楊一山，唐健民，秦惠珍，羅亞進(jìn)，鄧振海，柴勝豐**

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006；2.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541004；3.廣西雅長蘭科植物國家級自然保護(hù)區(qū)管理中心，廣西百色 533209)

1 材料與方法

1.1 材料

蘆丁對照品(B20771-100 mg，上海源葉生物科技有限公司，HPLC≥98%)，無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、L-抗壞血酸、DPPH、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、三羥基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、鹽酸、磷酸鹽緩沖液、三氯乙酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵等試劑均為分析純。臺灣香莢蘭(VanillasomaiHayata)全株采自廣西雅長蘭科植物國家級自然保護(hù)區(qū)。

儀器：TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DL-720E智能超聲波和萬分之一電子分析天平購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋購自金壇雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；QE-100高速粉碎機(jī)購自浙江屹立工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將采集到的臺灣香莢蘭洗凈，在60℃的條件下烘干48 h，粉碎后過60目篩，制成樣品粉末，備用。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取0.012 5 g蘆丁對照品，用60%乙醇定容于25 mL的容量瓶中，搖勻，制成0.500 mg/mL的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品粉末，按照1∶50 (g/mL)的料液比，加入50%乙醇25 mL，在60℃、300 W的條件下超聲輔助提取30 min，過濾，復(fù)提3次，然后定容于100 mL容量瓶中，即得。

1.2.4 最大吸收波長的確定

精密吸取1.2.2節(jié)對照品溶液和1.2.3節(jié)供試品溶液各2 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各瓶中加入5%亞硝酸鈉溶液2 mL，搖勻后放置6 min，加入5%硝酸鋁溶液2 mL，搖勻后放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻后用60%乙醇稀釋至刻度線，放置15 min后，用蒸餾水代替供試品溶液并以相同方法處理后的空白試劑作為參比溶液，于300-600 nm波長下掃描，發(fā)現(xiàn)在510 nm處吸光值最大，故選擇510 nm作為最大吸收波長。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取0.0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL對照品溶液置于25 mL容量中，用60%乙醇加至2.0 mL，按照1.2.4節(jié)方法加樣操作，于510 nm下測定吸光值。以蘆丁的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值作為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。得到回歸方程：y=11.743x+0.002 (R2=0.999 3)。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 提取時間對臺灣香莢蘭總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按照1∶50 (g/mL)的料液比，加入50%乙醇25 mL，在60℃、300 W的條件下分別超聲輔助提取10 min、30 min、60 min、90 min、120 min，過濾，復(fù)提3次，然后定容于100 mL的容量瓶中。之后，按照1.2.4節(jié)方法加樣操作，于510 nm處測定吸光值，最后計(jì)算出不同提取時間下的總黃酮含量。每種處理做3組重復(fù)。選取最佳提取時間，進(jìn)行下一步單因素試驗(yàn)。

1.3.2 乙醇濃度對臺灣香莢蘭總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按照1∶50 (g/mL)的料液比，分別加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇25 mL，在60℃、300 W的條件下分別超聲輔助提取30 min，過濾，復(fù)提3次，然后定容于100 mL的容量瓶中。之后，按照1.2.4節(jié)方法加樣操作，于510 nm處測定吸光值，最后計(jì)算出總黃酮含量。每種處理做3組重復(fù)。選取最佳乙醇濃度，進(jìn)行下一步單因素試驗(yàn)。

1.3.3 料液比對臺灣香莢蘭總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取樣品粉末0.5 g，按照1∶20 (g/mL)、1∶30 (g/mL)、1∶40 (g/mL)、1∶50 (g/mL)、1∶60 (g/mL)的料液比，加入50%乙醇，在60℃、300 W的條件下分別超聲輔助提取30 min，過濾，復(fù)提3次，然后定容于100 mL的容量瓶中，之后，按照1.2.4節(jié)方法加樣操作，于510 nm處測定吸光值，最后計(jì)算出總黃酮含量。每種處理做3組重復(fù)。

1.4 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。以提取時間(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)為自變量，以臺灣香莢蘭的總黃酮含量(Y)為考察指標(biāo)，共計(jì)17個試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行組合試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.5 抗氧化活性的測定

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，采用最佳提取工藝對臺灣香莢蘭中的總黃酮進(jìn)行提取，并將提取液(0.059 5 mg/mL)稀釋成0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL 5個濃度的樣品測試液，用于對臺灣香莢蘭總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行綜合評價。

1.5.1 臺灣香莢蘭總黃酮對DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力的測定參考宋佳敏等[7]的方法，并稍做調(diào)整。分別取5個濃度的4 mL樣液于試管中，加入等體積的0.1 mmol/L的DPPH溶液，充分混勻后，在室溫下避光保存30 min，用無水乙醇作參比溶液(下同)，于517 nm處測定樣品液中的吸光值，記為A1；4 mL樣液與無水乙醇等體積混合后測定吸光值，記為A2；用4 mL蒸餾水代替樣液，與4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液混合后測定吸光值，記為A0。以相同濃度的L-抗壞血酸作陽性對照。

1.5.2 臺灣香莢蘭總黃酮對羥基自由基(·OH)清除能力

羥基自由基(·OH)清除能力的測定參考Fenton反應(yīng)體系[8]，并稍做調(diào)整。取2.0 mL不同濃度梯度的樣品溶液，依次加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL蒸餾水，充分混勻后加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2溶液來啟動反應(yīng)，在37℃恒溫水浴30 min后，用蒸餾水作參比溶液(下同)，于510 nm處測定吸光值，記為As；用1.0 mL蒸餾水代替H2O2溶液處理的樣品溶液，測定的吸光值記為Ab；用2.0 mL蒸餾水代替樣品溶液，測定的吸光值記為Ap。以相同濃度梯度的L-抗壞血酸作陽性對照。

羥基自由基(·OH)清除率(%)=

1.5.3 臺灣香莢蘭總黃酮對超氧陰離子自由基

1.5.4 臺灣香莢蘭總黃酮總還原力測定

總還原力的測定參考朱成豪等[10]的方法。取2.0 mL不同濃度梯度的樣品溶液，先加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH值為6.6)，再加入2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后在50℃條件下水浴20 min，迅速冷卻，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液來終止反應(yīng)。取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL的蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，混勻，靜置10 min后，用蒸餾水作參比溶液，于700 nm下測定吸光值。以相同濃度梯度的L-抗壞血酸作陽性對照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，繪圖采用Origin 2019軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時間對臺灣香莢蘭總黃酮含量的影響

由圖1可知，臺灣香莢蘭的總黃酮含量隨著提取時間的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在提取時間為30 min時，總黃酮含量到達(dá)最高值1.053%，之后，隨著提取時間繼續(xù)增加，總黃酮的含量則逐漸降低。

圖1 提取時間對臺灣香莢蘭總黃酮含量的影響

2.1.2 乙醇濃度對臺灣香莢蘭總黃酮含量的影響

由圖2可知，臺灣香莢蘭總黃酮含量隨著乙醇濃度增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在乙醇濃度為50%時，總黃酮含量達(dá)到最高值1.250%。在此之后，隨著乙醇濃度繼續(xù)增加，總黃酮含量逐漸降低。

圖2 乙醇濃度對臺灣香莢蘭黃酮含量的影響

2.1.3 料液比對臺灣香莢蘭總黃酮含量的影響

由圖3可知，臺灣香莢蘭總黃酮含量隨著料液比的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)料液比增加到1∶50 (g/mL)時，總黃酮含量達(dá)到最高值0.962%，當(dāng)料液比繼續(xù)增加時，總黃酮含量呈現(xiàn)降低的趨勢。

圖3 料液比對臺灣香莢蘭總黃酮含量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表1設(shè)定的水平和因素，共計(jì)17個試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個為析因點(diǎn)，5個為零點(diǎn)。各個水平下總黃酮含量見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

利用Design Expert 8.0.6 軟件，對A、B、C 3個因素進(jìn)行交互并分析比較，分別做出AB、AC、BC 3個等高線圖和響應(yīng)面三維曲線圖。由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著各因素數(shù)值的增加，總黃酮含量(響應(yīng)值)也會隨之增加；達(dá)到最高點(diǎn)后隨著各因素數(shù)值繼續(xù)增加，總黃酮含量(響應(yīng)值)則會減少。坡度的大小，表明兩個因素的交互程度，坡度越大，兩個因素的交互作用就越強(qiáng)，反之則弱。兩個因素形成的等高線越接近橢圓形，表示兩者的交互作用越顯著。由此可知，提取時間(A)與乙醇濃度(B)的交互效果大于提取時間(A)和料液比(C)的交互效果，大于乙醇濃度(B)和料液比(C)的交互效果，即AB>AC>BC。

圖4 交互因素對臺灣香莢蘭總黃酮含量影響的響應(yīng)面圖

2.2.3 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上響應(yīng)面模型和結(jié)果分析，得出臺灣香莢蘭總黃酮的最佳提取條件：提取時間為37.5 min，乙醇濃度為45.6%，料液比為1∶50.7 (g/mL)。在此條件下，模型預(yù)測臺灣香莢蘭的總黃酮含量為1.22%。為方便試驗(yàn)，將試驗(yàn)條件調(diào)整為38 min，乙醇濃度為46%，料液比為1∶51 (g/mL)，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到臺灣香莢蘭總黃酮的實(shí)際含量為1.19%，RSD值為0.65%(n=3)，與模型預(yù)測含量相差0.03%，表示該模型具有較高的可靠性，且提取工藝的重現(xiàn)性較好。

2.3 臺灣香莢蘭總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 對DPPH自由基清除能力

圖5 臺灣香莢蘭總黃酮對DPPH自由基清除能力

2.3.2 對羥基自由基清除能力

圖6 臺灣香莢蘭總黃酮對羥基自由基(·OH)的清除能力

圖7 臺灣香莢蘭總黃酮對超氧陰離子自由基的清除能力

2.3.4 總還原力

圖8 臺灣香莢蘭總黃酮的總還原力

3 討論

目前，總黃酮的提取方法主要有乙醇回流提取法、浸提法、超聲輔助提取法和超臨界萃取法等。本研究以臺灣香莢蘭為原料，采用超聲輔助提取法提取其總黃酮。超聲輔助提取是利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)以及熱效應(yīng)，加速分子的運(yùn)動速度和穿透力，從而增加有效物質(zhì)的溶出，超聲輔助提取相對于其他提取方法，如回流法、浸漬法等，具有提取效率高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。本研究將乙醇作為總黃酮的提取溶劑，符合黃酮類化合物易溶于乙醇等有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，在一定范圍內(nèi)，總黃酮的含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)超過一定限度后，過高的乙醇濃度使植物細(xì)胞外的滲透壓大于細(xì)胞內(nèi)，從而限制有效物質(zhì)的溶出；就提取時間而言，一方面提取時間的增加一定程度上可以增加總黃酮的溶出，使提取效率提高，另一方面，超聲時間的延長，可能會使部分黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被破壞以及增加其他類型化合物溶出，從而降低黃酮類化合物的含量；適當(dāng)?shù)牧弦罕瓤梢栽黾幽繕?biāo)產(chǎn)物的溶出，而過大的料液比不但使產(chǎn)物的含量下降，還會造成溶劑的浪費(fèi)。本研究通過單因素試驗(yàn)得到最佳試驗(yàn)點(diǎn)，再經(jīng)過軟件設(shè)計(jì)得到17個試驗(yàn)線和完整連續(xù)的面，最終在面中得到最佳值。通過響應(yīng)面試驗(yàn)，不僅可以使目標(biāo)產(chǎn)物的提取率達(dá)到最大，還節(jié)省了生產(chǎn)成本。

通過研究發(fā)現(xiàn)，臺灣香莢蘭中總黃酮的含量為1.19%，其總黃酮的還原能力為L-抗壞血酸的79.2%，對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的IC50值分別為0.012 3 mg/mL、0.015 9 mg/mL、0.032 6 mg/mL。與廣東石豆蘭[11]、石仙桃(PholidotachinensisLindl.)[12]等蘭科藥用植物相比，臺灣香莢蘭中的總黃酮具有較為突出的抗氧化能力，但總黃酮的類型還不明確，需要進(jìn)一步分離和鑒定。

4 結(jié)論

本研究采用超聲輔助提取的方法，對臺灣香莢蘭中的總黃酮進(jìn)行提取與測定，并采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面交互試驗(yàn)相結(jié)合的方法，得出3個單因素對臺灣香莢蘭中總黃酮含量的影響大小為乙醇濃度(B)>提取時間(A)>料液比(C)，并確定了臺灣香莢蘭中總黃酮的最佳提取條件：提取時間為37.5 min，乙醇濃度為45.6%，料液比為1∶50.7 (g/mL)。在最佳提取條件下，臺灣香莢蘭中總黃酮的實(shí)際含量為1.19%，與預(yù)測值相差0.03%。臺灣香莢蘭總黃酮的還原能力為L-抗壞血酸的79.2%，對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的IC50值分別為0.012 3 mg/mL、0.015 9 mg/mL、0.032 6 mg/mL，表明臺灣香莢蘭總黃酮具有較好的抗氧化活性，具有很好的開發(fā)利用前景。