陳奎元， 劉卉， 丁偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保系，哈爾濱 150030）

自1996年轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆商業(yè)化種植以來，草甘膦因其除草效率高、安全性好、成本低等特點(diǎn)成為全球銷量第一的除草劑[1]。草甘膦施用后約70%進(jìn)入土壤，極易被土壤吸附[2]，嚴(yán)重影響土壤酶活性[3]。土壤酶活性直接關(guān)系土壤養(yǎng)分的代謝，其中土壤脲酶及大豆根瘤固氮酶是參與土壤氮素循環(huán)的重要組分，土壤酸性磷酸酶與土壤磷素循環(huán)關(guān)系密切，土壤纖維素酶在土壤碳循環(huán)中起著重要作用[4]。因此，研究草甘膦對土壤養(yǎng)分及其功能酶活性的影響可為未來抗草甘膦作物在中國應(yīng)用提供土壤環(huán)境安全基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

已有室內(nèi)模擬研究表明，向不同土壤中加入草甘膦后，土壤有效磷、速效鉀含量顯著升高[5]，土壤脲酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶和脫氫酶活性升高，磷酸酶活性降低[6]。然而，實(shí)際生產(chǎn)中因受多種因素共同作用，不同水平草甘膦對不同土壤的影響遠(yuǎn)比室內(nèi)結(jié)果更復(fù)雜。研究表明，低水平的草甘膦在6 d內(nèi)對水稻試驗(yàn)田耕層土壤蔗糖酶和過氧化氫酶的活性有促進(jìn)作用[7]，而高水平的草甘膦會抑制土壤中的過氧化氫酶活性，水平越高抑制作用越強(qiáng)[6]，當(dāng)草甘膦在土壤中降解后，這種抑制作用會逐步減弱[8]。草甘膦會抑制轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的根瘤固氮酶活性[9]，并與土壤氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)[10]；有研究表明，草甘膦施用后，對棉花田土壤脲酶活性先抑制后促進(jìn)[11]，桉樹林表層土壤纖維素酶和磷酸酶活性降低，土壤全氮全磷含量降低，不利于土壤養(yǎng)分循環(huán)[12]。目前為止，草甘膦對大豆田土壤養(yǎng)分與土壤功能酶相互關(guān)系尚缺乏系統(tǒng)研究。大豆是重要的糧食兼油料作物，隨著轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆在世界范圍內(nèi)的廣泛種植和中國對轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆研究的不斷深入，開展草甘膦對土壤養(yǎng)分及其功能酶活性的研究，可為轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆種植提供土壤安全性基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究以大豆田土壤為研究對象，采用2年田間定位試驗(yàn)方法，研究草甘膦對土壤氮（N）、磷（P）、鉀（K）與脲酶、磷酸酶、纖維素酶、過氧化氫酶和根瘤固氮酶活性及其相互關(guān)系的影響，以期為轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆商業(yè)化安全應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 供試大豆品系為轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆呼交06-698，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.1.2 供試土壤 采用5點(diǎn)取樣法，取0—20 cm土層大豆根際抖落土混勻。將同一小區(qū)內(nèi)5點(diǎn)土壤樣品均勻混合，土壤自然風(fēng)干后過2 mm篩，用于測定土壤養(yǎng)分含量及土壤酶活性，每處理重復(fù)測定3次。

1.1.3 供試藥劑 41%草甘膦異丙胺鹽水劑，美國孟山都公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019—2020年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)地周圍有高2 m的圍墻防護(hù)，專人看管，圍墻外無任何其他作物種植，試驗(yàn)地周圍200 m內(nèi)無其他大豆種植。試驗(yàn)期間除草甘膦以外無任何其他除草劑施用。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)4個(gè)處理，草甘膦施藥有效量為0.0、1.2、2.4、3.6 kg·hm-2，分別用CK、T1、T2、T3表示，每個(gè)小區(qū)界限明晰且各年度固定在同一位置，每個(gè)小區(qū)面積為12.0 m2，播期和密度與當(dāng)?shù)卮筇镆恢拢磕昃诖蠖沟?片復(fù)葉完全展開期噴施草甘膦，分別在施藥后7、14、21、28 d進(jìn)行調(diào)查，每處理3次重復(fù)測定。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤養(yǎng)分含量測定 采用堿解擴(kuò)散法測定土壤堿解氮含量，采用鉬銻抗比色法測定速效磷含量，采用火焰光度法測定速效鉀含量[13]。

1.3.2 土壤酶活性測定 采用靛酚比色法測定土壤脲酶活性，采用磷酸苯二鈉法測定磷酸酶活性，采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性，采用蒽酮比色法測定纖維素酶活性[13]。

1.3.3 大豆根瘤固氮酶活性的測定 利用TRACE 1300氣相色譜儀（賽默飛世爾科技(中國)有限公司），采用乙炔還原法活體測定大豆根瘤固氮酶活性[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013軟件處理原始數(shù)據(jù)，應(yīng)用DPS 10.05軟件進(jìn)行方差分析，通過LSD法在P＜0.05水平下比較數(shù)據(jù)之間的差異顯著性，利用SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)性和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對土壤養(yǎng)分含量的影響

2.1.1 草甘膦施用對土壤堿解氮含量的影響 由表1可知，施用草甘膦7 d后，2019年各處理土壤堿解氮含量顯著升高，2020年各處理土壤堿解氮含量顯著降低。施用14 d后，2019年T1處理土壤堿解氮含量高于CK，T2及T3處理土壤堿解氮含量低于CK。施用21 d后，2019年各處理土壤堿解氮含量顯著降低；2020年T1及T2處理土壤堿解氮含量顯著低于CK。施用28 d后，2019年除T3處理土壤堿解氮含量顯著低于CK以外，其余各處理均顯著高于CK；2020年T1和T3處理土壤堿解氮含量與CK無顯著差異，T2處理土壤堿解氮含量顯著低于CK。2年平均降低峰值為施用14 d后T2處理，比CK降低了10.57%。

表1 不同處理下土壤堿解氮含量Table 1 Soil alkaline soluble nitrogen content under different treatments

2.1.2 草甘膦施用對土壤速效磷含量的影響 由表2可知，施用草甘膦7 d后，2019年各處理土壤速效磷含量均顯著高于CK；2020年T1處理土壤速效磷含量顯著高于CK，T2及T3處理土壤速效磷含量與CK無顯著差異。施用14 d后，2019年及2020年各處理土壤速效磷含量均顯著低于CK。施用21 d后，2019年土壤速效磷含量T1處理顯著低于CK，T2處理與CK無顯著差異，T3處理顯著高于CK。施用28 d后，2019年與2020年T1處理土壤速效磷含量顯著低于CK；T2處理與CK無顯著差異，T3處理2019年顯著低于CK，2020年與CK無顯著差異。2年平均降低峰值為施用14 d后T2處理，比 CK降低了11.30%。

表2 不同處理下土壤速效磷含量Table 2 Soil available phosphorus content under different treatments

2.1.3 草甘膦施用對土壤速效鉀含量的影響2019年和2020年試驗(yàn)結(jié)果（圖1）均顯示，草甘膦施用后的7、14、21、28 d，各處理土壤速效鉀含量與CK相比均無顯著差異。

圖1 不同處理下土壤速效鉀含量Fig.1 Soil available potassium content under different treatments

2.2 草甘膦對土壤酶活性的影響

2.2.1 草甘膦對土壤脲酶活性的影響 2年試驗(yàn)結(jié)果表明，施用草甘膦后，T1處理土壤脲酶活性先升高后降低，T2與T3處理土壤脲酶活性先降低再升高。2019年在施用14～28 d內(nèi)，與CK相比，T1處理土壤脲酶活性顯著升高，T3處理土壤脲酶活性顯著降低。2年平均降低峰值為施用21 d后T2處理，比 CK降低了67.66%（圖2）。

圖2 不同處理下土壤脲酶活性Fig.2 Soil urease activity under different treatments

2.2.2 草甘膦對土壤磷酸酶活性的影響 施用草甘膦7 d后，T1與T3處理土壤磷酸酶活性顯著高于CK，施用7 d以后土壤磷酸酶活性開始降低，施用14～21 d后土壤磷酸酶活性受到抑制，2019年抑制峰值出現(xiàn)在第21天，2020年抑制峰值出現(xiàn)在第14天，第28天時(shí)土壤磷酸酶活性逐漸恢復(fù)至第7天水平。2年平均降低峰值為21 d后的T1處理，比CK降低了40.62%（圖3）。

圖3 不同處理下土壤磷酸酶活性Fig.3 Soil phosphatase activity under different treatments

2.2.3 草甘膦對土壤過氧化氫酶活性的影響 隨著時(shí)間的推移，7～28 d內(nèi)土壤過氧化氫酶活性先降低后升高，2年降低峰值均出現(xiàn)在施藥后第14天，以后逐漸升高，28 d后逐漸恢復(fù)正常。施用草甘膦后，除2019年21～28 d內(nèi)的T2處理外，2年各處理土壤過氧化氫酶活性均顯著高于CK。2年平均降低峰值為施藥14 d后T1處理，比CK升高了131.93%（圖4）。

圖4 不同處理下土壤過氧化氫酶活性Fig.4 Soil catalase activity under different treatments

2.2.4 草甘膦對土壤纖維素酶活性的影響 隨著施用時(shí)間的推移，7～28 d內(nèi)大豆田土壤纖維素酶活性降低峰值除2019年的T2處理出現(xiàn)在第14天外，其余各處理均出現(xiàn)在第21天，然后逐漸恢復(fù)。草甘膦施用后7 d，2019年T1與T3處理土壤纖維素酶活性顯著高于CK，T2處理與CK相比無顯著差異；2020年T1處理與CK無顯著差異，T2與T3處理顯著高于CK。施用后第14天，2019年T1與T2處理土壤纖維素酶活性顯著低于CK，T3處理顯著高于CK；2020年各處理土壤纖維素酶活性與CK相比均無顯著差異。施用后第21天，2019年T1處理土壤纖維素酶活性顯著低于CK，T2和T3處理與CK無顯著差異；2020年T1和T2處理均顯著低于CK，T3處理與CK無顯著差異。施用后第28天，2019年T1處理纖維素酶活性顯著低于CK，T2及T3處理與CK相比均無顯著差異；2020年T1和T3處理與CK相比無顯著差異，T2處理與CK相比顯著降低了27.63%。2年平均降低峰值為施藥21 d后的T1處理，比CK降低了45.88%（圖5）。

圖5 不同處理下土壤纖維素酶活性Fig.5 Soil cellulase activity under different treatments

2.2.5 草甘膦對大豆根瘤固氮酶活性的影響 2年間大豆根瘤固氮酶活性變化規(guī)律相似，施用后隨時(shí)間推移逐漸降低。草甘膦施藥7 d后，2年T2與T3處理呼交06-698大豆根瘤固氮酶活性均顯著低于CK。施藥14 d后，2019年各處理顯著低于CK，2020年各處理與CK相比無顯著差異。施藥21～28 d后，2年各處理與CK均無顯著差異。2年平均降低峰值為施藥7 d后T3處理，比CK降低了74.49%（圖6）。

圖6 不同處理下根瘤固氮酶活性Fig.6 Nodule nitrogenase activity under different treatments

2.3 土壤酶活性與土壤養(yǎng)分含量的相關(guān)性分析

從相關(guān)系數(shù)矩陣可知，2019年與2020年土壤酶活性及土壤養(yǎng)分含量之間存在一定的相關(guān)性。施用草甘膦后，轉(zhuǎn)基因大豆田大豆根瘤固氮酶與脲酶活性呈顯著正相關(guān)；土壤磷酸酶與過氧化氫酶、纖維素酶活性呈極顯著正相關(guān)；土壤速效磷含量與過氧化氫酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)，與磷酸酶、根瘤固氮酶活性均呈極顯著負(fù)相關(guān)；速效鉀含量除與土壤磷酸酶活性、纖維素酶活性呈極顯著正相關(guān)外，還與堿解氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)、與速效磷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（表3）。這些相關(guān)性說明各指標(biāo)之間反映的信息存在重疊，需通過主成分法進(jìn)行簡化分析。

表3 土壤酶活性及土壤養(yǎng)分含量的相關(guān)性Table 3 Correlation between soil enzyme activity and soil nutrients

2.4 土壤酶活性與土壤養(yǎng)分的主成分分析

對2019年及2020年草甘膦施用后大豆田土壤養(yǎng)分及其功能酶的8個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，并提取出3個(gè)主成分因子，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到72.308%，能夠較全面地反映大豆田養(yǎng)分及其功能酶活性的8種指標(biāo)（見表4）。其中第1主成分的特征值2.938，方差貢獻(xiàn)率36.730%，第1主成分中載荷較高的是速效磷及磷酸酶，能解釋土壤磷素循環(huán)的大部分信息。第2主成分的特征值1.645，方差貢獻(xiàn)率20.566%，在第2主成分中載荷較高的是堿解氮、脲酶及大豆根瘤固氮酶，因此第2主成分能解釋土壤氮素循環(huán)的大部分信息。第3主成分的特征值1.201，方差貢獻(xiàn)率15.012%，第3主成分中載荷較高的是纖維素酶和速效鉀，能在一定程度上解釋土壤鉀素變化特征。

表4 主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率和累計(jì)方差貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvalue，variance contribution rate and cumulative variance contribution rate of principal components

特征向量是各指標(biāo)的主成分載荷與其特征值之比的平方根，以每個(gè)指標(biāo)特征向量的主成分得分構(gòu)建函數(shù)表達(dá)式（F1、F2、F3依次為第1、2、3主成分的得分）。以各主成分的貢獻(xiàn)率與總和之比為權(quán)重，得到各濃度草甘膦施用后大豆田土壤質(zhì)量綜合得分（S）模型。

根據(jù)綜合得分模型可計(jì)算出各處理草甘膦施用后大豆田土壤質(zhì)量的綜合得分（表5），得分越低，土壤質(zhì)量越差。施用不同含量草甘膦后，以土壤N、P、K養(yǎng)分及其功能酶為主成分的土壤質(zhì)量綜合得分從高到低依次為T2＞T3＞CK＞T1。

表5 土壤質(zhì)量主成分得分及排名Table 5 Soil nutrient principal components scores and rankings

3 討論

堿解氮、速效磷和速效鉀含量能較好地反映近期土壤各元素供應(yīng)狀況，是土壤供肥水平的主要指標(biāo)[15]。草甘膦影響作物的根際養(yǎng)分[16]，可能是由于草甘膦施用后對土壤微生物及酶活性的影響造成的[17]。草甘膦施用后抑制土壤中固氮微生物的活性[9]，同時(shí)大豆田雜草數(shù)量降低[18]，大豆競爭吸收養(yǎng)分量增加，這可能是草甘膦施用后土壤堿解氮含量顯著降低的重要原因。草甘膦不會對土壤鉀含量造成影響[3]，但長期噴灑草甘膦會影響土壤中磷的含量[19]。草甘膦與土壤鐵元素形成的螯合物不穩(wěn)定[20]，易被磷酸鹽解吸，增加土壤Fe-P含量從而降低土壤速效磷含量[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，施用草甘膦對土壤速效鉀含量無顯著影響、速效磷含量顯著降低，這與上述研究結(jié)果相似。

土壤酶是土壤環(huán)境重要的組成部分，與土壤環(huán)境的動態(tài)變化密不可分。過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶、纖維素酶等與土壤養(yǎng)分循環(huán)顯著相關(guān)[7]。土壤過氧化氫酶是土壤微生物代謝的重要酶，在清除H2O2和保護(hù)植物免受氧化脅迫中起著重要作用[22]。脲酶與土壤氮素循環(huán)密切相關(guān)，能催化尿素水解為氨和二氧化碳。草甘膦施用后會激活土壤脲酶活性[6]，抑制過氧化氫酶活性[11]。土壤酸性磷酸酶與土壤磷素循環(huán)密切相關(guān)[23]，由于草甘膦在土壤中的降解與C-P鍵的斷裂密切相關(guān)[24]，土壤磷酸酶活性隨草甘膦的施用量不同而受到抑制或激活[6]，低水平表現(xiàn)為抑制而高水平處理表現(xiàn)為激活。草甘膦連續(xù)施用會抑制土壤酸性磷酸酶活性[25]，從而降低土壤磷素含量。土壤纖維素酶在纖維素的分解轉(zhuǎn)化中起著重要作用。已有研究表明，施用草甘膦后纖維素酶活性受到抑制[6]。大豆根瘤固氮酶能為大豆提供共生固態(tài)氮[4]，F(xiàn)an等[9]發(fā)現(xiàn)草甘膦影響固氮菌的生長，導(dǎo)致固氮酶活性迅速下降。也有研究表明在不敏感根瘤菌系形成的根瘤中，草甘膦的高水平積累不會降低根瘤固氮酶活性[26]。面對復(fù)雜且具有相關(guān)性的多個(gè)土壤酶活性與土壤養(yǎng)分含量等評價(jià)指標(biāo)，主成分分析能夠客觀準(zhǔn)確地評價(jià)土壤質(zhì)量[27]。本研究采用主成分及綜合評價(jià)法對土壤養(yǎng)分及其功能酶活性綜合分析，發(fā)現(xiàn)中、高劑量草甘膦施用后，短時(shí)間內(nèi)土壤脲酶活性、土壤纖維素酶活性、磷酸酶活性和根瘤固氮酶活性顯著降低，過氧化氫酶活性顯著增高，短時(shí)間內(nèi)會導(dǎo)致土壤中過氧化氫增加，影響土壤氮素代謝和磷素的轉(zhuǎn)化，但這種不利影響隨草甘膦施用后時(shí)間延長而逐步恢復(fù)正常，長時(shí)間不會對土壤養(yǎng)分及其功能酶活性帶來不利影響。