王志成，蘇昶祺，陳仕毅，賈先波，王 杰，張 明

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川成都 611130）

2020 年我國肉牛屠宰2 920 萬頭，肉?？偖a(chǎn)值達(dá)到5 540 億元。母牛終生自然繁殖只能產(chǎn)生7～8 個(gè)后代，肉牛繁殖率低已經(jīng)成為制約我國肉牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。利用動(dòng)物繁殖生物技術(shù)使母牛進(jìn)行雙胎生產(chǎn)是提高母牛繁殖率的有效手段。

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）是指通過卵母細(xì)胞體外成熟（IVM）、體外受精、經(jīng)過早期胚胎發(fā)育獲得體外胚胎，并將胚胎移植到受體體內(nèi)的過程。近年來，通過IVF-ET 方案可以獲得50%的妊娠率，有利于改善肉牛繁殖率，加速肉牛遺傳改良，該方案在北美洲肉牛生產(chǎn)中受到歡迎。隨著尼羅牛、瘤牛等肉牛品種卵母細(xì)胞品質(zhì)提高以及體外受精胚胎（IVP）全產(chǎn)業(yè)鏈的完善，在南美洲IVF-ET 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。日本采用胚胎分割或者囊胚分離技術(shù)分裂IVF 胚胎，生產(chǎn)同卵雙胚，應(yīng)用于日本和牛雙胎生產(chǎn)，雙犢率可達(dá)到20%。另外，胚胎冷凍和性控精液技術(shù)的不斷優(yōu)化和發(fā)展推動(dòng)了IVF-ET 技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用進(jìn)程，提高了肉牛生產(chǎn)效益，但其穩(wěn)定性差、操作難度大、產(chǎn)業(yè)鏈不健全是限制IVF-ET 技術(shù)在我國產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的重要原因。本文對國內(nèi)外IVF-ET 操作及雙胎生產(chǎn)進(jìn)行技術(shù)總結(jié)，對該技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用研究進(jìn)展和存在問題進(jìn)行概述與分析，旨在為該技術(shù)在我國的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 IVF 胚胎生產(chǎn)過程與現(xiàn)狀

1.1 卵母細(xì)胞收集 近年來，活體采卵-體外受精（OPU-IVF）技術(shù)在我國產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中得到進(jìn)一步優(yōu)化，綜合繁殖生物技術(shù)的應(yīng)用使規(guī)?；龅姆敝吵苫盥侍岣?%，OPU 技術(shù)成為母牛活體獲得高質(zhì)量卵母細(xì)胞的重要途徑。OPU 技術(shù)可以每周重復(fù)采卵2 次，甚至可從幼年母?；蛘呷焉? 個(gè)月內(nèi)的母牛卵巢上采集品質(zhì)較好的卵母細(xì)胞，不影響母牛卵泡波形成和繁殖水平。Trans Ova Genetics 和L'Alliance Boviteq 公司把OPU技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用于優(yōu)良母牛的快速繁殖，但生產(chǎn)成本高、妊娠率相對較低等制約了該技術(shù)在我國肉牛產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。同時(shí)OPU 獲得的85%以上卵母細(xì)胞處于凋亡閉鎖過程，卵母細(xì)胞品質(zhì)難以保證。隨著我國肉牛集約化屠宰水平的提高，在屠宰場規(guī)模化收集卵巢處理后，可獲得較多卵母細(xì)胞。屠宰母牛通常繁殖機(jī)能低，自然情況下獲取有腔卵泡中卵母細(xì)胞的數(shù)量少、質(zhì)量低。因此，屠宰前對母牛進(jìn)行超排處理是提高卵母細(xì)胞品質(zhì)重要的發(fā)展方向。目前，屠宰場收集卵母細(xì)胞仍是最便捷、廉價(jià)的牛卵母細(xì)胞收集方式，同時(shí)OPU 技術(shù)是未來獲得高質(zhì)量卵母細(xì)胞的重要發(fā)展方向。

1.2 卵母細(xì)胞IVM 培養(yǎng)及優(yōu)化 OPU 和屠宰廠獲得的卵母細(xì)胞絕大多數(shù)為未成熟卵母細(xì)胞，需在體外培養(yǎng)20～26 h 才能發(fā)育至成熟卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞IVM 與體內(nèi)成熟相比，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、染色體和紡錘體等結(jié)構(gòu)和功能可能出現(xiàn)異常?；钚匝蹩赡軗p傷細(xì)胞核DNA 和細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，使胚胎發(fā)育能力下降。添加外源性激素、抗氧化物或者與卵丘細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和裸卵建立共培養(yǎng)體系是提高卵母細(xì)胞成熟率，改善胚胎品質(zhì)的重要方式（表1）。

表1 不同添加物對牛COCs 體外成熟培養(yǎng)液優(yōu)化效果

隨著研究不斷深入，不同的方案應(yīng)用于卵母細(xì)胞IVM 以改善卵母細(xì)胞成熟率，促進(jìn)IVF-ET 技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。采卵前超數(shù)排卵后再進(jìn)行卵母細(xì)胞體外受精發(fā)育，囊胚率可到70% 以上，推測卵母細(xì)胞成熟率達(dá)到80% 以 上。Li 等、Albuz 等在IVM 之前用減數(shù)分裂抑制劑進(jìn)行預(yù)處理（SPOM 方案），卵母細(xì)胞成熟率可達(dá)到80%～90%。有研究表明，減數(shù)分裂抑制劑的應(yīng)用也有助于95～115 μm 較小卵子母源mRNA和蛋白質(zhì)積累，進(jìn)一步促進(jìn)胞質(zhì)成熟，提高體外胚胎品質(zhì)。新型的SMM（轉(zhuǎn)運(yùn)與成熟培養(yǎng)基）培養(yǎng)效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)TCM199 培養(yǎng)基。由于SMM 不需要5% CO，因此應(yīng)用于商業(yè)生產(chǎn)更加方便。如果以達(dá)到MII 期評估有腔卵泡中卵母細(xì)胞成熟率，牛卵母細(xì)胞IVM 體系已經(jīng)非常成熟，但要改善卵母細(xì)胞IVM 后早期胚胎發(fā)育，仍有大量的工作需要開展。另外，卵巢上大量無腔卵泡卵母細(xì)胞資源仍然無法利用,無腔卵泡中卵母細(xì)胞的研究將顯著提高可利用卵母細(xì)胞數(shù)目。因此，建立無腔卵泡中卵母細(xì)胞高效收集利用方法將提高胚胎生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1.3 受精效率 IVM 后的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移入TALP 液，與獲能精子進(jìn)行精卵孵育，受精率可達(dá)70%～85%。精子品質(zhì)是制約體外受精的重要的因素，添加Ca、HCO和肝素可以顯著提高精子獲能率和受精效果。Swim-up 或Percoll 方法處理精子常被用來改善精子活力和質(zhì)量。透明帶打孔技術(shù)（PZD）、透明帶下注射技術(shù)（SUZI）和單精子胞漿內(nèi)注射（ICSI）以及微流控技術(shù)的發(fā)展有效提高了單精子、弱精子穿越透明帶的能力，促進(jìn)精卵融合和胚胎發(fā)育。

另外，性控精液技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用也將進(jìn)一步提高家畜的繁殖效率。流式細(xì)胞分選方法進(jìn)行精子性控是生產(chǎn)指定性別胚胎，改善胚胎品質(zhì)的重要手段。與傳統(tǒng)的性控凍精方法相比，精子分選技術(shù)可實(shí)現(xiàn)精子凍-解、分選和二次凍-解過程，很好地解決凍精到分選地的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸問題，該技術(shù)的應(yīng)用有效推動(dòng)了性控凍精的商業(yè)化應(yīng)用。

ICSI 能夠?qū)崿F(xiàn)性控精子進(jìn)入卵母細(xì)胞，生產(chǎn)指定性別胚胎，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于良種繁育或性控精液體外受精。除此之外，IVF 和人工授精（AI）技術(shù)也常用于指定性別胚胎生產(chǎn)（表2）。采用IVF 方式進(jìn)行指定性別胚胎生產(chǎn)的穩(wěn)定性差，可能與卵母細(xì)胞品質(zhì)和精卵孵育環(huán)境差異有關(guān)。通過ICSI 或者AI 技術(shù)生產(chǎn)指定性別胚胎，進(jìn)行同性別雙犢生產(chǎn)，可有效避免自由馬丁現(xiàn)象，對提高肉?；蚰膛７敝承示哂兄匾饬x（圖1）。

圖1 利用XY 精子分選技術(shù)進(jìn)行IVFET 和AI+ET 雙胎生產(chǎn)技術(shù)流程

表2 ICSI、IVF 和AI 技術(shù)進(jìn)行指定性別牛生產(chǎn)情況

自2005 年精子分選技術(shù)發(fā)展以來，南美洲奶牛體外胚胎生產(chǎn)數(shù)量超過肉牛。Pontes 等進(jìn)行OPU-性別控制胚胎商業(yè)化生產(chǎn)跨長距離運(yùn)輸進(jìn)行移植，妊娠率可達(dá)36%～40%。目前，采用性控精液技術(shù)可實(shí)現(xiàn)90%的指定性別胚胎生產(chǎn)，滿足母牛繁育、公牛屠宰的市場需求，增加每枚胚胎的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但利用性控精子進(jìn)行胚胎生產(chǎn)的操作難度大、生產(chǎn)成本高、穩(wěn)定性差。隨著技術(shù)發(fā)展，性控精子仍是增加母?？煽睾蟠匾纳锛夹g(shù)手段，該技術(shù)應(yīng)用于IVF 和AI 實(shí)踐生產(chǎn)將顯著改善經(jīng)濟(jì)效益。

1.4 早期胚胎培養(yǎng) 牛早期胚胎發(fā)育至8～16 細(xì)胞期會(huì)出現(xiàn)發(fā)育阻滯現(xiàn)象，合子從輸卵管向子宮移動(dòng)的過程中，所處環(huán)境不斷發(fā)生變化。在與受精卵體外共培養(yǎng)的過程中，輸卵管上皮細(xì)胞正在去分化并且基因組表達(dá)譜不斷變化。體外受精胚胎抗凍性、超微結(jié)構(gòu)（微絨毛和脂滴數(shù)量）、基因表達(dá)和染色體結(jié)構(gòu)與體內(nèi)來源胚胎存在較大差異。因此，IVF 胚胎發(fā)育能力、母牛的妊娠率及產(chǎn)犢率相對較低。

外源性添加生長因子和細(xì)胞因子或者與體細(xì)胞共培養(yǎng)模擬輸卵管液，能夠克服發(fā)育阻滯，改善早期胚胎發(fā)育（表3）。胎牛血清（FBS）中包含多種細(xì)胞自身維持和增殖所需的物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于卵母細(xì)胞IVF 和早期胚胎培養(yǎng)過程中。但是FBS 的使用可能增加疫病傳播和大胎綜合征的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致胚胎抗凍性下降。Hamdi 等將低濃度輸卵管液和子宮液與合子共培養(yǎng)后，囊胚率提高30% 以上，抗氧化能力增強(qiáng)。因此，低濃度輸卵管液和子宮液共培養(yǎng)方案可能提供一種無血清培養(yǎng)替代方案。

表3 不同添加物對牛體外早期胚胎培養(yǎng)液優(yōu)化效果

目前常用的胚胎培養(yǎng)方案有一步培養(yǎng)法和兩步培養(yǎng)法，一步培養(yǎng)法內(nèi)源性生長因子積累多、環(huán)境應(yīng)激小。兩步培養(yǎng)法毒性物質(zhì)積累少，可以及時(shí)添加細(xì)胞生長所需物質(zhì)，但相應(yīng)生產(chǎn)成本也會(huì)上升。下一代的胚胎培養(yǎng)可能會(huì)集中探索微流控技術(shù)在胚胎培養(yǎng)上的應(yīng)用，采用該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可以實(shí)時(shí)添加胚胎發(fā)育所需物質(zhì)，避免細(xì)胞的pH 和溫度變化，減少毒性物質(zhì)積累。探索新方法改善IVP 胚胎的發(fā)育潛力是未來將IVF-ET技術(shù)應(yīng)用產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要研究方向。

1.5 胚胎冷凍保存 囊胚形成后可以進(jìn)行新鮮胚胎移植，需要同期化處理使受體母牛同時(shí)達(dá)到受孕狀態(tài)。采用胚胎冷凍保存可有效提高生產(chǎn)效率，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離胚胎運(yùn)輸和適時(shí)移植，減少疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)。

玻璃化冷凍胚胎解凍后存活率和移植成活率較高，不需要特殊設(shè)備就可實(shí)現(xiàn)。但玻璃化冷凍胚胎需要經(jīng)過解凍、復(fù)蘇和脫抗凍劑后才能移植，而且需要操作者具備長期的經(jīng)驗(yàn)積累才能熟練完成。因此，該方法應(yīng)用胚胎商業(yè)化具有局限性。

程序化冷凍又稱為慢速冷凍，是細(xì)胞外水結(jié)晶，產(chǎn)生滲透梯度，胞質(zhì)脫水濃縮過程。程序化冷凍成功的關(guān)鍵在于平衡水結(jié)晶和細(xì)胞脫水時(shí)間，避免冰晶形成破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)。程序化冷凍法冰晶形成會(huì)損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)且需要專門儀器，但是使用較小濃度抗凍劑對細(xì)胞毒性小、而且可以直接移植，適合規(guī)模化胚胎生產(chǎn)使用。最近，Sanches 等研究表明將性控胚胎采用程序化冷凍進(jìn)行胚胎移植可以達(dá)到與玻璃化冷凍相同的妊娠效果。在冷凍過程中添加犢牛血清（FCS）脂溶性物質(zhì)降低胚胎中脂含量以提高胚胎的抗凍性。牛血清采集成本較高，同時(shí)可能對胚胎細(xì)胞造成不可逆的損害。因此，無血清抗凍保護(hù)液開發(fā)是商業(yè)化生產(chǎn)的主要方向。

當(dāng)前，冷凍液中添加1.5 mol/L 乙二醇配合蔗糖在胚胎冷凍中廣泛使用，用1.5 mol/L 甘油配合0.25 mol/L蔗糖做冷凍液來進(jìn)行直接移植可獲得良好的效果。有研究表明，程序化冷凍囊胚、玻璃化冷凍桑葚胚胎可能獲得較好的生產(chǎn)效果。為滿足胚胎解凍后直接移植進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，程序化冷凍是適應(yīng)生產(chǎn)實(shí)踐的冷凍胚胎方法，但是冷凍液中添加促進(jìn)冷凍胚胎著床和發(fā)育的物質(zhì)，增加凍胚存活率和著床率仍然有很大提升空間。

2 IVF-ET 技術(shù)應(yīng)用于牛雙犢生產(chǎn)現(xiàn)狀

近年來全球體外生產(chǎn)胚胎數(shù)量呈上升趨勢，特別是在美洲和歐洲地區(qū)（圖2）。經(jīng)過近50 年的不斷探索，IVF 技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐囊胚率為30%～40%。因此，IVF 胚胎商業(yè)化應(yīng)用仍需進(jìn)一步提高胚胎品質(zhì)。目前，我國肉牛胚胎工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)化還處于起步階段，存在實(shí)踐水平低、生產(chǎn)規(guī)模小、商業(yè)化運(yùn)行機(jī)制不健全等短板，但整體市場需求和發(fā)展?jié)摿薮?。采用IVF-ET 技術(shù)進(jìn)行雙胎產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)將提高能繁母牛的經(jīng)濟(jì)效益，進(jìn)一步滿足市場對肉牛需求。

圖2 2013—2018 年全球收集胚胎和胚胎移植數(shù)量變化趨勢

當(dāng)前，雙胎生產(chǎn)可使肉牛生產(chǎn)效益增加20%～25%。誘導(dǎo)雙胎、ET 和AI-ET 技術(shù)等繁殖生物技術(shù)是生產(chǎn)雙胎的有效手段（表4）。誘導(dǎo)雙胎技術(shù)易于操作，不需要昂貴的設(shè)施，但易受個(gè)體和環(huán)境因素影響，整體雙胎生產(chǎn)效果不佳。母牛AI 后子宮進(jìn)入妊娠環(huán)境，再進(jìn)行ET 可以獲得較好的雙胎生產(chǎn)效果，該技術(shù)也是解決母牛重復(fù)配種未孕的重要手段。2001 年，愛爾蘭Ovamass Ltd 公司報(bào)道將AI+ET 技術(shù)應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)中雙犢率可達(dá)34%。但該技術(shù)難度大，難以應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。目前，胚胎來源主要分為體內(nèi)來源和體外受精2 種方式（圖3），綜合生產(chǎn)成本和移植后的妊娠率考量，IVF-ET 技術(shù)作為高效廉價(jià)的雙犢生產(chǎn)策略應(yīng)用于肉牛生產(chǎn)將提高母牛繁殖率，犢牛生產(chǎn)的新增加收益達(dá)到4 500～5 500 元/頭。另外，同期化方案在國內(nèi)外的規(guī)模化肉牛養(yǎng)殖場應(yīng)用廣泛，研究表明同期化處理會(huì)誘導(dǎo)母牛生產(chǎn)雙胎，也將提高胚胎數(shù)量以及移植成功率。若結(jié)合同期發(fā)情進(jìn)行批次化雙胎生產(chǎn)，可以顯著提高生產(chǎn)效率。

表4 誘導(dǎo)雙犢、IVF-ET 和AI-ET 技術(shù)應(yīng)用于肉牛雙胎的妊娠率和雙犢率

圖3 IVD/IVF 胚胎生產(chǎn)過程

能繁母牛雙胎生產(chǎn)也存在著較多需要解決的問題，動(dòng)物自身及環(huán)境等多種因素可能都會(huì)影響母牛超數(shù)排卵效果，激素水平和移植位置也有可能影響肉牛雙胎生產(chǎn)。另外，根據(jù)美國MARC 相關(guān)數(shù)據(jù)，奶牛雙胎造成的產(chǎn)科問題嚴(yán)重影響奶牛的生產(chǎn)性能。每年奶牛雙胎對美國奶牛產(chǎn)業(yè)造成大約9 600 萬美元的損失。因此，雙胎生產(chǎn)技術(shù)應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，應(yīng)當(dāng)權(quán)衡經(jīng)濟(jì)效益。在自然資源相對不足國家，利用胚胎移植進(jìn)行肉牛雙犢生產(chǎn)仍是未來提高牛肉產(chǎn)量重要的生產(chǎn)手段。

3 展望

IVF-ET 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于肉牛品種改良和良種繁育。該技術(shù)應(yīng)用于肉牛雙胎規(guī)?；a(chǎn)，將會(huì)提高母牛繁殖效率，加快肉牛規(guī)?；B(yǎng)殖的步伐，提高肉牛養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。IVF 技術(shù)在我國肉牛產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中取得較快發(fā)展，但我國IVF-ET 技術(shù)應(yīng)用于商業(yè)化雙胎存在生產(chǎn)成本較高、配套產(chǎn)品不足以滿足大規(guī)模IVF 胚胎生產(chǎn)等問題，且能勝任胚胎標(biāo)準(zhǔn)操作的技術(shù)人員少，存在成本與收益問題尚需進(jìn)一步通過優(yōu)化方案來解決。但I(xiàn)VFET 技術(shù)仍然是目前最可行、最現(xiàn)實(shí)和最有發(fā)展前景的肉牛雙胎生產(chǎn)技術(shù)。