孫 音，郝 軍，房義福，張 謙，姜楠南

（1山東省林業(yè)科學研究院，濟南 250014；2濟南市歷城區(qū)綠化服務中心，濟南 250100）

0 引言

兜蘭屬(Paphiopedilum)是蘭科植物中較原始的屬之一，以其唇瓣而得名，故又叫拖鞋蘭、仙履蘭等，在全世界約有80余種，接近1/3的資源在中國有分部[1]，主要產于廣西、云南以及貴州等省區(qū)[2]。其花期長、花型奇特，備受世界花卉愛好者的青睞。目前對兜蘭的研究主要集中于系統(tǒng)演化、生態(tài)地理、引種馴化、組培快繁、多樣性評價等方面[3-4]。

60Co-γ射線穿透力強，變異譜大，誘導的變異性狀可在當代進行篩選，且具有可遺傳性，能極大的縮短育種周期，目前作為一種便捷的手段被廣泛應用多種植物中[5]。輻射誘變育種和組織培養(yǎng)相結合的育種體系是近年來研究者較為關注的育種方法，它可以提高植物在基因水平上的突變率，有利于打破性狀連鎖以及親本對后代變異類型的局限，進而擴大植物的變異譜，縮短育種年限，快速創(chuàng)造新材料、新種質[6]。王晶等[7]研究了60Co-γ射線對菊花組培苗的誘變效應，發(fā)現(xiàn)在增殖階段和生根階段，誘變處理的最佳劑量在10 Gy左右，葉片和花色都發(fā)生不同程度的變異。劉麗強等[8]對觀賞海棠組培苗的輻射誘變中發(fā)現(xiàn)，60Co-γ射線輻射后，組培苗在形態(tài)上出現(xiàn)明顯矮化特征，葉色、葉緣、葉形變異明顯，30 Gy時誘變效果穩(wěn)定，是較為合適的輻射劑量。姜長陽等[9]利用60Co-γ射線輻射玉蘭由莖尖生長點誘導的愈傷組織，并從再生植株中選育出生長速度快、生長旺盛、抗逆性強等具有多種優(yōu)良性狀的玉蘭新品系。張慧琴等[10]用60Co-γ射線對草莓組培苗進行了輻射誘變，發(fā)現(xiàn)輻射劑量對草莓組培苗的生長發(fā)育有顯著影響，品種不同，對輻射效應的敏感性也不同。

兜蘭本身變異系數(shù)較低，主要的繁殖方式為無菌播種，選種周期長[11]，目前未見到利用組培苗進行輻射誘變的報道，對于輻射劑量、植物材料對組培苗生長和發(fā)育的影響以及輻射后植株的變異情況尚不清楚。本研究選用不同時期的兜蘭組培苗作為材料進行60Co-γ輻射誘變，旨在明確60Co-γ射線在種子萌發(fā)、增殖、生根及小苗移栽后生長和生理特性的影響，探討可能發(fā)生的形態(tài)變異，以確定適宜輻照劑量及對兜蘭的誘變效應，為無菌播種、離體快繁與輻射誘變相結合的復合育種技術的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料分別選用無菌播種30天的兜蘭種子、待分化的兜蘭不定芽（高0.8～1.5 cm）、待生根的兜蘭幼苗（高2.0～2.5 cm）以及要移栽的兜蘭小苗。種子處理時選用100粒顆粒飽滿，無病蟲害種子；幼苗分化、生根以及小苗處理時選用100株葉片鮮綠、硬挺、富有光澤的小苗，每個輻照劑量設3個重復。試驗在山東省林業(yè)科學研究院遺傳育種重點實驗室、濟南國際鮮花港智能溫室，于2020年1月—2021年4月份進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 輻射誘變處理 輻射誘變處理劑量設0、5、10、20、30、40 Gy 6個梯度。于山東濟南長清區(qū)泉港輻照中心對植物材料進行輻射處理，輻射劑量率為1.0Gy/min。

1.2.2 指標測定方法

式中：x為輻射劑量；y為幼苗成苗率；N為供試種子數(shù)。

用游標卡尺測量苗高、根長等；根系活力采用TTC檢測方法，脯氨酸的測定主要采用酸性茚三酮比色法，可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法[12]，丙二醛(MDA)和可溶性糖的測定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[13]。

1.2.3 數(shù)據分析 運用Excel 2010、SPSS 22.0進行數(shù)據分析。

2 結果與分析

2.1 輻射處理對兜蘭種子萌發(fā)、幼苗增殖、生根的影響

2.1.1 輻射處理對兜蘭種子萌發(fā)的影響 輻射后兜蘭種子發(fā)芽情況見表1、圖2。隨著輻射劑量的增大，種子發(fā)芽指標呈下降趨勢。輻射劑量為5 Gy時，發(fā)芽率與對照組相比差異不顯著，但成苗率和發(fā)芽勢顯著降低，表明種子已經受到損傷，需要一定修復，萌發(fā)時間延長，后期成苗能力減弱，在10 Gy劑量時，各萌發(fā)指標較其他各組差異極顯著(P＜0.01)，成苗率為對照的62.45%。在20 Gy劑量時，發(fā)芽率、成苗率和發(fā)芽勢較10 Gy下降幅度最大，分別為74.84%、76.56%和74.99%，表明在此劑量輻射下，種子內部結構損傷嚴重，萌發(fā)難度大。在30 Gy、40 Gy劑量時，種子各項發(fā)芽指標差異不顯著，且40 Gy劑量時，種子喪失成苗力。

圖2 不同劑量輻射處理60天的兜蘭種子萌發(fā)情況

表1 不同劑量輻射處理對兜蘭種子萌發(fā)的影響

輻射后的成苗率是衡量輻射損傷效應的重要指標，也是計算其半致死劑量的依據，成苗率與半致死劑量成線性關系，計算回歸方程及相關系數(shù)并繪制標準曲線，見圖1。得出線性方程為y=-1.85x+62.80，R2=0.90。從直線回歸方程中可以求得：當y=50時，x=6.92，即兜蘭種子輻射的半致死劑量LD50=6.92 Gy。

圖1 輻射劑量與成苗率的相關性分析

結合兜蘭種子輻射處理后的各項萌發(fā)指標和計算的半致死劑量，得出兜蘭種子萌發(fā)階段適宜的輻射劑量為5 Gy。

2.1.2 輻射處理對兜蘭不定芽增殖的影響 輻射后兜蘭不定芽增殖情況見表2、圖3。隨著輻射劑量的增大，不定芽增殖率、增殖時間、苗高均呈下降的趨勢。處理90天、120天時，5 Gy劑量下的增殖率、苗高與對照相比差異極顯著(P＜0.01)；150天時，增殖率與對照組相比差異不大，但少數(shù)分化苗葉片濃綠，變厚，植株低矮。10 Gy劑量下3個階段增殖率較其他組差異極顯著(P＜0.01)，處理90天時，苗高與5 Gy劑量差異極顯著(P＜0.01)，隨著時間延長，苗子長勢加快，120天和150天時與5 Gy劑量下差異較小。到150天時，20 Gy、30 Gy劑量下的增殖率差異不顯著，分別為對照組的43.90%、32.92%；分化苗出現(xiàn)花色、細長、卷曲等特征，株型矮化，說明輻射對植株細胞形態(tài)和結構產生影響，誘發(fā)表型變異。但30 Gy時，小苗長勢較弱。40 Gy時，增殖率和苗高較其他組差異極顯著，分化能力幾乎喪失，小苗部分褐化死亡。結合增殖率和表型變異情況，得出兜蘭不定芽增殖階段適宜的輻射劑量為20 Gy。

表2 不同劑量輻射處理對兜蘭分化的影響

圖3 不同劑量輻射處理150天后的兜蘭分化苗

2.1.3 輻射處理對兜蘭不定根分化的影響 輻射后兜蘭不定根分化情況見表3、圖4。隨著輻射劑量的增大，不定根分化時間變長，生根率顯著下降。兜蘭不定根分化階段對輻射處理敏感性較強，輻射后120天、150天，隨著輻射劑量的增大根系活力呈下降趨勢，180天時，隨著輻射劑量的增大根系活力先略升后下降。5 Gy劑量下，120天時生根率為對照的69.55%，根長為對照的64.71%，180天時生根率為對照的77.10%，根長與對照組差異不顯著，說明隨著時間的推移兜蘭對低劑量輻射造成的傷害有一定的修復能力。同時處理180天時根系活力較對照組提高了4.05%，說明低劑量的輻射對根系活力有一定促進作用。10 Gy劑量下，處理180天后的各項指標較5Gy劑量下降幅度大，同時，10、20 Gy劑量下，部分小苗株型矮化、葉片卷曲、開裂，白化、且生長緩慢。30～40 Gy劑量下生根率為0，說明兜蘭不定根分化階段對輻射處理敏感性較強。以此得出，兜蘭不定根分化階段，適宜的輻射劑量為5Gy。

圖4 不同輻射處理150天的下兜蘭生根情況

表3 不同劑量輻射處理對兜蘭不定根分化的影響

2.2 輻射處理對兜蘭小苗的影響

2.2.1 輻射處理對兜蘭小苗生長的影響 將輻射后的兜蘭小苗移栽到溫室中培養(yǎng)，紀錄輻射后生長情況，見表4。與對照組相比，5 Gy劑量下的株高和根系生長量與對照組差異不顯著，葉片鮮綠，長勢好，未見明顯的變異。10 Gy劑量下，少數(shù)出現(xiàn)葉形變異。20 Gy～30 Gy劑量下，株高和根系生長量較對照差異極顯著(P＜0.01)，株型、葉形和葉色都出現(xiàn)明顯變異。但30Gy劑量下，小苗長勢較差。40 Gy劑量下，植株長勢極弱，畸形嚴重，難以維持繼續(xù)生長，結合生長和表型變異情況，得出兜蘭小苗階段適宜的輻射劑量為20 Gy。

表4 不同劑量輻射處理對兜蘭小苗生長的影響

2.2.2 輻射處理對兜蘭小苗電導率和丙二醛的影響 隨著輻射劑量的增大，相對電導率表現(xiàn)出逐漸先升高后下降的趨勢，見圖5。0～20 Gy處理下，各組之間差異極顯著(P＜0.01)。劑量為20 Gy時，達到最大值，與對照相比增加163.33%，差異極顯著(P＜0.01)，20、30、40 Gy劑量下，相對電導率略有下降，差異不顯著。

圖5 不同劑量輻射處理對兜蘭電導率和丙二醛的影響

隨著輻射劑量的增大，MDA含量呈現(xiàn)逐步增加的趨勢，見圖5。輻射劑量為10 Gy時，MDA較前一劑量值增加67.73%，變化幅度較大。當輻射劑量為30 Gy時，MDA達到最大值，較對照組增加268.67%，差異極顯著(P＜0.01)。30、40 Gy劑量時，MDA變化差異不大，說明已接近峰值。

2.2.3 輻射處理對兜蘭小苗滲透調節(jié)物質的影響 隨著輻射劑量的增大，滲透調節(jié)物質呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，見表5?？扇苄蕴恰⒖扇苄缘鞍自谳椛鋭┝繛?0 Gy時，含量最高，分別較對照組增加188.54%和221.85%。與其他組差異極顯著(P＜0.01)。脯氨酸在輻射劑量為30 Gy時達到峰值，較對照組增加了157.39%。20 Gy和30 Gy劑量下差異不顯著。輻射劑量為40 Gy時，可溶性蛋白的含量較對照組減少8.06%，說明輻射劑量達到一定閾值，可溶性蛋白質合成受到嚴重抑制，輻射對小苗的損傷嚴重。

表5 不同劑量輻射處理下兜蘭3種滲透調節(jié)物質的變化情況

2.2.4 輻射處理對兜蘭小苗抗氧化酶活性的影響 隨著輻射劑量的增大，超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性表現(xiàn)為先升高再降低的趨勢，見表6。輻射劑量為10 Gy時，SOD和POD酶活性最高，與對照組相比分別增加190.03%、45.18%，差異極顯著(P＜0.01)。輻射劑量為5 Gy、30 Gy時，SOD和POD活性差異不大，較對照組分別增加109.67%、15.32%。在輻射劑量為40 Gy時，SOD和POD酶的活性均低于對照，說明輻射處理對兜蘭葉片抗氧化酶活性具有一定的促進作用，但當輻射劑量過高時，會減少其活性增加量甚至降低活性值。

表6 不同劑量輻射處理下兜蘭抗氧化酶活性的影響

綜合小苗的生長和各項生理生化指標，得出兜蘭小苗階段適宜的輻射劑量為20 Gy。

3 討論與結論

不同輻射劑量對植物不同發(fā)育時期、不同組織部位產生的影響各不相同，輻射劑量較低，難以獲得預期的誘變效果，但隨著輻射劑量的增加，植株變異率增加，植株死亡率也隨之提高，因此合適的輻射劑量的選擇對提高輻照育種效率具有指導意義[14]。目前對植物輻射育種的研究發(fā)現(xiàn)不同照射材料對射線的敏感性不一，對射線的敏感性大小依次為試管苗＞田間苗＞根芽＞插條＞種子[15]。但試管苗具體發(fā)育時期的適宜輻射劑量并沒有詳細報道。本研究首次采用60Co-γ射線對兜蘭不同發(fā)育時期的植株進行輻射誘變，通過輻射后植株形態(tài)和生理生化指標的變化，篩選適宜的輻射劑量，期望獲得多種變異類型的新材料。

研究發(fā)現(xiàn)兜蘭不同發(fā)育時期對輻射的敏感性差別較大。種子階段和不定根分化階段對60Co-γ的敏感性較高，而不定芽分化和小苗階段的敏感性相對較低。目前沒有明確報道試管苗不同時期對輻射敏感性的差異，因此后續(xù)需要進一步驗證。

隨著輻射劑量的增加，兜蘭種子萌發(fā)率、成苗率、發(fā)芽勢均呈下降趨勢。成苗率明顯小于發(fā)芽率，這是因為輻射對種子內部結構造成損傷，種子雖能發(fā)芽，但生長的抑制作用逐漸表現(xiàn)出來，后期成苗能力降低，這與馮琪等[16]在研究60Co-γ對花葵種子萌發(fā)的影響中的結果一致。隨著輻射劑量的增加，兜蘭不定芽增殖率受到顯著抑制，增殖時間延長，說明輻射后細胞修復需要一定時間，這與王晶等[7]在研究60Co-γ對菊花組培苗誘變效應中的結果一致。對植物進行輻射育種的研究發(fā)現(xiàn)，一定劑量的輻射對植物的生長有促進作用[17]，彭夢婕等[18]在通過研究60Co-γ對紫薇幼苗的輻射效應時發(fā)現(xiàn)，0～60 Gy劑量下，幼苗的葉綠素含量升高，對生長有促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)，5 Gy時，兜蘭分化苗葉片濃綠，變厚，生長健壯，與紫薇的報道類似，但是否有助于提高光合速率，利于光合反應，還需要進一步驗證。輻射劑量超過30 Gy時，增殖率和苗高較對照下降顯著，幼苗出現(xiàn)黃葉、花葉等的變異，長勢弱，推測葉綠體結構遭到破壞，葉綠素含量降低，不利于生長，這與在扁穗雀[19]、大花秋葵和錦葵[20]中的研究結果一致。李瑜等[21]對桂花幼苗的研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的γ射線會使根長和根系活力有一個較小的上升趨勢，本研究中5 Gy劑量下的根系活力較對照組高，與李瑜的報道一致，但根長短于對照組，可能物種差異，導致輻射效應不同。一定劑量的60Co-γ輻射會使植物細胞結構和功能發(fā)生變化，進而引起外部形態(tài)的改變[22-23]。本研究中，兜蘭植株在輻射后出現(xiàn)低矮、花葉，卷曲或裂葉等變異，誘變效應顯著。同樣，60Co-γ輻射對植株外部形態(tài)的改變在菊花、觀賞海棠、水仙、君子蘭、、月季、等[7-8,24-26]都有報道。

植物受到冷害、鹽漬、輻射等逆境時，首先表現(xiàn)在對生物膜系統(tǒng)的傷害，細胞膜透性和選擇性發(fā)生改變或破壞，細胞間的物質轉移發(fā)生紊亂[27-28]。另一方面，生成自由基與活性氧，產生對細胞有毒害作用的物質[29-30]。60Co-γ射線輻射育種研究中，輻射后植物材料的生理生化指標的變化可作為判斷輻射育種效果的依據。本研究中5～20 Gy的劑量下，兜蘭小苗的電導率、滲透調節(jié)物質等增加，MDA含量升高，說明低劑量輻射兜蘭小苗積累滲透調節(jié)物質來增強對逆境的抵抗作用。當輻射劑量為20～30 Gy時，部分滲透調節(jié)物質如可溶性糖、可溶性蛋白含量較峰值略有下降，表明此時兜蘭抵御逆境的機制仍在發(fā)揮作用，但合成效率降低，對輻射的抵御效果減弱。

當輻射劑量為30～40 Gy時，滲透調節(jié)物質含量下降顯著，可能是高劑量的輻射處理對蛋白合成相關基因的表達產生抑制作用。而MDA含量持續(xù)升高，到40 Gy時含量接近平穩(wěn)，說明造成了膜質過氧化損傷，致使機體活性氧與自由基積累增加，從而導致膜結構的完整性被破壞，這與水仙、百合、萵苣[24,31-32]中的結果一致，但在扁穗雀麥、桂花、苜蓿[19,21,33]等植物中MDA呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這與本研究有一定的印證作用，但也有不同之處，可能與材料差異有關。

SOD、POD等抗氧化物酶能夠清除植物在逆境脅迫下產生的活性氧與自由基，但對植物毒害的調節(jié)保護作用存在一定的限度[34]。本研究中，兜蘭的POD、SOD活性，均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，10 Gy時達到最大值，類似結果在紫薇[18]、藍莓[34]、刺梨[35]中也有報道。但在露地菊的輻射研究中發(fā)現(xiàn)SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而POD活性則持續(xù)上升[36]。40 Gy時，二者活性均低于對照組。推測低劑量的射線處理能夠促進一系列修復酶的活性，緩解植物受損程度，而高劑量的射線對組織細胞損傷增加，當活性氧的產生積累超過植株個體的損傷閾值時，酶系統(tǒng)逐漸被破壞致使酶活性降低。

本研究首次探討了60Co-γ對兜蘭不同發(fā)育時期的誘變效應，篩選適宜輻射劑量。研究發(fā)現(xiàn)不同時期的兜蘭組培苗對60Co-γ射線的耐受性不同，輻射處理對兜蘭種子萌發(fā)、不定芽增殖、不定根分化以及小苗生長具有顯著影響，誘導的變異性狀明顯。種子萌發(fā)階段、不定根分化階段對輻射的敏感度較高，適宜的輻射劑量分別為5 Gy。以誘變后成苗率與輻射劑量之間的相關性建立線性回歸方程，得出兜蘭種子半致死劑量為6.92 Gy。不定芽增殖率和小苗移栽階段耐受性相對較高，適宜的輻射劑量為20 Gy。下一步擬對輻射誘變產生的變異苗進行培養(yǎng)，觀察變異的穩(wěn)定性，并進一步從中篩選兜蘭新品種。本研究為兜蘭輻射育種和種質創(chuàng)新提供了理論依據。