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      基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的飼料添加淫羊藿對(duì)番鴨睪丸組織差異表達(dá)基因分析

      2022-07-13 11:22:08施金虎孟憲娟盧立志許文武杜喜忠
      中國(guó)畜牧雜志 2022年7期
      關(guān)鍵詞:生精睪丸測(cè)序

      施金虎,孟憲娟,盧立志,許文武,杜喜忠

      (1.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)與水產(chǎn)研究所,浙江金華 321017;2.浙江省畜牧技術(shù)推廣與種畜禽監(jiān)測(cè)總站,浙江杭州 317599;3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,浙江杭州 310022)

      睪丸是公番鴨生殖系統(tǒng)中重要的生殖器官,具有兩大生理功能:一是通過(guò)精子發(fā)生產(chǎn)生精子;二是通過(guò)類固醇發(fā)生產(chǎn)生睪酮。精子發(fā)生是一個(gè)依賴于多種因素的復(fù)雜的細(xì)胞分裂過(guò)程,在睪丸的曲細(xì)精管中產(chǎn)生。雄性動(dòng)物精子的形成受下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)節(jié),下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(Gonadotropin Releasing Hormone,GnRH),引發(fā)垂體釋放促黃體生成素,促黃體素生成素能夠刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞增生,誘發(fā)睪丸分泌睪酮,影響雄性生殖器官的發(fā)育、刺激生精上皮的發(fā)育和精子發(fā)生,調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌。精子形成的這個(gè)過(guò)程也同樣受到很多基因的調(diào)控,基因家族由23 個(gè)成員組成,其在調(diào)節(jié)包括睪丸在內(nèi)的幾個(gè)生殖器官的生長(zhǎng)和發(fā)育方面發(fā)揮重要作用。是家族的轉(zhuǎn)錄因子之一,已被證明是對(duì)哺乳動(dòng)物的繁殖具有重要作用的基因。Yu 等發(fā)現(xiàn)在雞的睪丸支持細(xì)胞中定位,與在哺乳動(dòng)物中的定位一致,并且發(fā)現(xiàn)是表達(dá)上游支持細(xì)胞的重要標(biāo)記物,是雞胚胎睪丸分化發(fā)育和正常睪丸功能的潛在調(diào)節(jié)因子。Bai 等分別選取了24 只性腺分化前的莆田番鴨和性腺分化后的莆田番鴨進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)有等9 個(gè)基因與睪丸的分化和發(fā)育有關(guān),并且在性腺分化后,等基因在公鴨中特異性高表達(dá)。

      淫羊藿是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥藥材,含有淫羊藿苷、淫羊藿次苷、黃酮、等多種微量元素,對(duì)生殖系統(tǒng)、性激素、性器官以及精液都具有保護(hù)作用。張長(zhǎng)城等通過(guò)建立生精障礙的小鼠模型,發(fā)現(xiàn)在淫羊藿總黃酮的作用下,其睪丸質(zhì)量、附睪質(zhì)量、精子活力和精子密度均得到顯著性提高,睪丸管腔內(nèi)的精子數(shù)量增多,同時(shí)使生殖細(xì)胞形態(tài)得到了改善。韓貴芳等發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮使自然衰老大鼠的睪丸組織形態(tài)得到改善,生精細(xì)胞數(shù)量明顯增多,推測(cè)淫羊藿總黃酮可能通過(guò)促進(jìn)AMPK 磷酸化減輕其炎癥反應(yīng)。睪丸生殖功能的減退與支持細(xì)胞的功能衰退有著重要聯(lián)系。

      本研究通過(guò)在番鴨飼料中添加1%淫羊藿,首先研究其對(duì)公番鴨睪丸發(fā)育組織形態(tài)的影響以及調(diào)節(jié)體內(nèi)激素分泌的影響,其次利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)挖掘?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組中番鴨睪丸的差異表達(dá)基因與相關(guān)通路,研究結(jié)果為淫羊藿對(duì)番鴨睪丸發(fā)育的影響以及調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 樣品采集與RNA 提取 本實(shí)驗(yàn)將60 只49 周齡公番鴨隨機(jī)分為2 組,每組3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)為10 只。其中A 組為對(duì)照組,飼喂基礎(chǔ)日糧,B 為實(shí)驗(yàn)組,飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加1%的淫羊藿,基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼喂75 d 結(jié)束后,每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選5 只種公鴨進(jìn)行翅下靜脈采血,共采取75 管血液,靜置3~4 h 待血液凝固后,3 000 r/min 離心5 min,收集血清并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中,于-20℃保存?zhèn)溆?,用于測(cè)定血清生殖激素和抗氧化指標(biāo)。另外,每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選1 只種公鴨,每組3 只進(jìn)行屠宰。屠宰結(jié)束后,取其左右側(cè)睪丸,統(tǒng)一采集公鴨左側(cè)睪丸組織樣本用于進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察;統(tǒng)一采集公鴨右側(cè)睪丸組織樣本用于進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

      表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

      1.2 睪丸樣本組織形態(tài)學(xué)觀察 為了觀察睪丸樣本的形態(tài)學(xué),本研究首先對(duì)番鴨睪丸進(jìn)行石蠟切片制作。先將睪丸組織切成2 m的小塊,用Bouin 液固定12 h;接下來(lái)將固定好的組織進(jìn)行脫水,脫水后進(jìn)行石蠟包埋,再進(jìn)行切片;石蠟切片脫蠟后使用蒸餾水清洗,切片制作完成后分別使用蘇木素和伊紅染色,染色完成后進(jìn)行封片。

      1.3 血清生化水平指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)的血清生殖激素指標(biāo)包括睪酮(T)、雌二醇(E)、促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH),使用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定,試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。血清抗氧化指標(biāo)包括超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧能力(T-AOC),使用生化分析儀進(jìn)行分析,試劑盒由北京華英生物技術(shù)研究所提供。

      1.4 RNA 的提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 RNA 的提取使用Omega 試劑盒。得到RNA 后本研究使用Nanodrop 2000 檢測(cè)RNA 濃度、純度和完整度,使用Agilent bioanalyzer 2100 記錄樣本的OD 值和RIN 值。RNA 提取后本研究使用PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser 試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)使用q-PCR法進(jìn)行定量,以保證文庫(kù)的有效濃度,庫(kù)檢合格后使用Illumina Hiseq 平臺(tái)進(jìn)行150 個(gè)堿基對(duì)配對(duì)的雙末端測(cè)序。

      1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)組裝 將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)使用Fastx_toolkit 軟件進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾,包括去除含有接頭的Reads,去除低質(zhì)量的Reads,從而得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)(Clean Reads)。使用Hisat2 軟件將Clean Reads 映射到鴨參考基因組中(CAU_duck1.0)。在已有參考基因組的基礎(chǔ)上本研究使用stringTie 軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝拼接,與已有的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較,獲得沒(méi)注釋的新轉(zhuǎn)錄本。

      1.6 差異表達(dá)分析 本研究使用Deseq2 軟件分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間的差異表達(dá)。采用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)作為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo),將|log2FoldChange|≥1且value<0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)獲得差異表達(dá)的基因集。實(shí)驗(yàn)組差異基因表達(dá)水平高于對(duì)照組為上調(diào)基因(Up Regulated Gene),低于對(duì)照組的為下調(diào)基因(Down Regulated Gene)。

      部分危險(xiǎn)品碼頭因建造時(shí)間早于《裝卸油品碼頭防火設(shè)計(jì)規(guī)范》(JTJ237-99)實(shí)施時(shí)間,消防改造設(shè)計(jì)時(shí)因充分考慮裝卸貨種和碼頭實(shí)際情況確定危險(xiǎn)品碼頭分類等級(jí),避免不必要地大規(guī)模改造碼頭,干擾碼頭的日常生產(chǎn)作業(yè)。

      1.7 差異表達(dá)基因富集分析 Gene Ontology(GO)分析是大規(guī)?;蚬δ芨患芯恐斜容^常用的方法,包含3 個(gè)主要分支:生物學(xué)過(guò)程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)和細(xì)胞組分(Cellular Component)。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析有助于把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體,進(jìn)一步解讀基因功能。差異表達(dá)基因的GO 功能注釋采用超幾何分布的GOseq R 包實(shí)現(xiàn),KEGG 通路分析采用KOBAS 在線網(wǎng)站完成。其中以<0.05 和富集基因數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因顯著富集的GO 條目和KEGG 通路。

      2 結(jié)果

      2.1 睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察 番鴨睪丸組織的石蠟切片結(jié)果如圖1 所示,對(duì)照組(圖1A、圖1B)生精上皮層數(shù)少,生精細(xì)胞數(shù)量少,管腔內(nèi)的空腔面積大,成熟精子少;淫羊藿組(圖1C、圖1D)生精上皮層數(shù)多,生精細(xì)胞數(shù)量多,管腔飽滿,成熟精子多。

      圖1 對(duì)照組和淫羊藿組番鴨睪丸切片

      2.2 血清生化指標(biāo)水平 由表2 可見(jiàn),血清生殖激素中,淫羊藿組睪酮含量、雌二醇含量、促卵泡素含量和促黃體素均要顯著高于對(duì)照組。由表3 可見(jiàn),血清抗氧化指標(biāo)中,淫羊藿組的超氧化物歧化酶(SOD)含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)含量、總抗氧化(T-AOC)水平均顯著高于對(duì)照組;而丙二醛(MDA)含量顯著低于對(duì)照組。

      表2 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清生殖激素含量的比較

      表3 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清抗氧化指標(biāo)的比較

      2.3 RNA 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)Illimina 測(cè)序平臺(tái),本實(shí)驗(yàn)對(duì)睪丸樣本的6 個(gè)cDNA 文庫(kù)進(jìn)行了高通量測(cè)序,經(jīng)過(guò)質(zhì)控后,每個(gè)樣本平均可獲得5.38×10個(gè)Clean Reads(表4)。本研究使用DESeq2 軟件,以value<0.05且|log2FoldChange| ≥1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。本研究最終得到2 414 個(gè)差異表達(dá)基因,其中1 538 個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá),876 個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)(圖2)。

      圖2 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組番鴨睪丸組織中差異表達(dá)基因火山圖

      表4 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估

      2.4 差異基因的GO 注釋及富集分析 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能注釋,共發(fā)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組顯著富集的GO 條目有759 條,在生物學(xué)過(guò)程中多注釋到白細(xì)胞激活(GO:0045321)、淋巴細(xì)胞激活(GO:0046649)、單個(gè)多細(xì)胞生物過(guò)程(GO:0044707)等過(guò)程,在細(xì)胞組分中多注釋到受體(GO:0043235)、離子膜(GO:0005886)、細(xì)胞膜(GO:0009986)、細(xì)胞膜突觸(GO:0120025)等,在分子功能上主要集中于轉(zhuǎn)錄因子、RNA 聚合酶II 核心啟動(dòng)子區(qū)域特異性結(jié)合(GO:0000982),轉(zhuǎn)錄激活因子、RNA 聚合酶II 核心啟動(dòng)子區(qū)域特異性結(jié)合(GO:0001077),RNA 聚合酶II 特異性結(jié)合(GO:0000977)(表5)。

      表5 差異表達(dá)基因富集的GO 分類條目(前10 位)

      KEGG 富集分析用于確定差異表達(dá)基因參與的主要生化代謝途徑和信號(hào)通路。結(jié)果表明,差異表達(dá)基因顯著富集在14 個(gè)通路中(圖3),分別是細(xì)胞因子受體相互作用(ko04060)、鐵死亡(ko04216)、黏附連接(ko04520)、溶酶體(ko04142)、Hippo 信號(hào)通路(ko04391)、軸突引導(dǎo)(ko04360)、礦物質(zhì)吸收(ko04978)、鞘脂生物合成(ko00603)、抗原生成和傳 遞(ko04612)、Rap1 信號(hào)通路(ko04015)、Jak-STAT 信號(hào)通路(ko04630)、Hippo 信號(hào)通路(ko04390)、PI3K-Akt 信號(hào)通路(ko04151)、內(nèi)吞作用(ko04144)。

      圖3 差異表達(dá)基因顯著富集通路氣泡圖

      3 討論

      正常的睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能能夠維持動(dòng)物機(jī)體的繁殖能力。本研究通過(guò)制作石蠟切片,觀察到實(shí)驗(yàn)組中生精上皮層數(shù)多,生精細(xì)胞數(shù)量多,管腔飽滿,成熟精子多,說(shuō)明淫羊藿的確可以促進(jìn)番鴨睪丸的發(fā)育,促進(jìn)精子的發(fā)生與成熟。激素調(diào)控在動(dòng)物的繁殖生理過(guò)程中是必不可少的。種公鴨垂體分泌的促卵泡素和促黃體素、睪丸分泌的睪酮和雌二醇激素都是重要的繁殖激素,屬于類固醇激素。本研究顯示飼料中添加淫羊藿可以顯著提高番鴨體內(nèi)睪酮、雌二醇、促卵泡素、促黃體素的含量。有大量研究與本研究的結(jié)果類似,孫業(yè)波發(fā)現(xiàn)淫羊藿可以顯著提高遼寧絨山羊種公羊血液中睪酮、促卵泡素和促黃體素的含量。淫羊藿中發(fā)揮作用的主要成分是淫羊藿苷,其可能是通過(guò)影響下丘腦-垂體-睪丸軸之間的平衡來(lái)誘導(dǎo)激素分泌。本研究還檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)組中血液的抗氧化指標(biāo),結(jié)果顯示淫羊藿可以提高番鴨體內(nèi)超氧化物歧化酶含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量和總抗氧化水平,降低丙二醛含量。淫羊藿苷具有很強(qiáng)的清除二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH)、超氧陰離子自由基,還原力和總抗氧化能力,同時(shí)有較強(qiáng)的清除羥自由基的能力,這些能力賦予了淫羊藿苷顯著的抗氧化活性。

      通過(guò)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能注釋,本研究發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在生物學(xué)過(guò)程中的白細(xì)胞激活、淋巴細(xì)胞激活以及single-multicellular 組織進(jìn)程等過(guò)程。相關(guān)研究表明動(dòng)物的睪丸具有特殊的免疫環(huán)境,主要體現(xiàn)在它具有顯著的免疫特權(quán)和有效的局部先天免疫的特性,睪丸炎的發(fā)生可能使免疫平衡受損,而白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對(duì)維持睪丸免疫平衡至關(guān)重要。郭明明等研究表明淫羊蕾對(duì)雞的免疫功能有一定影響,高煥等研究表明淫羊蕾可提高淋巴細(xì)胞IL-2、IL-4 和IFN-mRNA 的表達(dá),從而提高家禽的免疫能力,猜測(cè)淫羊蕾可能通過(guò)對(duì)睪丸免疫系統(tǒng)的改進(jìn)從而提升番鴨的生殖能力。差異表達(dá)基因在細(xì)胞組分中主要注釋到受體復(fù)合物、質(zhì)膜、細(xì)胞膜、溶酶體腔等組分。激素受體在調(diào)節(jié)睪丸形成和雄性生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中有非常重要的作用,Heckert 等人證明FSH 受體mRNA 存在于成年大鼠的睪丸中,并且這種mRNA 水平在生精上皮細(xì)胞的周期中發(fā)生變化,還有如糖皮質(zhì)激素受體和可溶性促性腺激素受體,ALK 受體家族對(duì)雄性睪丸和睪丸生精過(guò)程均具有調(diào)控作用。質(zhì)膜和細(xì)胞膜是精子主要的膜結(jié)構(gòu),溶酶體腔泡對(duì)精子細(xì)胞和精母細(xì)胞釋放入管腔內(nèi)有重要作用,可能的機(jī)制是淫羊蕾通過(guò)對(duì)質(zhì)膜、細(xì)胞膜、受體復(fù)合物、溶酶體腔等細(xì)胞組分形成的影響來(lái)影響番鴨精子的形成和發(fā)生。差異表達(dá)基因分子功能方面主要注釋到轉(zhuǎn)錄因子活性、RNA 聚合酶特異性結(jié)合,DNA 結(jié)合等。相關(guān)研究表明諸多轉(zhuǎn)錄因子在動(dòng)物睪丸發(fā)育過(guò)程中起到關(guān)鍵作用,其中轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過(guò)調(diào)節(jié)睪丸中細(xì)胞周期蛋白A1(GATA1)特異性表達(dá),Sox9、Sox5 和Sox13 轉(zhuǎn)錄因子可影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞的表達(dá),Semba 等的研究表明由基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子HMG 對(duì)性腺發(fā)育不全有關(guān)。

      本研究差異表達(dá)基因主要在細(xì)胞因子受體相互作用、鐵死亡、黏附連接、溶酶體、Hippo 及jak-stat 信號(hào)等通路中富集,表明這些信號(hào)通路與番鴨睪丸發(fā)育和生精能力有關(guān)。Li 等人研究表明細(xì)胞因子和睪酮調(diào)節(jié)原代精母細(xì)胞在血睪屏障和精子形成中的運(yùn)輸中起重要作用,Loveland 等研究表明一些重要的細(xì)胞因子在建立和維護(hù)睪丸的免疫特性方面有重要作用,如細(xì)胞因子SOCS 可通過(guò)jak 信號(hào)通路調(diào)節(jié)睪丸發(fā)育和免疫微環(huán)境建立,腫瘤壞死因子(TNF-a)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)對(duì)睪丸自身免疫同樣起重要作用。陳蕙芳對(duì)淫羊蕾的粗提取物進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)這些提取物中具有抗炎、雌激素樣、抗衰老等多種生物活性,這與本研究得到的結(jié)果吻合。粘附連接是細(xì)胞和細(xì)胞直接的關(guān)鍵點(diǎn),其在決定和維持組織結(jié)構(gòu)方面起重要作用,在睪丸中,支持細(xì)胞之間以及支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞之間的連接是由肌動(dòng)蛋白連接的,這些連接對(duì)于精子的發(fā)生非常重要。Hippo 信號(hào)通路和jak-stat 信號(hào)通路在細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用,相關(guān)研究表明Hippo 信號(hào)通路對(duì)鮭魚青春期睪丸支持細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用,jak-stat 信號(hào)通路可以促進(jìn)果蠅成年睪丸中的生殖干細(xì)胞分化。

      4 結(jié)論

      飼料日糧中添加淫羊藿可提高番鴨血清生殖激素中睪酮含量、雌二醇含量、促卵泡素含量和促黃體素表達(dá),提高超氧化物歧化酶含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量、總抗氧化水平。飼料日糧中添加淫羊藿對(duì)番鴨睪丸發(fā)育有顯著影響,可激活白細(xì)胞和相關(guān)免疫受體表達(dá),激活細(xì)胞因子受體相互作用、鐵死亡等代謝途徑和信號(hào)通路。本研究結(jié)果對(duì)飼料中添加淫羊藿以提高番鴨的繁殖力具有重要意義。

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