桉樹無性系BL1號的組織培養(yǎng)技術(shù)研究

甘德煜，呂明燦，彭新榮，楊福超，王秋惠，劉精華

桉樹無性系BL1號的組織培養(yǎng)技術(shù)研究

甘德煜，呂明燦，彭新榮，楊福超，王秋惠，劉精華

(廣西國有博白林場，廣西 博白 537617)

以廣西國有博白林場林科所選育的桉樹無性系BL1號優(yōu)株帶芽莖段為外植體進行組培快繁技術(shù)體系研究。闡述了桉樹無性系BL1號快速繁殖的過程，通過外植體的采集、消毒、誘導(dǎo)、擴繁、生根、移栽等階段，培養(yǎng)出完整的植株。結(jié)果表明：晴天+純凈水沖洗30 min+0.15%HgCl2(3+7)min為外植體消毒最佳處理方案。在改良的MS培養(yǎng)基添加VC15.0 mg·L-1能有效控制外植體褐變，不同褐化劑對外植體的影響效果為：VC＞Cys＞Na2S2O3＞CK。改良MS+BA 1.0 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1是繼代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。改良MS+BA0.5 mg·L-1+NAA 0.08 mg·L-1+KT 0.02 mg·L-1是生根有效芽繁殖最適培養(yǎng)基。改良MS+BA 0.25 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA0.6 mg·L-1是生根最適培養(yǎng)基。

桉樹無性系；尾葉桉BL1號；組織培養(yǎng)

桉樹()研究從“六五”開始首次被列入國家科技攻關(guān)計劃，歷時40余年科技創(chuàng)新研究，促進了我國桉樹全產(chǎn)業(yè)鏈的快速發(fā)展[1-2]。目前，全國桉樹年產(chǎn)木材超過4 000萬m3，桉樹產(chǎn)業(yè)全產(chǎn)業(yè)鏈總產(chǎn)值超過4 000億元[3]。天然林保護工程實施后，我國木材供需缺口不斷擴大，桉樹的發(fā)展，提高了我國木材產(chǎn)出能力，維護了我國生態(tài)安全和木材安全[4]。林木種苗是林業(yè)建設(shè)的基礎(chǔ)和前提，林業(yè)要發(fā)展，種苗是關(guān)鍵[5]。為進一步做好我國的森林種苗建設(shè)，推動我國林業(yè)持續(xù)快速健康發(fā)展，必須高度重視森林種苗培育工作[6]。研究結(jié)果表明，用組培苗造林在投入產(chǎn)出及林木生長量上優(yōu)于扦插苗造林，桉樹組織培養(yǎng)技術(shù)已成為桉樹繁殖的重要手段[7-8]，但影響桉樹組培快繁的因子復(fù)雜多變，如何解決其中的技術(shù)問題已成了桉樹優(yōu)良無性系推廣應(yīng)用的關(guān)鍵[9-10]。

廣西博白林場于1997年從東門林場引進尾葉桉()種子園的種子苗并營造了15.3 hm2純林。2013年博白林場林科所選出樹高27 m、平均胸徑25.9 cm、枝下高18.3 m的優(yōu)良單株，編號為桉樹無性系BL1號。經(jīng)過博白林場和周邊地區(qū)種植試驗表明，桉樹無性系BL1號生長快、干形好、適應(yīng)性強、經(jīng)濟價值高，發(fā)展前景良好。以往一般采用種子繁殖的方法進行育苗，阻礙了桉樹無性系BL1號擴大種植的速度和優(yōu)良遺傳品質(zhì)的保持，而利用離體組培快繁技術(shù)培育出完整植株，可在短時間內(nèi)大量提供性狀穩(wěn)定的幼苗，為桉樹無性系BL1號的高效快繁和規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。本研究對桉樹無性系BL1號的外植體消毒、降低外植體褐化率、提高誘導(dǎo)增殖系數(shù)、提高生根有效芽系數(shù)和幼苗生根率等方面進行探索，以期找出適宜的組織培養(yǎng)技術(shù)，為相關(guān)生產(chǎn)和科研單位提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

對桉樹無性系BL1號在距離地面30 cm處進行環(huán)割催芽，當(dāng)芽條長至30 ～ 40 cm時，在晴天午后選取潔凈、無病蟲害的健壯芽條進行采集，剪取萌條生長能力較強的頂芽莖段作為外植體，用干凈并經(jīng)過消毒的濕毛巾保濕帶回組培室內(nèi)進行處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒

將采集回來的外植體置于1 000倍退菌特溶液中浸泡15 min后用純凈水沖洗干凈表面塵埃，去除葉片保留葉柄及腋芽，用去離子水洗5 ～ 6次，置于超凈工作臺上，然后用75%乙醇消毒25 min，再用 HgCl2處理10 min、(5+5) min、(3+7) min、(2+8) min進行消毒效果對比，期間輕輕搖動使消毒均勻，再用無菌水清洗3次。消毒后選取萌芽條半木質(zhì)化部分，切成至少帶一節(jié)眼1.5 ～ 2 cm長的莖段，用無菌濾紙吸干水分，剪掉莖段兩端被藥物損傷部分，接種于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中。

1.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)

基本培養(yǎng)基選用MS固體培養(yǎng)基，適當(dāng)調(diào)整大量元素N、P、K的比例和增加不同濃度的細胞分裂素及生長素、2%蔗糖和0.5%卡拉膠，pH值5.8 ～ 6.8。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配比選用BA、NAA和KT 3種植物生長調(diào)節(jié)劑(下稱激素)，3種濃度，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)25瓶，每瓶1個外植體，具體試驗設(shè)計見表1。接種后先暗培養(yǎng)15 d，30 d時統(tǒng)計外植體污染率、褐化率、萌芽率。計算方法如下：污染率/%=污染數(shù)/接種總數(shù)，褐化率/%=褐化數(shù)/接種總數(shù)，萌芽率/%=萌發(fā)數(shù)/接種總數(shù)。

表1 外植體消毒和接種培養(yǎng)試驗設(shè)計表

1.2.3 繼代培養(yǎng)

采用正交設(shè)計對最佳繼代培養(yǎng)基進行篩選，將誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的叢生芽腋芽長至0.5 ～ 1 cm時，及時切下并轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基上，每隔20 ～ 30 d，轉(zhuǎn)移材料一次，每處理25瓶，每瓶1個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)10 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)與生根有效芽系數(shù)。增殖系數(shù)＝新芽總數(shù)/接種芽總數(shù)，生根有效芽系數(shù)=生根芽(苗高0.5 cm以上)總數(shù)/接種芽總數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng)

選用5種生根培養(yǎng)基，每個處理5瓶，3個重復(fù)，每瓶20株，培養(yǎng)35 d觀察苗生長狀況和統(tǒng)計生根率。生根率=生根苗(根長0.3 cm以上)數(shù)/接種總數(shù)。5種生根培養(yǎng)基為：MS+BA0.25 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1、MS+BA0.25 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+IBA0.4 mg·L-1、MS+BA0.25 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+IBA0.6 mg·L-1、MS+BA0.25 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+IBA0.8 mg·L-1、MS+BA0.25 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+IBA1.0 mg·L-1。

1.2.5 不同抗褐化劑對芽褐化的影響

以改良MS為基本培養(yǎng)基，通過添加抗褐化劑來降低外植體培養(yǎng)的褐化率。其種類和濃度各有3種：(1)半胱氨酸(Cys)：100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1；(2)抗壞血酸(VC)：5 mg·L-1、10 mg·L-1、15 mg·L-1；(3)硫代硫酸鈉(Na2S2O3)：100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1；(4)對照(CK)。每處理25瓶，每瓶1個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)15 d、30 d時觀察褐化程度及芽生長狀況，統(tǒng)計褐化率。褐化率/%=褐化數(shù)/接種數(shù)。

1.3 培養(yǎng)條件

接種后暗光培養(yǎng)7 ～ 10 d。發(fā)生褐變時，要將外植體轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度25 ℃，濕度75% ～ 85%，光照時間12 ～ 14 h·d-1，光照度1 500 ～ 2 000 Lux，如遇到連續(xù)陰雨天氣，可用高壓汞燈照明以補充光源。注意保持室內(nèi)環(huán)境干凈且經(jīng)嚴(yán)格消毒。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以EXCEL 2010和SPSS 26統(tǒng)計軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對外植體的影響

HgCl2消毒時間和消毒方式對外植體消毒產(chǎn)生不同影響(表2)。接種12 d后側(cè)芽出現(xiàn)萌動，莖段切口明顯膨大，但未見愈傷組織。分兩次消毒在污染率和褐化率的控制上均明顯好于一次性消毒，且隨消毒時間的延長，污染率降低，褐化率升高。綜合污染率、褐化率、萌芽率，純凈水沖洗30 min+0.15%HgCl2(3+7)min為外植體消毒最佳處理方法。

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)增殖的影響

以改良MS為基本培養(yǎng)基，添加BA、NAA和KT 3種激素的不同濃度組合進行繼代增殖培養(yǎng)和生根有效芽培養(yǎng)，對其生長調(diào)節(jié)劑組合進行篩選，結(jié)果見表3。由表4可知，BA對增殖系數(shù)及生根有效芽數(shù)的影響均達到了顯著水平，NAA和KT對其影響不顯著，說明BA是桉樹無性系BL1號增殖的主導(dǎo)因子。從增殖系數(shù)來看，處理8、9顯著高于其他處理；結(jié)合表5結(jié)果可知，增殖系數(shù)最高的處理8，即改良MS+BA 1.0 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1是誘導(dǎo)繼代繁殖的最適培養(yǎng)基。從生根有效芽系數(shù)來看，處理4、5顯著高于其他處理，結(jié)合極差分析(表5)可知，生根有效芽系數(shù)最高的處理4，即改良MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.08 mg·L-1+KT 0.02 mg·L-1是生根有效芽繁殖的最適培養(yǎng)基。

表2 不同消毒處理對外植體和誘導(dǎo)的影響

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)增殖的影響

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)對增殖影響的方差分析

表5 增殖系數(shù)及生根有效芽系數(shù)極差分析

2.3 誘導(dǎo)生根數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

叢生芽在培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 ～ 30 d，挑選1.5 ～ 3 cm高、葉片舒展、健壯的小芽，轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改良的5種配方培養(yǎng)基其生根率差異明顯(表6)，其中3號生根培養(yǎng)基(MS+BA0.25 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+IBA0.6 mg·L-1)生根率最高，且苗木木質(zhì)化較好，葉片伸展，葉色濃綠，接種20 ～ 30 d后，苗高可達3 ～ 5 cm。激素濃度高的基部有明顯的瘤狀愈傷組織，不利于生根。

2.4 不同抗褐化劑對外植體褐化控制的影響

由表7可知，添加抗褐化劑不同程度降低了桉樹無性系BL1號外植體的褐化率。從抗褐化劑種類看，以Vc效果較好，Cys次之，而Na2S2O3效果最差。Vc隨著其添加濃度的增加，抗褐化效果明顯增強，褐化率降低；當(dāng)添加到15 mg·L-1的Vc時，褐化率低至14%，而且芽體生長正常。在添加Cys的培養(yǎng)基中，在濃度為100 mg·L-1時，顏色為淡褐色，芽體生長正常，但褐化率較高，隨著濃度的增加，抗褐化效果明顯增強，褐化率降低，但芽體生長不良，細弱黃化。不同濃度的Na2S2O3表現(xiàn)較差，褐化程度均較高，且芽體均生長不良，黃化嚴(yán)重。CK對外植體褐變的控制幾乎沒有效果。因此添加15.0 mg·L-1的Vc為最佳抗褐化劑。

2.5 苗木移栽

為加強苗木的木質(zhì)化，當(dāng)瓶苗在室內(nèi)根系長至0.5 ～ 1 cm時移到有適當(dāng)光照條件的大棚內(nèi)煉苗。煉苗7 ～ 15 d后待幼苗木質(zhì)化較好、根系發(fā)達、有3 ～ 5對小葉、健壯時便可移栽。育苗基質(zhì)采用黃心土基質(zhì)，提前24 h用0.3%的高錳酸鉀溶液對其消毒，移栽前將基質(zhì)淋透水。幼苗移栽前用自來水將根系上的培養(yǎng)基清洗干凈，置于盤中，之后用消毒過的鑷子把苗栽于杯的中間，移栽完畢后淋透水。

2.6 幼苗管護

初移栽幼苗生命力脆弱，需細致管理，保持基質(zhì)的濕潤，水分以葉面濕為佳。苗移栽成活后，每隔7 ～ 10 d施肥1次，濃度0.1% ～ 0.3%，施時堅持由稀到濃的原則。苗木長至15 ～ 25 cm時即可出圃。幼苗易發(fā)生莖腐病、根腐病和猝倒病等，因此移栽6 ～ 10 d要噴滅菌劑如多菌靈、百菌清防病，每隔10 d左右噴殺1次。苗木的蟲害主要有白蟻、蚜蟲等，白蟻可用1 000倍70%辛硫磷淋殺，蚜蟲可用800 ～ 1 000倍80%的氧化樂果噴殺。

表6 不同激素組合配比生根培養(yǎng)基對幼苗生根的影響

表7 不同抗褐化劑對芽誘導(dǎo)褐化率的影響

3 結(jié)論

(1)以晴天午后采條效果最好。用純凈水充分沖洗外植體，可起到較好的清潔作用。用1 000倍退菌特溶液浸泡15 min，有較好的殺菌作用。采用HgCl2分兩個時間段的消毒方法，有良好的殺菌效果。試驗表明，晴天+純凈水沖洗30 min+0.15% HgCl2(3+7) min為其外植體最佳采集消毒處理方法。

(2)不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對桉樹無性系BL1號誘導(dǎo)繼代培養(yǎng)增殖有顯著影響。研究結(jié)果表明，改良MS+BA 1.0 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1是誘導(dǎo)繼代繁殖的最適培養(yǎng)基；改良MS + BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.08 mg·L-1+KT 0.02 mg·L-1是生根有效芽繁殖的最適培養(yǎng)基。

(3)不同激素組合配比生根培養(yǎng)基對小苗生根的影響有顯著不同。試驗表明，改良MS+ BA 0.25 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.6 mg·L-1是桉樹無性系BL1號生根繁殖的最適培養(yǎng)基。

(4)不同抗褐化劑對外植體褐化控制的影響不同。抗壞血酸(VC)隨著添加濃度的增加，抗褐化效果明顯增強，褐化率降低；當(dāng)添加抗壞血酸(Vc)到15 mg·L-1時，褐化率低達14%，而且芽體生長正常。不同褐化劑對外植體的影響效果為：VC>Cys>Na2S2O3>CK。

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Study on Tissue Culture Technology ofClone BL1

GAN Deyu, LV Mingcan, PENG Xinrong, YANG Fuchao, WANG Qiuhui, LIU Jinghua

()

The tissue culture and rapid propagation technology system ofclone BL1 was studied using stem segments with buds as explants. The process of rapid propagation of BL1 is described in this paper. Cultivation of complete seedling plants of this clone involved many steps including shoot collection, disinfection, induction, propagation, rooting and transplanting of explants. The results showed that the best method of explants collection and treatment involved collection on sunny days, then washing for +30 minutes with pure water +0.15% HgCl2for 3+7 minutes. It was found that VC15.0 mg·L-1was an effective method for controlling explant browning, and the effect of different browning agents on explants is as follows: VC> Cys>Na2S2O3>CK. Modified MS+BA 1.0 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1was the optimal medium for subculture. Modified MS+BA0.5 mg·L-1+NAA 0.08 mg·L-1+KT 0.02 mg·L-1proved an effective medium for bud propagation. The optimal rooting medium was modified MS+BA 0.25 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA0.6 mg·L-1.

clone;BL1; tissue culture

10.13987/j.cnki.askj.2022.02.005

S722.3+7

A

甘德煜(1966— )，男，本科，高級工程師，主要從事林木育種和林木栽培技術(shù)研究，E-mail:472591482@qq.com