費(fèi)曉娟，金美林，李桃桃，盧曾奎，王慧華，陸 建，權(quán) 凱，王玉琴，狄 冉*，魏彩虹*（.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 009；.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 7000；.全國(guó)畜牧總站，北京 009；.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南鄭州 006；.河南科技大學(xué)，河南洛陽(yáng) 7000）

綿羊尾部脂肪沿尾椎沉積的程度和沉積的外形促使綿羊形成了不同的尾型。根據(jù)這一特性將綿羊分為短瘦尾羊、長(zhǎng)瘦尾羊、短脂尾羊、長(zhǎng)脂尾羊和脂臀尾羊。在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)綿羊尾部沉積大量的脂肪不利于配種；同時(shí)脂肪沉積消耗大量的飼料，從而降低飼料轉(zhuǎn)化率。此外，機(jī)體內(nèi)沉積大量的脂肪會(huì)影響肉質(zhì)。因此，探究綿羊尾部脂肪沉積的機(jī)制對(duì)提高生產(chǎn)效率具有重要意義。miRNA 最早在秀麗隱桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)度為22 nt，物種間保守性較高。miRNA 的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，首先在細(xì)胞核中生成，然后在細(xì)胞質(zhì)中深加工形成成熟的miRNA，從而調(diào)控mRNA 基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯等。研究表明miRNA 在脂肪生成和脂肪代謝中有重要的調(diào)控作用。在個(gè)體水平，miR-222 在肥胖小鼠模型中通過抑制的表達(dá)促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生。在3T3-L1 前體脂肪細(xì)胞中miR-425 通過靶向調(diào)控促進(jìn)成脂分化的發(fā)生。在牛的前體脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-224 和miR-376a 分別靶向調(diào)控和，抑制細(xì)胞分化。

本研究通過對(duì)湖羊和藏羊的尾部脂肪組織進(jìn)行高通量測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)miR-61 差異表達(dá)，推測(cè)miR-61 在綿羊尾部脂肪沉積過程中發(fā)揮著重要作用，但其具體通過哪些靶基因參與調(diào)控尚不明確。因此，本研究對(duì)miR-61 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（Transcription Factor Binding Site，TFBS）和靶基因預(yù)測(cè)，同時(shí)對(duì)靶基因進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信號(hào)通路富集分析，初步掌握miR-61 可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和其靶基因發(fā)揮作用的信號(hào)通路。同時(shí)驗(yàn)證了miR-61 和之間的靶向關(guān)系，并對(duì)miR-61 和靶基因在綿羊尾部脂肪組織中的表達(dá)進(jìn)行RT-qPCR 和Western Blot 分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品信息 從甘肅永登采取3 只湖羊的尾部脂肪組織，從青海玉樹采取3 只藏羊的尾部脂肪組織，湖羊和藏羊均是1.5 歲的公羊。將綿羊屠宰之后分離尾部脂肪組織，用無(wú)酶水清理后置于液氮中速凍，并于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和儀器 動(dòng)物組織/細(xì)胞昆蟲總RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京金百特生物技術(shù)有限公司；miRNA一步法cDNA 合成試劑盒（miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop））、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Hi Script III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper））、miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。采用Light Cycler480 II 型熒光定量PCR 儀進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證。、D6492-02 Cycle Pure Kit、限制性內(nèi)切酶和、Site-Directed DNA Mutagenesis System、Dual-Luciferase Reporter Assay System 試劑盒均購(gòu)自北京信諾金達(dá)生物科技有限公司?？贵w購(gòu)自北京百諾威生物科技有限公司，PAGE 凝膠制備試劑盒（7.5%）購(gòu)自北京源暢致和生物科技有限公司。PIPA 裂解液Beyotime（碧云天）和BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天）均購(gòu)自北京德益恒達(dá)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析 通過高通量測(cè)序預(yù)測(cè)到miR-61 的前體序列，取其上游2 000 bp 序列利用Promoter Scan（https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）和Alibaba2.1（http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html）在線軟件對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)做轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)。

1.2.2 miR-61 靶基因預(yù)測(cè)及靶基因集合獲得 使用RNAhybrid和miRanda2 種計(jì)算方法預(yù)測(cè)miR-61的靶基因，取兩者預(yù)測(cè)結(jié)果的交集共同組成miR-61 的靶基因集合。

1.2.3 靶基因KEGG 信號(hào)通路富集分析 選擇DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中的KEGG Pathway 對(duì)miR-61 的靶基因集合進(jìn)行基于KEGG 的信號(hào)通路富集分析，采用Fisher Exact Test 算法計(jì)算值，當(dāng)<0.05 時(shí)，認(rèn)為基因集合相對(duì)于背景富集得到的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建 使用擴(kuò)增靶基因PIK3R5 的3'UTR，引物詳見表1。PCR 擴(kuò)增體系50 μL：2×Buffer 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，DNA 2 μL，DNA Polymerase 1 μL，ddHO 9 μL，上 下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性20 s，60℃退火10 s，72℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)償延伸7 min。對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行回收。回收產(chǎn)物與psiCHECK2 載體連接，挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR 檢測(cè)，并將陽(yáng)性樣本交至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證，最終構(gòu)建野生型質(zhì)粒。然后使用site-directed mutation 方法構(gòu)建PIK3R5 突變型質(zhì)粒。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)共轉(zhuǎn)染驗(yàn)證靶標(biāo)關(guān)系 以含10% 胎牛血清、1% 雙抗的DMEM 為培養(yǎng) 基，在37 ℃、5% 的CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T 細(xì)胞。分4 組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：mimics+WT、mimics+MT NC+psiCHECK2、mimics+psiCHECK2。轉(zhuǎn)染用 量參照Lipofectamine 2000 Reagent 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞的熒光活性。

1.2.6 總RNA 提取和cDNA 合成 使用動(dòng)物組織/ 細(xì)胞昆蟲總RNA 提取試劑盒提取綿羊尾部脂肪組織總RNA。按照miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit（by stem-loop）試劑盒說(shuō)明書，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)總體系是20 μL：第1 步反應(yīng)為5× gDNA Wiper Mix 2 μL，Total RNA 1.3 μL，Rnase Free HO 6.7 μL，42℃2 min；第2 步反應(yīng)：上一步混合液10 μL，Stem-loop primer 1 μL，10×RT Mix 2 μL，HiScript II Enzyme Mix 2 μL，Rnase Free HO 5 μL，25℃ 5 min，50℃ 15 min，85 ℃ 5 min。用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系是20 μL：第1 步反應(yīng)5×gDNA Wiper Mix 2 μL，Total RNA 1.3 μL，Rnase Free HO 6.7 μL，42℃ 2 min；第2步反應(yīng)：上一步混合液10 μL，10×RT Mix 2 μL，HiScript III Enzyme Mix 2 μL，Oligo（dT）20VN 1 μL，Random hexamers 1 μL，Rnase Free HO 4 μL，37℃ 15 min，85℃5 s。反應(yīng)結(jié)束后，所得cDNA 均置于-20℃保存。

1.2.7 RT-qPCR 反應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)采用RT-qPCR 檢測(cè)miR-61、和等基因的相對(duì)表達(dá)量。miR-61 的反應(yīng)體系（20 μL）：2×miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA（6.25 ng/μL）2 μL，ddHO 7.2 μL?；虻姆磻?yīng)體系（20 μL）：2×Taq Pro Universal SYBR qPCR master Mix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddHO 7.2 μL。反應(yīng)條件均是：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增結(jié)束后分析熔解曲線。每個(gè)樣本進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.8 Western Blot 使用RIPA 裂解液獲得綿羊尾部脂肪中的總蛋白，經(jīng)BCA 法測(cè)得蛋白濃度后將其稀釋為同一濃度。使用SDS-PAGE 分離蛋白，將相應(yīng)蛋白條帶轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。然后進(jìn)行封閉、抗體孵化，最后利用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行ECL 顯影拍照。

1.2.9 引物設(shè)計(jì)與合成 參考高通量測(cè)序獲得的miR-61成熟序列，設(shè)計(jì)特異反轉(zhuǎn)錄引物和RT-qPCR 上游引物，下游引物使用mQ Primer R 通用引物，以5S 為內(nèi)參基因。從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所需的基因及內(nèi)參-的mRNA 序列，采用Premier 5.0 和SnapGene 軟件設(shè)計(jì)引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物詳細(xì)信息見表1。

表1 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 整理，采用2法計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)量；使用ImageJ 進(jìn)行灰度分析。所得數(shù)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（X±SE）表示；所有數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，*表示差異顯著（<0.05），**表示差異極顯著（<0.01）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 本研究使用在線程序?qū)d羊miR-61 前體的上游2 000 bp 區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)有轉(zhuǎn)錄因子等多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。其中和等轉(zhuǎn)錄因子與脂肪生成相關(guān)。

2.2 靶基因預(yù)測(cè) 使用RNAhybrid 和miRanda 2 種預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-61 的靶基因，共得到2 796 對(duì)靶向關(guān)系。結(jié)果顯示，可能是miR-61 靶基因，miR-61 與的3'UTR 序列的結(jié)合位點(diǎn)如圖1 所示。將預(yù)測(cè)得到的靶基因作為KEGG Pathway 富集分析的基因集合。

圖1 miR-61 與PIK3R5 的靶位點(diǎn)示意圖

2.3 KEGG 富集分析 通過DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https://david.abcc.ncifcrf.gov/）對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)得到的靶基因能夠顯著富集與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的EMC-Receptor interaction、Focal Adhesion、Vascular Smooth muscle Contraction 和Axon Guidance信號(hào)通路，與疾病相關(guān)的Human Papillomavirus Infection和Pathways in Cancer 信號(hào)通路，與脂肪代謝相關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路PI3K-Akt Single Pathway，以及與激素代謝相關(guān)的Oxytocin Signal Pathway 等8 條信號(hào)通路（圖2）。表2 是對(duì)KEGG 富集通路中主要靶基因的統(tǒng)計(jì)。

圖2 miR-61 靶基因集合KEGG 通路富集分析

表2 KEGG 富集通路中主要的靶基因

2.4 PIK3R5 質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 使用載體通用引物（表1）對(duì)PIK3R5 的野生型psiCHECK2 載體菌液首先進(jìn)行PCR 鑒定（圖3），然后進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，測(cè)序得到的結(jié)果和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中PIK3R5（XM_042255656）的序列一致（圖4 和圖5）。最后將構(gòu)建成功的PIK3R5 野生型psiCHECK2 質(zhì)粒使用Site-Directed Mutation 方法進(jìn)行定點(diǎn)突變構(gòu)成PIK3R5 突變型psiCHECK2 質(zhì)粒。

圖3 PIK3R5 的野生型psiCHECK2 載體菌液PCR 鑒定結(jié)果

圖4 PIK3R5 的野生型psiCHECK2 質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

圖5 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中PIK3R5 的3'UTR 部分序列

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因 按照mimics+WT、mimics+MT NC+psiCHECK2、mimics+psiCHECK2 分組在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染之后分別檢測(cè)各組的熒光活性值。結(jié)果表明，mimic+WT 組質(zhì)粒的熒光活性均極顯著低于mimic+MT、NC+psiCHECK2 和mimic+psiCHECK2 組的活性。由此說(shuō)明miR-61 和PIK3R5 3'UTR 存在靶向關(guān)系（圖6）。

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果

2.6 RT-qPCR 結(jié)果分析 為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究以5S 為內(nèi)參，使用RT-qPCR 方法檢測(cè)綿羊尾部脂肪組織中miR-61 的mRNA 表達(dá)量。結(jié)果顯示，miR-61 在湖羊尾部脂肪組織中的表達(dá)高于藏羊尾部脂肪組織中的表達(dá)，且差異顯著（圖7）。此結(jié)果與高通量測(cè)序結(jié)果一致。同時(shí)，以-為內(nèi)參，對(duì)靶基因的mRNA 表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，靶基因在藏羊尾部脂肪組織中的表達(dá)顯著高于湖羊尾部脂肪組織中的表達(dá)（圖7）。

圖7 miR-61 和PIK3R5 在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)結(jié)果

2.7 Western Blot 結(jié)果分析 本研究以alpha Tubulin 為內(nèi)參，在蛋白水平對(duì)靶基因PIK3R5 在湖羊和藏羊的尾部脂肪組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。Western Blot 結(jié)果顯示，湖羊中PIK3R5 的表達(dá)高于藏羊中PIK3R5 的表達(dá)，且差異極顯著（圖8）。

圖8 PIK3R5 的Western Blot 結(jié)果

3 討論

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的miRNA 被預(yù)測(cè)并鑒定出來(lái)，但是仍有很大部分的miRNA 功能尚不明確。miRNA 在機(jī)體活動(dòng)中起著重要作用，包括生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、疾病發(fā)生以及器官形成等。miRNA 與mRNA 之間是多對(duì)一的靶向關(guān)系，一個(gè)miRNA 可以靶向調(diào)控多個(gè)mRNA，同一個(gè)mRNA 可以被多個(gè)miRNA調(diào)控，多個(gè)基因構(gòu)成一個(gè)功能性的相互作用途徑，從而調(diào)控機(jī)體的生命活動(dòng)。為了降低實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性、提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，本研究使用RNAhybrid 和miRanda 2種軟件預(yù)測(cè)miR-61 的靶基因，共獲得2 796 對(duì)靶向關(guān)系，是miR-61 的靶基因之一，并顯著富集在PI3KAkt 信號(hào)通路。糖尿病是由機(jī)體內(nèi)脂代謝紊亂引起的一種疾病，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示在II 型糖尿病患者的腹部皮下脂肪中表達(dá)高。Luo 等人通過對(duì)健康妊娠母體胎盤和糖尿病妊娠母體的胎盤做比較發(fā)現(xiàn)，在糖尿病妊娠母體胎盤中表達(dá)高。在大鼠的飼料中添加兒茶素后發(fā)現(xiàn)，大鼠的腸上皮細(xì)胞中等與脂肪代謝相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，從而調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞對(duì)脂肪的代謝和消化吸收。以上研究均說(shuō)明在脂代謝過程中有重要作用，因此筆者推測(cè)在綿羊尾部脂肪沉積的過程中同樣有重要作用。

對(duì)miR-61 的靶基因進(jìn)行KEGG Pathway 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-61 的靶基因顯著富集在Oxytocin Single Pathway、Human Papillomavirus Infection、PI3K-Akt、Axon Guidance、ECM-Receptor Interaction、Focal Adhesion、Pathways in Cancer 和Vascular Smooth Muscle Contraction等8 個(gè)信號(hào)通路。大量研究表明，PI3K-Akt 信號(hào)通路在脂肪代謝中起著關(guān)鍵作用。在人的大腿、腹部和乳房皮下脂肪干細(xì)胞中通過PI3K-Akt 信號(hào)通路促進(jìn)人源脂肪干細(xì)胞的增殖和分化。在人的卵巢癌細(xì)胞中，通過PI3K-Akt 信號(hào)通路使和的表達(dá)上調(diào)，從而上調(diào)脂肪生成酶FASN 的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)脂肪酸合成。在3T3-L1 細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 信號(hào)通路同樣有重要作用。miR-139-5p 通過PI3K-Akt 信號(hào)通路介導(dǎo)靶向調(diào)控和，從而抑制3T3-L1 細(xì)胞分化。Cai 等人發(fā)現(xiàn)lnc-ORA 通過調(diào)控PI3K-Akt 信號(hào)通路抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞的增殖和分化。在以小鼠為模型的非酒精性脂肪肝研究中發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 信號(hào)通路同樣發(fā)揮著重要作用。一些藥物例如拉魯肽、葛根素和喜樹堿等通過PI3K-Akt 信號(hào)通路抑制小鼠肝臟內(nèi)脂肪的積累。此外，通過建立Ad36 感染的大鼠模型和Ad36 誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞體外模型，發(fā)現(xiàn)Ad36 可通過影響PI3K-Akt 信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)脂肪酸和甘油三酯的合成。由此推測(cè)，PI3K-Akt 信號(hào)通路可能在綿羊尾部脂肪沉積過程中有重要的作用。

本研究還富集到了細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用（EMC-Receptor Interaction）信號(hào)通路。細(xì)胞外基質(zhì)的成分包括結(jié)構(gòu)蛋白（膠原蛋白）和各種粘附蛋白。EMC-Receptor Interaction 信號(hào)通路在發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。1963年首次報(bào)道了在大鼠白色脂肪組織中觀察到被膠原纖維網(wǎng)絡(luò)包裹外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，1984 年發(fā)現(xiàn)在幼鼠脂肪器官發(fā)育過程中脂肪細(xì)胞和毛細(xì)血管周圍富含膠原纖維的細(xì)胞外基質(zhì)，后續(xù)又發(fā)現(xiàn)在人的脂肪細(xì)胞周圍存在IV 型膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。在3T3-L1 細(xì)胞中分化的研究中發(fā)現(xiàn)V 型和VI 型膠原蛋白在細(xì)胞分化的第4 天表達(dá)最高。深入研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)成分主要在脂肪細(xì)胞分化的早期和中期釋放，隨后脂肪因子的分泌增加，從而影響細(xì)胞內(nèi)脂滴的積累。San 等人的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用可能影響肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的分化、脂質(zhì)的合成和代謝，從而改變細(xì)胞外基質(zhì)的含量，進(jìn)而影響肉雞的品質(zhì)和風(fēng)味。因此推測(cè)EMC-Receptor Interaction 信號(hào)通路在綿羊尾部脂肪代謝過程中有重要作用。

miRNA 在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，通常是與mRNA 的3'UTR 結(jié)合抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯，從而調(diào)控機(jī)體的生命活動(dòng)。研究證實(shí)miR-331-3p 靶向調(diào)控抑制萊蕪豬背部和頸部前體脂肪細(xì)胞的分化和增殖。在豬的肌內(nèi)脂肪中發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p 通過靶向調(diào)控抑制和、miRNA-29b/29c通過Akt/PKA/MAPK 信號(hào)通路靶向調(diào)控，促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞增殖，抑制前體脂肪細(xì)胞分化。Xu 等人發(fā)現(xiàn)在延邊牛的前體脂肪細(xì)胞分化過程中miRNA-1271 靶向調(diào)控促進(jìn)這一過程的發(fā)生。在小鼠3T3-L1 中發(fā)現(xiàn)miR-182 通過靶向調(diào)節(jié)、miR-124-3p 靶向調(diào)節(jié)、miR-125b 靶向調(diào)節(jié)和抑制細(xì)胞分化。在人和小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中過表達(dá)miR-130a 抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化過程。本研究通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證明了miR-61 與之間存在靶向關(guān)系，并且對(duì)miR-61 和在湖羊和藏羊的尾部脂肪組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示miR-61 和在mRNA 水平表達(dá)趨勢(shì)相反；在蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)相同。這些結(jié)果表明miR-61 和之間存在靶向關(guān)系，且miR-61 對(duì)在轉(zhuǎn)錄水平存在負(fù)調(diào)控作用，在翻譯水平存在正向調(diào)控作用，但這些結(jié)果不足以闡明miR-61 與在綿羊尾部脂肪沉積調(diào)控的機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究對(duì)miR-61 和在綿羊尾部脂肪中的表達(dá)進(jìn)行了分析，預(yù)測(cè)了可能與miR-61 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)證明了是miR-61 的靶基因。推測(cè)miR-61 受 到和等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，可能通過激活PI3KAkt 通路中的基因調(diào)控綿羊尾部脂肪沉積，可為今后深入研究miR-61 在綿羊尾部脂肪沉積過程中的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。