彭文超 胡真真 駱 琳 鄧蒙蒙 蔡 杰 劉建新 王迪銘

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，奶業(yè)科學(xué)研究所，杭州 310058)

隨著我國奶牛單產(chǎn)大幅提升，高產(chǎn)奶牛的營養(yǎng)代謝類疾病發(fā)病率也逐年躍升。作為奶牛代謝疾病發(fā)生的一個重要因素，如何避免機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制遭到破壞已經(jīng)成為奶牛育種、營養(yǎng)和生理研究領(lǐng)域的重要熱點?；谧杂苫珊颓宄难趸瘧?yīng)激調(diào)控是維持奶牛代謝穩(wěn)態(tài)的重要內(nèi)容。目前，奶牛代謝應(yīng)激方面的研究主要集中于熱應(yīng)激[1]、運(yùn)輸應(yīng)激[2]、密度應(yīng)激[3]等方面。

作為細(xì)胞代謝過程中一種重要物質(zhì)，氧氣在哺乳動物代謝穩(wěn)態(tài)和功能維持中發(fā)揮重要作用。例如，當(dāng)肺泡細(xì)胞發(fā)生缺氧時，氧敏感基因[低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和低氧誘導(dǎo)因子-2α(HIF-2α)]表達(dá)量上調(diào)可直接導(dǎo)致其線粒體功能紊亂和肺功能障礙[4]。另外，心衰和呼吸衰竭可直接降低肝臟輸氧量，進(jìn)而提高肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力并導(dǎo)致其器質(zhì)性病變[5]。然而，氧供給對奶牛機(jī)體代謝影響及其機(jī)制仍有待深入研究。

由于較高的乳汁合成代謝過程和維持需要，高產(chǎn)奶牛不僅在葡萄糖、氨基酸等乳成分前體物方面具有較高的需要量，同時也消耗了大量氧氣，在合成乳汁的同時產(chǎn)生大量自由基。與泌乳盛期奶牛相比，泌乳后期奶牛在產(chǎn)奶量和乳腺應(yīng)激方面均較低[6]。然而，作為乳汁合成的直接器官，氧供給對奶牛乳合成效率和乳腺代謝應(yīng)激之間的關(guān)系仍有待研究。因此，本研究通過比較不同泌乳時期荷斯坦奶牛血?dú)鈪?shù)、乳腺氧化應(yīng)激狀態(tài)相關(guān)參數(shù)，在明確不同泌乳時期奶牛氧代謝差異的同時，為深入研究氧調(diào)節(jié)奶牛機(jī)體代謝和功能穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本試驗的研究內(nèi)容以及所實際用到的試驗動物均經(jīng)過浙江大學(xué)動物福利委員會(中國杭州)的批準(zhǔn)，符合浙江大學(xué)動物研究指南。試驗在中國浙江省杭州市臨安區(qū)杭州正興牧業(yè)有限公司(浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所的試驗站)開展，所有涉及動物的程序均經(jīng)浙江大學(xué)動物保護(hù)和使用委員會批準(zhǔn)。選擇18頭處于泌乳盛期[泌乳天數(shù)(61.80±3.72) d，產(chǎn)奶量(55.65±3.95) kg/d，胎次(2.74±0.19)胎，體重(701±55) kg]和16頭處于泌乳后期[泌乳天數(shù)(289.10±6.78) d，產(chǎn)奶量(12.27±4.70) kg/d，胎次(2.81±0.15)胎，體重(727±63) kg]的上一胎次產(chǎn)奶量相近、胎次一致的泌乳荷斯坦奶牛作為試驗動物。

1.2 采樣與相關(guān)指標(biāo)測定

奶樣采集和檢測：采樣周期為3 d，每天記錄早、中、晚3次產(chǎn)奶量。產(chǎn)奶量測定的最后1 d采集奶樣，按早∶中∶晚=4∶3∶3的比例取50 mL奶樣，取3份。每1份奶樣再均分為3份，第1份奶樣中加入甲酸防腐劑，之后送至光明乳業(yè)DHI檢測中心，采用乳成分分析儀(Foss Eletric，Hiller?d，丹麥)對乳蛋白、乳脂、乳糖、尿素氮含量及體細(xì)胞數(shù)進(jìn)行檢測；第2份奶樣放置在4 ℃環(huán)境下保存，之后用氨基酸自動分析儀(Hitachi High-Technologies Corporation，日本)測定氨基酸含量，樣品前處理參考前人方法[7]；第3份奶樣置于-20 ℃環(huán)境保存，之后用于乳中氧化應(yīng)激[活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量]和抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)[氧化自由基吸收能力(ORAC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性]測定，檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法。

血樣采集和檢測：晨飼后約3 h，分別從每頭奶牛的尾動脈和乳靜脈處收集血液樣品到真空采血管中，每個樣品采集3份。第1份血樣采集后立刻測定生理、生化、血?dú)獾葏?shù)(雅培300-G血?dú)夥治鰞x，美國)，測定指標(biāo)包括：生化/電解質(zhì)參數(shù)(鈉、鉀、離子鈣、葡萄糖、尿素氮、肌酐和乳酸含量)、血液學(xué)參數(shù)(紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白含量)和血?dú)鈪?shù)(pH、二氧化碳分壓、氧分壓、總二氧化碳含量、碳酸根離子含量、堿剩余和氧飽和度)；第2份血樣以3 000×g離心15 min獲得血漿，用于測定氨基酸含量；第3份血樣采集后，乳靜脈血以3 000×g離心15 min獲得血漿并儲存于-20 ℃，用于測定血漿中氧化應(yīng)激(ROS和MDA含量)與抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)(ORAC GSH-Px和SOD活性)，方法為ELISA法，尾動脈血則用五分類血球儀分析血常規(guī)指標(biāo)。

1.3 計算公式

乳腺血流量(MPF)估測參考菲克原理[8]，計算公式：

乳腺血流量(L/d)=牛奶中苯丙氨酸(Phe)+酪氨酸(Tyr)(g/d)×0.965/[動靜脈差(Phe+Tyr)(g/L)]。

反映乳腺氧供給和利用的指標(biāo)計算公式如下：

血液氧含量(mL/dL)=0.003×血液氧分壓+1.39×血紅蛋白含量×氧飽和度；24 h乳腺氧供給量(L/d)=血流量×尾動脈血氧含量；24 h乳腺氧消耗量(L/d)=血流量×(尾動脈血氧含量-乳靜脈血氧含量)；乳腺氧氣利用率(%)=(24 h乳腺氧消耗量/24 h乳腺氧供給量)×100；生產(chǎn)單位牛奶的耗氧量(L/kg)=24 h乳腺氧供給/日產(chǎn)奶量。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SAS 9.2軟件的one-way ANOVA程序?qū)Σ煌谌闀r期奶牛的試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用配對t檢驗對不同組間數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示。以P≤0.01表示差異極顯著，0.01

2 結(jié) 果

2.1 泌乳盛期與泌乳后期奶牛的泌乳性能比較

奶牛產(chǎn)奶量、泌乳天數(shù)和乳成分等相關(guān)信息列于表1。泌乳盛期奶牛的乳蛋白、乳脂含量均極顯著低于泌乳后期奶牛(P<0.01)，而乳糖含量極顯著高于泌乳后期奶牛(P<0.01)。

表1 泌乳盛期與泌乳后期奶牛的泌乳性能比較

2.2 泌乳盛期與泌乳后期奶牛的乳靜脈血?dú)鈪?shù)比較

泌乳盛期與泌乳后期奶牛的乳靜脈血?dú)鈪?shù)列于表2。與泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛乳靜脈血中葡萄糖(P<0.01)、鈉(P<0.01)、離子鈣(P<0.01)和血紅蛋白(P<0.01)含量和紅細(xì)胞壓積(P<0.01)均極顯著降低，而總二氧化碳含量(P<0.01)、pH(P<0.01)、碳酸氫根含量(P<0.01)、堿剩余(P<0.01)均極顯著升高，氧飽和度(P=0.09)有升高趨勢。

表2 泌乳盛期與泌乳后期奶牛的乳靜脈血?dú)鈪?shù)比較

2.3 泌乳盛期與泌乳后期奶牛的尾動脈血?dú)鈪?shù)比較

泌乳盛期與泌乳后期奶牛的尾動脈血?dú)鈪?shù)列于表3。與泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛尾動脈血中葡萄糖(P<0.01)、鈉含量(P<0.01)極顯著降低，氧分壓(P=0.07)有降低趨勢。

表3 泌乳盛期與泌乳后期奶牛的尾動脈血?dú)鈪?shù)比較

2.4 泌乳盛期與泌乳后期奶牛的乳腺氧代謝相關(guān)指標(biāo)比較

泌乳盛期與泌乳后期奶牛的乳腺氧代謝相關(guān)指標(biāo)列于表4。與泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛尾動脈氧含量(P<0.01)極顯著降低，乳靜脈氧含量(P=0.06)有降低的趨勢。從乳腺氧氣消耗的角度來看，泌乳盛期奶牛乳腺氧總供給量(P<0.01)和總消耗量(P<0.01)極顯著高于泌乳后期奶牛，但生產(chǎn)單位牛奶的耗氧量(P=0.02)顯著低于泌乳后期奶牛。2個泌乳時期奶牛的氧氣消耗供給比(P=0.62)無顯著差異。

表4 泌乳盛期與泌乳后期奶牛的乳腺氧代謝相關(guān)指標(biāo)比較

2.5 泌乳盛期與泌乳后期奶牛乳中氨基酸含量比較

泌乳盛期與泌乳后期奶牛乳中氨基酸含量列于表5。與泌乳盛期奶牛相比，泌乳后期奶牛乳中蘇氨酸(Ser)含量(P<0.01)極顯著降低，其余氨基酸含量(P<0.01)均極顯著升高。

表5 泌乳盛期與泌乳后期奶牛乳中氨基酸含量比較

2.6 泌乳盛期與泌乳后期奶牛乳靜脈血漿中氨基酸含量比較

泌乳盛期與泌乳后期奶牛乳靜脈血漿中氨基酸含量列于表6。與泌乳盛期奶牛相比，泌乳后期奶牛乳靜脈血漿中天冬氨酸(Asp)(P<0.01)、脯氨酸(Pro)含量(P<0.01)極顯著降低，蘇氨酸(Thr)(P<0.01)、甘氨酸(Gly)(P<0.01)、蛋氨酸(Met)(P<0.01)、賴氨酸(Lys)(P<0.01)、組氨酸(His)(P<0.01)和精氨酸(Arg)含量(P<0.01)極顯著升高，谷氨酸(Glu)(P=0.04)、異亮氨酸(Ile)(P=0.02)、亮氨酸(Leu)(P=0.02)含量顯著升高，其他氨基酸含量(P>0.05)無顯著差異。

表6 泌乳盛期與泌乳后期奶牛乳靜脈血漿中氨基酸含量比較

續(xù)表6項目Items 泌乳盛期 Early-lactation (n=18)泌乳后期 Late-lactation (n=16)均值標(biāo)準(zhǔn)誤 SEMP值P-value苯丙氨酸 Phe4.243.990.170.30賴氨酸 Lys6.2911.620.69<0.01組氨酸 His9.9813.800.50<0.01精氨酸 Arg2.835.050.35<0.01脯氨酸 Pro5.764.390.27<0.01

2.7 泌乳盛期與泌乳后期奶牛尾動脈血漿中氨基酸含量比較

泌乳盛期與泌乳后期奶牛尾動脈血漿中氨基酸含量列于表7。與泌乳盛期奶牛相比，泌乳后期奶牛尾動脈血漿中Asp(P<0.01)、Gly(P<0.01)、丙氨酸(Ala)(P<0.01)、苯丙氨酸(Phe)(P<0.01)、Pro含量(P<0.01)極顯著降低，Met(P=0.04)、Lys(P=0.03)、His(P=0.02)含量顯著升高，Thr含量(P=0.10)具有升高的趨勢，其他氨基酸含量(P>0.05)無顯著差異。

表7 泌乳盛期與泌乳后期奶牛尾動脈血漿中氨基酸含量比較

2.8 泌乳盛期與泌乳后期奶牛乳靜脈血漿和乳中氧化應(yīng)激與抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的比較

泌乳盛期與泌乳后期奶牛乳靜脈血漿和乳中氧化應(yīng)激與抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)列于表8。與泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛乳靜脈血漿中ROS(P=0.09)、MDA含量(P=0.07)以及ORAC(P=0.07)具有提高的趨勢。泌乳盛期奶牛乳中MDA含量(P=0.01)極顯著高于泌乳后期奶牛。與泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛乳中ORAC(P=0.07)、GSH-Px(P=0.06)和SOD(P=0.07)活性具有提高的趨勢。

表8 泌乳盛期與泌乳后期奶牛乳靜脈血漿和乳中氧化應(yīng)激與抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的比較

2.9 泌乳盛期與泌乳后期奶牛尾動脈血常規(guī)指標(biāo)的比較

泌乳盛期與泌乳后期奶牛尾動脈血常規(guī)指標(biāo)列于表9。與泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛尾動脈血中血小板分布寬度(P<0.01)極顯著降低，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量(P=0.04)顯著降低，血小板平均體積(P=0.07)有降低的趨勢，中性粒細(xì)胞數(shù)量(P=0.07)有升高的趨勢，其余指標(biāo)(P>0.05)無顯著差異。

表9 泌乳盛期與泌乳后期奶牛尾動脈血常規(guī)指標(biāo)的比較

3 討 論

氧是哺乳動物生殖、發(fā)育等生命活動中的必要營養(yǎng)素，在機(jī)體生理代謝調(diào)控中起關(guān)鍵作用。作為哺乳動物重要的代謝器官，研究乳腺代謝穩(wěn)態(tài)和生理代謝如何受氧含量和供給的調(diào)控，具有重要生物學(xué)意義和應(yīng)用價值。目前，生命科學(xué)領(lǐng)域有關(guān)氧氣參與乳腺代謝和健康調(diào)控方面的研究主要聚焦于乳腺癌發(fā)生和發(fā)展，例如，乳腺癌細(xì)胞可通過提高膠原蛋白Ⅰ分泌加劇局部氧消耗，并通過HIF-1α-核因子-κB(NF-κB)信號通路介導(dǎo)細(xì)胞快速增殖[9]，另有研究發(fā)現(xiàn)，碳酸酐酶Ⅸ可通過加速乳腺癌細(xì)胞所在區(qū)域內(nèi)的氧氣消耗速率，誘發(fā)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制，最終加速乳腺癌細(xì)胞遷移進(jìn)程[10]。然而，乳腺氧供給與泌乳性能、乳成分之間的因果關(guān)系和調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。本研究中，泌乳盛期奶牛尾動脈和乳靜脈氧含量和生產(chǎn)單位牛奶的耗氧量均低于泌乳后期奶牛，提示泌乳盛期奶牛乳腺氧的總需求量較高，泌乳盛期奶?？赡芤环矫嫱ㄟ^提高血液流速另一方面通過提高氧氣的利用效率，來增加乳腺氧供給總量，從而滿足其泌乳代謝過程中對氧氣較高的需要量[11]。

Ruocco等[12]研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸可以降低氧化應(yīng)激水平，調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺氨基酸的清除效率是奶牛自身維持泌乳機(jī)制的部分原因，其還用來滿足細(xì)胞內(nèi)代謝的需要[13]，并且主要取決于乳腺上皮細(xì)胞數(shù)量及雙向轉(zhuǎn)運(yùn)活性，不受血液濃度和流量的影響[8]。本研究中，泌乳盛期奶牛乳與乳靜脈血漿中大多數(shù)氨基酸的含量均保持較低水平，提示泌乳盛期奶牛乳腺氨基酸的清除效率可能更高，總耗氧量較高的時期，代謝應(yīng)激發(fā)生的可能也較高。前人研究表明，乳腺Lys的攝取量取決于動脈血供應(yīng)量[14]，本研究中，泌乳后期奶牛乳、乳靜脈血漿中Lys含量較高，與尾動脈血漿中Lys含量較高的結(jié)果保持一致。

前人研究發(fā)現(xiàn)，血液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量在機(jī)體缺氧條件下顯著降低[12]，嗜酸性粒細(xì)胞是免疫反應(yīng)和過敏反應(yīng)過程中極為重要的細(xì)胞，在殺傷細(xì)菌和寄生蟲方面具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，對于血液氧分壓和氧含量均較低的泌乳盛期奶牛，其血液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量顯著低于血液氧分壓和氧含量均較高的泌乳盛期奶牛，提示不同泌乳時期奶牛血液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量可能受血液中氧含量的影響，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。中性粒細(xì)胞在動物血液非特異性細(xì)胞免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，由于它們獲得能量的方式是糖酵解，因此機(jī)體缺氧情況下仍能夠生存并發(fā)揮作用。同時，缺氧條件下的血液中性粒細(xì)胞降解速率顯著降低，以維持其參與機(jī)體免疫系統(tǒng)和代謝穩(wěn)態(tài)的功能[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，血液氧分壓和氧含量均較低的泌乳盛期奶牛血液中性粒細(xì)胞數(shù)量有高于泌乳后期奶牛的趨勢，提示奶牛血液中中性粒細(xì)胞數(shù)量可能受血液中氧含量的影響，需要進(jìn)一步研究其機(jī)制。血小板分布寬度和體積是反映哺乳動物血液中血小板比容變異的重要參數(shù)，當(dāng)哺乳動物機(jī)體處于缺氧狀態(tài)下時，血小板分布寬度和體積均會發(fā)生下降。本研究中，泌乳盛期奶牛血液中血小板分布寬度和體積比泌乳后期奶牛低，可能與其血液中氧含量較低有關(guān)。這些結(jié)果提示，血液中氧含量的變化可能是造成泌乳奶牛血常規(guī)指標(biāo)發(fā)生變化的原因。

我們進(jìn)一步分析了泌乳盛期和泌乳后期奶牛乳靜脈血漿和乳中氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)乳靜脈血漿和乳中的相關(guān)指標(biāo)變化趨勢一致，且泌乳盛期奶牛乳腺氧化應(yīng)激水平高于泌乳后期，而機(jī)體抗氧化能力低于泌乳后期。前人研究發(fā)現(xiàn)，組織氧耗量與自由基產(chǎn)生量呈正相關(guān)[8]。本研究中，雖然泌乳盛期奶牛生產(chǎn)單位牛奶的耗氧量低于泌乳后期奶牛，但其總耗氧量較高，在正常代謝條件下，哺乳動物細(xì)胞約有38%左右的氧氣被轉(zhuǎn)化為ROS[14]。因此，泌乳盛期奶牛較高的代謝應(yīng)激可能與該時期乳腺代謝中大量氧氣消耗有關(guān)。

4 結(jié) 論

與泌乳后期奶牛相比，泌乳盛期奶牛血液中氧分壓和氧含量較低，但乳腺氧消耗量較高，其乳腺氨基酸的清除率與攝取也隨總耗氧量的增加而提升。同時，與泌乳盛期奶牛相比，泌乳后期奶牛血常規(guī)和氧化應(yīng)激指標(biāo)均發(fā)生變化，結(jié)合泌乳盛期奶牛乳腺應(yīng)激強(qiáng)于泌乳后期奶牛的發(fā)現(xiàn)，本研究提示耗氧量調(diào)節(jié)可能是泌乳盛期奶牛代謝應(yīng)激調(diào)控的一種途徑。