菌株對(duì)FG清除率達(dá)87.15%，顯著高于標(biāo)準(zhǔn)株，同時(shí)可清除22.83%的BG，更加適于棉籽粕生物發(fā)酵清除FG和BG。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)分離獲得1株具有清除FG和BG雙重作用的戊糖片球菌，豐富了棉籽粕發(fā)酵脫毒的乳酸菌種類，該菌株無溶血現(xiàn)象，安全性高，可在較短時(shí)間內(nèi)快速增殖，使發(fā)酵體系pH降至3.8，45 ℃以內(nèi)存活率均大于70%，同時(shí)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有抑制作用，經(jīng)棉籽粕發(fā)酵試驗(yàn)，可將FG含量減少87.15%，且對(duì)棉籽粕營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)有改善作用，可滿足飼料發(fā)酵工業(yè)對(duì)菌種的需求，用于棉籽粕生物發(fā)酵。