孫博文 黃耀 孫亞亭 劉麒 鄭莉娜 孫沛 錢春桃

摘要： 旨在系統(tǒng)地研究通過遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合胚培養(yǎng)獲得甜瓜雙單倍體的方法，以拓寬甜瓜雙單倍體獲得路徑。以西印度瓜（ Cucumis ??anguria ?L.）為遠(yuǎn)緣花粉供體，對厚皮甜瓜阿魯斯達(dá)令進(jìn)行授粉，并結(jié)合胚培養(yǎng)方法進(jìn)行研究，以期獲得厚皮甜瓜阿魯斯達(dá)令的雙單倍體。結(jié)果表明，對阿魯斯達(dá)令甜瓜進(jìn)行遠(yuǎn)緣授粉后如果不作處理，子房會(huì)全部敗育，而對子房表面涂抹坐果靈后坐果率可達(dá)73.33%;授粉28 d后，共采收22個(gè)遠(yuǎn)緣雜交果實(shí)，累計(jì)獲得359粒種子;胚培養(yǎng)后獲得4株再生植株，再生植株占比為1.11%;通過流式細(xì)胞儀鑒定得出，再生植株有二倍體、混倍體2種類型。對比二倍體再生植株和母本阿魯斯達(dá)令發(fā)現(xiàn)，二倍體再生苗的葉、花較小，植株長勢較弱，果實(shí)較圓，平均花粉活力較低。對二倍體再生植株R3、母本阿魯斯達(dá)令自交1代（S1 代）群體形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行遺傳變異系數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，R3 S1 代群體各項(xiàng)指標(biāo)的遺傳變異系數(shù)均遠(yuǎn)低于母本阿魯斯達(dá)令S1 代群體。利用篩選出的2對在阿魯斯達(dá)令基因組中具有多態(tài)性的簡單重復(fù)序列（SSR）引物CMATN240、CMCTN71對R3 S1 代群體進(jìn)行基因型分析，結(jié)果表明，20株R3 S1 代群體均為純合帶型。通過形態(tài)學(xué)鑒定、SSR分子標(biāo)記鑒定分析發(fā)現(xiàn)，獲得的再生植株R3為雙單倍體。由研究結(jié)果可知，通過遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合胚培養(yǎng)獲得了甜瓜再生植株，通過細(xì)胞流式儀倍性鑒定、SSR標(biāo)記分析與S1 代群體性狀遺傳變異系數(shù)鑒定得出，再生植株為雙單倍體。

關(guān)鍵詞： 厚皮甜瓜; 遠(yuǎn)緣雜交; 胚培養(yǎng); 雙單倍體

中圖分類號(hào)： S652.036?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?? 文章編號(hào)： 1000-4440（2022）03-0775-07

Production of doubled haploid in muskmelon Earl’s Darling by interspecific hybridization and embryo culture

SUN Bo-wen 1 ， HUANG Yao 1，2 ， SUN Ya-ting 1 ， LIU Qi 1，2 ， ZHENG Li-na 1 ， SUN Pei 1 ， QIAN Chun-tao 1

（1.College of Horticulture， Nanjing Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Innovation， Nanjing 210095， China; 2.New Rural Development Research Institute of Nanjing Agricultural University， Suzhou 215500， China）

Abstract： This article systematically studied the method of obtaining doubled haploid of melon through interspecific hybridization and embryo culture to broaden the way of obtaining doubled haploids. In this study， ?Cucumis anguria ?L. was used as a distant pollen donor to pollinate the thick-skinned muskmelon Earl’s Darling， and embryo culture method was combined to obtain doubled haploids. The results showed that all ovaries were aborted after distant pollination， and the fruit setting rate could reach 73.33% after applying 4-chlorophenoxyacetic acid. After 28 days of pollination， 22 distant hybrid fruits were harvested， and 359 seeds were obtained. Four regenerated plants were obtained after embryo culture， and the proportion of regenerated plants was 1.11%. Flow cytometry identified two types of regenerated plants， diploid and mixoploid. Compared with the female parent， the leaves and flowers of diploid regenerated seedlings were smaller， plant growth was weaker， fruits were rounder， and average pollen vigor was lower. The genetic variation coefficients of the S1 ?generation of the diploid regenerated plant R3 and the female parent Earl’s Darling were compared， and it was found that the genetic variation coefficients of the indicators of the R3 S1 ?population were far lower than those of the female parent Earl’s Darling S1 ?population. Two pairs of polymorphic simple sequence repeat （SSR） primers CMATN240 and CMCTN71 were selected to perform genotype analysis of the R3 S1 ?population， the results showed that the 20 R3 S1 ?populations were all homozygous. Morphological identification and SSR molecular marker identification analysis showed that the regenerated plant R3 obtained in this study was a double haploid. The regenerated plants of muskmelon were obtained by distant hybridization and embryo culture. The results of flow cytometry， SSR marker analysis and genetic variation coefficient of S1 ?population traits show that the regenerated plants are doubled haploids.

Key words： muskmelon; interspecific hybridization; embryo culture; doubled haploid

甜瓜（ Cucumis melo ?L.）為葫蘆科甜瓜屬一年生作物，可分為厚皮甜瓜、薄皮甜瓜兩大類。厚皮甜瓜果形獨(dú)特、芳香味濃，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是其生長發(fā)育喜好空氣干燥、光照充足、晝夜溫差大的大陸性氣候條件，因此在20世紀(jì)80年代前僅種植于中國新疆、甘肅等西北地區(qū) [1] 。隨著“厚皮甜瓜東移”工程的開展，厚皮甜瓜逐漸成為東部沿海地區(qū)的重要栽培作物 [2] 。栽培面積的擴(kuò)大對品種培育提出了更高要求，傳統(tǒng)育種方式選育周期長、工作量大，而利用單/雙單倍體（Haploid/doubled haploid，H/DH）進(jìn)行育種，可以縮短育種年限、提高育種效率。

在甜瓜中，培育單倍體/雙單倍體的方法包括利用輻射花粉授粉 [3] 、未受精子房離體培養(yǎng) [4] 、花藥培養(yǎng) [5] 等，其中輻射花粉培養(yǎng)被認(rèn)為是最成熟實(shí)用的方法 [6] 。目前，國外已經(jīng)有多個(gè)優(yōu)異雙單倍體材料用于甜瓜育種 [7-9] ，其中不少源于厚皮甜瓜 [7， 10-11] ，也有學(xué)者系統(tǒng)地研究了DH植株的性狀特征 [12] ，這些研究結(jié)果為將甜瓜雙單倍體用于育種研究奠定了基礎(chǔ)。國內(nèi)學(xué)者韓麗華 [13] 和高寧寧等 [14] 分別通過離體胚珠、子房培養(yǎng)獲得了單倍體，并通過染色體加倍獲得了厚皮甜瓜雙單倍體。但是，目前國內(nèi)有關(guān)甜瓜雙單倍體特征特性的研究仍很少 [12， 15] 。

目前，關(guān)于小麥 [16] 、大麥 [17] 、玉米 [18] 、油菜 [19] 等大田作物遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合胚培養(yǎng)誘導(dǎo)雙單倍體的研究已經(jīng)有一定進(jìn)展。De Vaulx ?[20] 曾利用種間雜交培育出甜瓜單倍體，其后就再未見相關(guān)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在參考大田作物相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，利用甜瓜近緣野生種西印度瓜（ C. anguria ?L.）對厚皮甜瓜阿魯斯達(dá)令進(jìn)行遠(yuǎn)緣授粉，結(jié)合胚培養(yǎng)培育厚皮甜瓜雙單倍體，并對其特征特性進(jìn)行研究。本研究通過系統(tǒng)地研究利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)培育甜瓜雙單倍體的途徑，可以在理論、實(shí)踐上為甜瓜育種提供更多有益支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

厚皮甜瓜阿魯斯達(dá)令由上海惠和種業(yè)有限公司提供，是由日本引進(jìn)的網(wǎng)紋甜瓜F1 代品種;野生種西印度瓜由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葫蘆科作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)材料種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院有限公司溫室大棚。2020年3月中旬播種育苗，4月初定植，進(jìn)行常規(guī)栽培管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 遠(yuǎn)緣雜交 在開花前1 d的16∶00- 17∶00 ，選取第2 d要開放的阿魯斯達(dá)令雌花（完全花），進(jìn)行去雄套袋隔離處理，同時(shí)選取第2 d要開放的西印度瓜雄花進(jìn)行套袋隔離。第2 d 8∶00 用3朵西印度瓜雄花對1朵阿魯斯達(dá)令雌花授粉，授粉后套袋。通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)緣授粉后甜瓜很難坐果，于是在授粉后設(shè)置涂抹、不涂抹25 mg/L 坐果靈（4-Chlorophenoxyacetic acid， PAPC） [21] 2種處理方式（涂抹位置為雌花果梗處）。14 d后統(tǒng)計(jì)坐果率。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每次授粉10朵雌花。授粉后4～ 5 h在柱頭噴施10 mg/L ??N -苯基- N ′-1， 2， 3-噻二唑-5-脲（TDZ），以促進(jìn)幼胚發(fā)育 [22] 。相關(guān)公式：

坐果率=坐果數(shù)/授粉雌花數(shù)×100%。

1.2.2 胚培養(yǎng)及再生植株馴化 授粉后28～ 35 d收取果實(shí)。用流水沖洗果實(shí)10 min后在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇對果皮進(jìn)行表面消毒。剖開消毒后的果實(shí)，取出種子，用刀片刮除種子表面的瓜囊組織，將種子接種于裝有MS固體培養(yǎng)基的組培瓶（容量為350 ml）中（接種量為1瓶20～ 30粒種子），再將組培瓶轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室中培養(yǎng)。在MS基本培養(yǎng)基中添加3%蔗糖、8%瓊脂，調(diào)節(jié)溶液pH值為5.8～ 6.0 [23] 。培養(yǎng)條件：溫度（25± 1） ℃、光照度2 000 ?lx、光/暗周期16 h/8 h。

待再生植株長出3～ 5張真葉，并且根系長到3～ 5 cm長時(shí)進(jìn)行幼苗馴化。在3 d內(nèi)逐漸打開瓶蓋，完成再生植株的瓶內(nèi)馴化后取出再生植株，洗凈根系附著的培養(yǎng)基，用2%多菌靈溶液浸泡根30 s [24] ，隨后將再生植株移入含已滅菌基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，澆透水，待幼苗有新葉長出時(shí)移栽到大棚內(nèi)。

1.2.3 倍性的鑒定 參考汪艷等 [25] 的方法，選取再生植株幼嫩葉片作為測定材料，委托金迪未來生物科技（北京）有限公司采用流式細(xì)胞儀鑒定再生植株的倍性。

1.2.4 二倍體再生植株的形態(tài)學(xué)觀察 選取倍性鑒定為二倍體的再生植株，對二倍體再生植株、母本阿魯斯達(dá)令的葉、花、果實(shí)等形態(tài)特征進(jìn)行對比觀察。

1.2.5 二倍體再生植株花粉活力的測定 分別取二倍體再生植株、母本阿魯斯達(dá)令的雄花花粉于載玻片上，加1～2滴1%醋酸洋紅溶液，搖勻后蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下檢測，深紅色的花粉表示有活力，無色或淡紅色的花粉表示沒有活力。每片隨機(jī)選擇3個(gè)視野，按照下式統(tǒng)計(jì)花粉生活力 [26] ：

花粉生活力=活花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)×100%。

1.2.6 二倍體再生植株自交后代整齊性鑒定 變異系數(shù)（ CV ）可以表示群體內(nèi)某一性狀的離散程度，變異系數(shù)越小，表示性狀的一致性越高 [27] 。因此，可以利用二倍體再生植株自交后代的整齊性進(jìn)一步判斷其純合性。分別選取20株二倍體再生植株R3自交后代和阿魯斯達(dá)令自交后代，測量節(jié)間距、莖粗、最大葉長和葉寬，按下式計(jì)算 CV ：

CV=S/x- ×100

式中： S 為標(biāo)準(zhǔn)差; x- 為某性狀的均值。

1.2.7 二倍體再生植株自交后代簡單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記的鑒定 利用SSR標(biāo)記的共顯性特點(diǎn)鑒定二倍體再生植株的純合性。從葫蘆科作物基因組數(shù)據(jù)庫的30對標(biāo)記中篩選出2對在母本擴(kuò)增產(chǎn)物中顯示雜合條帶的引物（表1）。用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取親本材料阿魯斯達(dá)令和20株R3 S1 代植株葉片的DNA，SSR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。20 μl擴(kuò)增反應(yīng)體系：1 μl模板DNA，10.0 μl 2×? Taq ?master mix，各1 μl上、下游引物，7 μl ddH2 O。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀中進(jìn)行，PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。產(chǎn)物用1%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 坐果靈對遠(yuǎn)緣雜交坐果率的影響

以西印度瓜為父本，對阿魯斯達(dá)令進(jìn)行授粉后，對子房表面進(jìn)行涂抹、不涂抹坐果靈溶液2種處理。如表2所示，2種處理方式的甜瓜坐果率差異顯著，不涂抹坐果靈的甜瓜子房敗育，3 d內(nèi)子房發(fā)黃，坐果率為0;涂抹坐果靈處理顯著提高了甜瓜的坐果率，坐果率可達(dá)73.33%。由此可見，通過對甜瓜進(jìn)行遠(yuǎn)緣授粉后，涂抹坐果靈處理可以提高坐果率，提高了幼胚發(fā)育的概率。

2.2 胚培養(yǎng)和倍性鑒定

授粉28 d后，采收22個(gè)甜瓜果實(shí)，累計(jì)獲得359粒種子。將收獲的種子接種在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后觀察可知，種子均萌發(fā)出肉眼可見的綠色胚（圖1A）;繼續(xù)培養(yǎng)7 d后，幼胚突出種皮，萌發(fā)出芽（圖1B），共有4個(gè)胚萌發(fā)，將其轉(zhuǎn)移到1/2 ?MS培養(yǎng)基中單獨(dú)培養(yǎng)后，這些胚均長出了根，最后均發(fā)育成完整植株，分別命名為R1、R2、R3、R4，統(tǒng)計(jì)可知，再生植株占比為1.11%。

如圖2所示，用DNA流式細(xì)胞儀對獲得的4株再生植株進(jìn)行倍性鑒定，測定結(jié)果顯示，再生植株同時(shí)存在二倍體和混倍體，其中R3、R4為二倍體，R1、R2為混倍體。

2.3 二倍體再生植株R3、R4形態(tài)特征和花粉活力

觀察發(fā)現(xiàn)，二倍體再生植株R3、R4和母本阿魯斯達(dá)令在形態(tài)上有明顯區(qū)別。由圖3可以看出，與母本阿魯斯達(dá)令相比，二倍體再生植株R3、R4的葉片、花瓣較小，果實(shí)較圓，且R3、R4植株長勢較弱;二倍體再生植株R3和R4之間在葉色、葉形、花形等方面有差異，可能因?yàn)樗鼈兪怯刹煌渥影l(fā)育而來的。由表3可以看出，二倍體再生植株R3、R4的雄花單位面積花粉數(shù)、花粉平均生活力均遠(yuǎn)低于母本阿魯斯達(dá)令的相應(yīng)指標(biāo)。

2.4 R3自交S1 代整齊性鑒定

將再生植株R3、R4進(jìn)行自交留種，各自自交授粉3朵雌花，每3朵雄花授粉1朵雌花。授粉45 d后，R3采收1個(gè)果實(shí)，累計(jì)獲得20粒飽滿的種子;R4植株僅有1朵雌花，自交后未坐果。本試驗(yàn)對雜交種阿魯斯達(dá)令S1 代、再生植株R3 S1 代群體的節(jié)間距、莖粗、最大葉長和最大葉寬這4個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行變異系數(shù)分析。由表4可以看出，R3 S1 代群體的節(jié)間距、莖粗、最大葉長和最大葉寬的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于阿魯斯達(dá)令S1 代群體。變異系數(shù)代表性狀觀測數(shù)值的變異程度，較小的變異系數(shù)意味著群體存在較小的變異，整齊度高，基因型的純合度高。

2.5 R3自交S1 代的SSR標(biāo)記分析

從30對引物中篩選到在母本阿魯斯達(dá)令、R3 S1 代群體間具有多態(tài)性的引物CMATN240、CMCTN71。利用2個(gè)SSR標(biāo)記對母本阿魯斯達(dá)令、R3 S1 代群體進(jìn)行帶型分析。如圖4所示，原始母本阿魯斯達(dá)令均為雙帶型（雜合帶型），而20株R3 S1 代群體均為單帶型（純合帶型）。由此可見，R3為雙單倍體。進(jìn)一步計(jì)算可知，在本研究中，雙單倍體誘導(dǎo)率為0.28%[雙單倍體數(shù)（1株）/接種種子數(shù)（359粒）× 100%= 0.28%]。

3 討 論

本研究建立的通過遠(yuǎn)緣雜交結(jié)合胚培養(yǎng)獲得厚皮甜瓜的雙單倍體技術(shù)，拓寬了甜瓜雙單倍體的培育途徑，對于創(chuàng)制甜瓜育種材料和提高育種效率具有重要意義。目前的國內(nèi)外報(bào)道顯示，輻射花粉授粉是誘導(dǎo)甜瓜單/雙單倍體最有效的途徑。在本試驗(yàn)中，遠(yuǎn)緣雜交再生植株率為0.28%，與張永兵等 [28] 得出的輻射花粉授粉誘導(dǎo)率（0.29%）相似，低于薛皓等 [29] 報(bào)道的1.09%。然而，本研究可以直接形成雙單倍體，不需要單倍體染色體加倍環(huán)節(jié)，減少了操作環(huán)節(jié)，降低了技術(shù)難度。

在本研究中，R4植株僅出現(xiàn)1朵雌花，且未能坐果。DH株系育性變異的現(xiàn)象在雙單倍體群體中并不罕見。陳英等 [30] 認(rèn)為，秈粳雜交F1代的DH植株后代部分存在胚囊或者花粉敗育的現(xiàn)象;有研究者通過對水稻DH群體的研究發(fā)現(xiàn)植株出現(xiàn)雄性不育和花器官發(fā)育正常的現(xiàn)象，而對雌花授予正常的花粉后，雌花可以結(jié)實(shí) [31] ;謝冰等 [32] 認(rèn)為，DH株系發(fā)生育性不良的現(xiàn)象可能由于胚狀體發(fā)育過程中出現(xiàn)了變異，進(jìn)而導(dǎo)致育性降低。今后可通過激素調(diào)節(jié)改善植株的育性 [33] ，以進(jìn)一步促進(jìn)DH植株的應(yīng)用。研究者通過對葫蘆科作物單倍體的研究，獲得了二倍體和混倍體，如Przyborowski等 [34] 在用黃瓜輻射花粉授粉誘導(dǎo)過程中獲得了二倍體和混倍體，該作者認(rèn)為，這一現(xiàn)象與胚拯救過程中胚的染色體自發(fā)加倍有關(guān)。Kurtar等 [35] 發(fā)現(xiàn)，南瓜單倍體比較容易在子葉型胚形成以前獲得，子葉型胚大多是染色體已加倍的二倍體或混倍體。本試驗(yàn)只獲得二倍體和混倍體的再生植株，推測可能與培養(yǎng)的時(shí)期較靠后有關(guān)。本研究中的接種過程在授粉后28 d，此時(shí)絕大多數(shù)幼胚發(fā)生敗育，形成空殼種子，而沒有敗育的胚已發(fā)育為成熟的子葉型胚，即本研究中的綠胚。因此，在今后研究中，為了提高出胚成苗率并避免混倍體出現(xiàn)，胚培養(yǎng)的時(shí)間可以適當(dāng)提前。

在禾本科植物中，通常采用外源激素促進(jìn)幼胚發(fā)育。TDZ是一種人工合成的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有生長素、細(xì)胞分裂素的雙重作用，可以調(diào)節(jié)植物內(nèi)源激素來誘導(dǎo)幼胚發(fā)育 [36] 。在田間遠(yuǎn)緣授粉后，筆者對甜瓜的子房柱頭涂抹TDZ，隨后用胚拯救技術(shù)，最后成功獲得4個(gè)胚，表明外源TDZ在甜瓜上也能促進(jìn)幼胚發(fā)育。

當(dāng)栽培環(huán)境相同時(shí)，遺傳變異系數(shù)是衡量群體遺傳穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，變異系數(shù)小的群體的遺傳基礎(chǔ)較單純。馮建云 [37] 對羽衣甘藍(lán)雜交F1 代群體及用其小孢子通過離體培養(yǎng)獲得的DH群體進(jìn)行了數(shù)量性狀變異系數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)DH群體各項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)均遠(yuǎn)小于F1 代群體，且整齊度高。本研究是在同一地塊進(jìn)行的，肥力和環(huán)境相同，環(huán)境因素差異帶來的影響可以忽略不計(jì)。本研究獲得的R3 S1 代群體典型數(shù)量性狀的變異系數(shù)遠(yuǎn)低于雜交種阿魯斯達(dá)令S1 代群體，整齊度高，可能為DH系。同時(shí)，本試驗(yàn)利用篩選出的2對SSR引物對R3 S1 代群體進(jìn)行純合分析，發(fā)現(xiàn)20株R3的自交后代在這2個(gè)位點(diǎn)（由CMATN240、CMCTN7引物擴(kuò)增出）都是純合的，證明獲得的二倍體再生植株R3是雙單倍體。

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（責(zé)任編輯：徐 艷）

收稿日期：2021-08-30

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)新項(xiàng)目（PZCZ201718）

作者簡介：孫博文（1997-），男，河南許昌人，碩士，研究方向?yàn)槭卟诉z傳育種與生物技術(shù)。（E-mail）2372765736@qq.com。黃耀為共同第一作者。

通訊作者：錢春桃，（E-mail）chuntaoq@njau.edu.cn