邵焱焱,楊 恒,牟 健,朱夢婷,3,南 穎,趙宗勝*
(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,新疆石河子 832000;2.西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,重慶 402460;3.省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室,新疆農(nóng)墾科學(xué)院,新疆石河子 832000)
黃體是一種能夠分泌孕酮且在雌性動物體內(nèi)形成的臨時性器官。母體正常繁殖周期內(nèi),如果卵子受精,黃體將分泌P等激素來參與調(diào)節(jié)受精卵宮內(nèi)著床和妊娠的早期維持。如果卵子未受精或在妊娠末期(或分娩后),黃體將會正常退化開啟新一輪生殖周期。因此,黃體的維持與退化對雌性動物的性周期連續(xù)性至關(guān)重要。
microRNA(miRNA)是一種小型非編碼的內(nèi)源性RNAs,其長度片段大小一般為18~24 個核苷酸,廣泛參與血管生成、纖維化修復(fù)、細(xì)胞凋亡、子宮粘連及炎癥反應(yīng)等生理過程。其中,miR-665 被認(rèn)為是miRNA 大家族中不可或缺的成員。目前,關(guān)于miR-665 的相關(guān)報道較少,主要是集中在一些疾病方面,如miR-665 可以通過靶向免疫球蛋白樣受體抑制脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng),同時,miR-665 可以調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和黏附和抑制膀胱癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的增殖。目前有關(guān)miR-665 在母畜黃體細(xì)胞中的表達及其具體作用未見報道。因此,本實驗通過miR-665 模擬物和陰性對照物轉(zhuǎn)染綿羊黃體細(xì)胞,檢測類固醇急性應(yīng)激調(diào)節(jié)蛋白()、3-羥基類固醇脫氫酶()的mRNA、蛋白表達水平及P分泌水平變化,分析miR-665 可能對綿羊黃體細(xì)胞內(nèi)分泌功能的調(diào)控影響,為進一步闡明miRNAs 在母畜黃體維持與退化中的作用及其相關(guān)分子調(diào)控機制提供參考。
1.1 實驗材料 黃體來自新疆石河子屠宰場成年健康的哈薩克母羊;20×PBS 購自生化Sangon Biotench 公司;細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶、雙抗購自北京博奧托大科技有限公司;SiCHECKTM-2 Vector 購自Promega 公司;突觸素(SYP)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;miR-665 模擬物、miR-665 陰性對照購自廣州銳博生物科技有限公司;Gene TranIII 轉(zhuǎn)染試劑購自BioMIGA,ELISA(P)試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司;提取RNA 到熒光定量的染料的所有試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司和康為世紀(jì)生物科技公司;兔源多克隆抗體羊抗兔IgG 二抗、SDS-PAGE、PVDF 膜、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒等購自索萊寶生物科技有限公司和美國Millipore 公司。
1.2 黃體細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定 取自哈薩克母羊的中期黃體組織,去除脂肪和結(jié)締組織。將組織切成1 mm塊,切碎的黃體組織使用膠原酶II 在37℃下消化1 h。然后將1 000 r/min 離心5 min 得到的細(xì)胞接種在培養(yǎng)基中,并在常溫并含有少量CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3~4代后獲得純化的母羊黃體細(xì)胞,使用突觸素(SYP)免疫細(xì)胞化學(xué)染色用于鑒定母羊黃體細(xì)胞。
1.3 miRNA-665 轉(zhuǎn)染黃體細(xì)胞 待傳代黃體細(xì)胞長滿80%~90%接種到6 孔板中,當(dāng)黃體細(xì)胞密度長滿85%左右,觀察細(xì)胞形態(tài)良好的情況下,使用PBS 清洗干凈,饑餓2 h 后進行分組轉(zhuǎn)染,即空白對照組(未添加任何試劑)、miR-665 模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-665 模擬物)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照物),每組3 個重復(fù)。
1.4 qRT-PCR 測定 參照總RNA 提取試劑盒說明書提取轉(zhuǎn)染48 h 后綿羊黃體細(xì)胞中總RNA,通過Nanodrop 2000 儀器測定RNA 的純度和濃度。將RNA 反轉(zhuǎn)錄并測定cDNA 的純度及濃度,合格后保存于-20℃。qRTPCR 檢測3 個引物(表1),其中miR-665 引物(5'-3')為ACCAGTAGGCCGAGGCC,由Sangon Biotech公司合成。qRT-PCR 檢測(反應(yīng)體系為20 μL):染料10 μL,上引物1 μL,下引物1 μL,DNA 2 μL,無酶水6 μL。PCR 擴增程序為:預(yù)變形 95℃ 30 s;55 個循環(huán),95℃ 5 s,56℃ 30~34 s。
表1 引物序列信息
1.5、蛋白鑒定 收集每組轉(zhuǎn)染48 h 的黃體細(xì)胞,并使用RIPA 強細(xì)胞裂解液分層提取總蛋白。使用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度,然后一定量的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE 操作,并在1.5 h 后放置PVDF膜上。接著加入配置好的脫脂牛奶常溫下避光30 min,將膜與一抗在低溫下避光孵育12 h。將膜清洗幾次后,加入IgG 常溫孵育2 h。使用ECL 化學(xué)發(fā)光觀察蛋白質(zhì)不同條帶,并使用Quantity One 軟件量化條帶強度。
1.6 黃體細(xì)胞液收集及P水平測定 細(xì)胞培養(yǎng)板轉(zhuǎn)染綿羊黃體細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h 后采集1 次細(xì)胞培養(yǎng)液,做好標(biāo)記保存于-20℃?zhèn)溆?。利用酶?lián)免疫測定(ELISA)試劑盒檢測血清中的P濃度,分析不同試驗組中P分泌差異水平。
1.7 統(tǒng)計分析 實時熒光定量數(shù)據(jù)以2法處理;使用SPSS Statistics 20.0 軟件ANOVA 分析比較基因、蛋白表達量差異,<0.01 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 黃體細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 通過選取顏色呈肉紅色,直徑大于0.5 cm 的卵巢(黃體)作為處理對象(圖1-A);膠原酶II 消化分離的黃體細(xì)胞呈單一分散狀態(tài),胞體呈透明、圓形或多邊形細(xì)胞,體積較?。▓D1-B);培養(yǎng)24 h 后,黃體細(xì)胞開始貼壁,呈不規(guī)則形狀,分散比較均勻,逐漸開始相連(圖1-C);培養(yǎng)48 h 后,細(xì)胞進入對數(shù)生長期,細(xì)胞完全貼壁,呈梭形或不規(guī)則形狀(圖1-D)。其中,綿羊黃體組織屬于彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),SYP 是一種較為全面的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物;利用免疫組化法鑒定黃體細(xì)胞SYP 陽性率達90%以上(圖1-E,F),表明用于本實驗分離培養(yǎng)的細(xì)胞為綿羊黃體細(xì)胞。
圖1 篩選的黃體組織和分離培養(yǎng)后不同時間段的黃體細(xì)胞
2.2 miR-665 在轉(zhuǎn)染前后黃體細(xì)胞中的表達分析 如圖2 所示,與空白對照組和陰性對照組相比,miR-665 模擬物組中黃體細(xì)胞的miR-665 表達量極顯著升高,說明轉(zhuǎn)染miR-665 模擬物后可顯著增加黃體細(xì)胞中miR-665 的表達水平。
圖2 不同組別中黃體細(xì)胞miR-665 的表達水平
2.3 過表達miR-665 對、表達的影響 如圖2 顯示,與空白對照組和陰性對照組相比,miR-665模擬物組中黃體細(xì)胞的、mRNA 表達水平極顯著增加;同時,關(guān)鍵合成基因、的蛋白表達水平也極顯著增加。
圖3 孕酮關(guān)鍵合成酶StAR、3β-HSD mRNA(A)和蛋白表達量(B 和C)
2.4 過表達miR-665 對綿羊黃體細(xì)胞P分泌水平的影響如圖4 顯示,與空白對照組相比,miR-665 模擬物組中黃體細(xì)胞內(nèi)分泌P分泌水平極顯著增加,而陰性對照組的黃體細(xì)胞中的P分泌水平?jīng)]有明顯變化,說明在綿羊黃體細(xì)胞中上調(diào)miR-665 表達能夠促進黃體細(xì)胞分泌P,可能參與其黃體細(xì)胞的內(nèi)分泌功能調(diào)控。
圖4 不同轉(zhuǎn)染組別中綿羊黃體細(xì)胞孕酮激素分泌水平
3.1 綿羊黃體細(xì)胞鑒定 黃體的主要生理功能是合成分泌類固醇激素P,以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的變化來適應(yīng)受精卵著床和妊娠的維持。其中,在哺乳動物黃體合成和分泌P過程中涉及3 個重要因素,即將膽固醇運輸至線粒體上,然后油膽固醇側(cè)鏈裂解酶促進膽固醇分解成孕烯醇酮,最終促進孕烯醇酮轉(zhuǎn)換為P。張家驊報道,抑制劑可以降低血清中的P濃度,且抑制劑在細(xì)胞中呈陽性表達,使細(xì)胞分泌類固醇激素,顯示可以作為黃體細(xì)胞區(qū)分內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定方法。同時,蘆習(xí)研究證實在mRNA 水平上也可作為黃體細(xì)胞鑒定的方法。然而,廣泛分布于甾體激素生成組織(如卵母細(xì)胞和子宮),在其區(qū)別鑒定黃體細(xì)胞方面仍存在一定局限、缺乏說服力。近期,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)黃體屬于彌散性神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),并具有4 種神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物,即神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)、突觸素(SYP)、五羥色胺(5-HT)和S100B 蛋白(S100B)。其中,SYP 廣泛存在于周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的所有內(nèi)分泌細(xì)胞中,但SYP 不在神經(jīng)膠質(zhì)和白質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn);SYP 的合成分泌可以用來區(qū)分黃體細(xì)胞與其他細(xì)胞,是一種較為全面的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物,相比NSE、5-HT 和S100 更具有特異性。因此,本試驗通過免疫組化檢測黃體組織培養(yǎng)的細(xì)胞SYP 陽性表達情況,證實了分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞為綿羊黃體細(xì)胞,為后續(xù)研究提供了保障。
3.2 miR-665 對綿羊黃體細(xì)胞內(nèi)分泌關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因及其功能的影響 黃體作為母畜生殖活動調(diào)控的重要組織,涉及一系列細(xì)胞信號級聯(lián)事件。近年來,大量研究發(fā)現(xiàn),在黃體組織中存在大量的miRNAs,而且這些miRNAs參與黃體組織的形成、維持和退化過程,并在其中發(fā)揮著重要作用。例如,miR-21 表達升高有利于卵泡存活,并影響卵泡的黃體化過程;類似地,miR-96 表達增加能夠促進黃體細(xì)胞的存活和P生成。然而,黃體組織中表達的miR-665 相關(guān)的研究未見報道。本研究首次采用了miR-665 模擬物進行黃體細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃體細(xì)胞的內(nèi)源性miR-665 顯著增加;同時,miR-665 模擬物組中P含量處于較高水平,提示miR-665 過表達后能夠明顯增強黃體細(xì)胞的內(nèi)分泌功能、促進P的合成與分泌。目前,愈來愈多的研究證實miRNA 作為內(nèi)源性的非編碼RNA,它對細(xì)胞生理學(xué)產(chǎn)生著廣泛影響,幾乎涉及所有的細(xì)胞調(diào)控過程。和被證實是孕酮生成的關(guān)鍵合成酶基因,本研究分別檢測了和的表達水平,結(jié)果顯示miR-665 在黃體細(xì)胞中過表達后,其內(nèi)和的mRNA 和蛋白表達水平均呈顯著增加,這進一步論證了miR-665 確實參與了黃體細(xì)胞內(nèi)P的合成與分泌過程,并在此過程中能夠通過上調(diào)和mRNA 和蛋白表達以增強黃體的內(nèi)分泌功能。因此,基于以上結(jié)果和分析,推斷miR-665在綿羊黃體維持與退化過程中的作用很可能主要是促進黃體細(xì)胞功能的穩(wěn)定和維持黃體組織結(jié)構(gòu)的完整。
本研究通過在黃體細(xì)胞中過表達miR-665 后,發(fā)現(xiàn)miR-665 能夠極顯著促進黃體細(xì)胞中P合成與分泌,即通過上調(diào)孕酮關(guān)鍵合成酶和的表達,以促進黃體細(xì)胞功能的穩(wěn)定,這為進一步完善哺乳動物黃體組織的維持與退化調(diào)控分子機制提供了新的理論依據(jù),為深入探討黃體組織的過早溶解或衰退奠定了堅實基礎(chǔ)。