細(xì)菌1a51對三種對羥基苯甲酸酯類防腐劑的降解

李海普，袁娜迪，李 躍

(中南大學(xué)a.化學(xué)化工學(xué)院;b.環(huán)境與水資源研究中心，湖南 長沙 410083)

對羥基苯甲酸酯(paraben)是一類廣泛用于個人護(hù)理品、食品和藥物中的防腐劑[1-2].它在世界各地的自然地表水中被廣泛檢測到[3].Paraben對自然水體中的生物具有一定的毒性[4].同時paraben容易通過生態(tài)循環(huán)被人體吸收從而對人類健康產(chǎn)生危害[5-7].目前發(fā)現(xiàn)paraben對人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)具有較大危害，可能會導(dǎo)致人體患上癌癥[8-9].因此生態(tài)系統(tǒng)中paraben類污染物的去除顯得十分重要.

目前paraben類物質(zhì)的去除主要發(fā)生在污水處理廠中.污水處理技術(shù)主要分為物理法[10]、化學(xué)法[11]、生物法[12].其中物理法存在設(shè)備成本和能耗高，化學(xué)法存在催化劑成本高和工藝復(fù)雜的不足之處.隨著生物法的發(fā)展，微生物降解技術(shù)因為其獨特的優(yōu)勢而被應(yīng)用于paraben的降解[13].例如，Valkova等[14]從一種商業(yè)膳食礦物質(zhì)補(bǔ)充劑中分離出的陰溝腸桿菌菌株能夠在15 min內(nèi)完全降解6.6 mmol/L的對羥基苯甲酸甲酯.

本研究選取paraben中常見的3種物質(zhì)(對羥基苯甲酸乙酯(EtP)、對羥基苯甲酸丙酯(PrP)和對羥基苯甲酸丁酯(BuP))作為目標(biāo)污染物，用實驗室從活性污泥中分離出的細(xì)菌1a51對其進(jìn)行降解，研究了工藝條件對細(xì)菌1a51降解目標(biāo)污染物的影響，并考察了該降解在不同水體中的應(yīng)用情況.研究結(jié)果將為微生物法降解環(huán)境中的paraben提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)備

SHA-CA型水浴恒溫振蕩器(常州普天儀器制造有限公司)，Waters-2998型高效液相色譜(美國沃特世有限公司)，AR224CN型精密電子天平(奧豪斯儀器有限公司)，UPT-Ⅱ-10T型超純水機(jī)(四川優(yōu)普設(shè)備儀器有限公司)，HCB-1300V型超凈工作(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)，PHS-25型pH計(雷磁電科學(xué)儀器有限公司)，SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博訊實驗有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，YXQ-100G型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實驗有限公司醫(yī)療設(shè)備廠).

1.2 實驗試劑

Mn(NO3)2、Zn(NO3)2·6H2O、Cu(NO3)2、Ni(NO3)2、Co(NO3)2·6H2O和Cd(NO3)2·4H2O購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，NaOH和HCl購自西隴化工股份有限公司.EtP、PrP和BuP購自上海麥克林試劑公司，實驗中使用的超純水(UP水)用超純水機(jī)現(xiàn)制現(xiàn)用.實驗培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基信息見表1.

表1 實驗所用的培養(yǎng)基

1.3 實驗及儀器分析方法

1.3.1 降解實驗方法

實驗室采用平板劃線法，經(jīng)過四代的分離和純化，最終從活性污泥中提取到一株對paraben具有降解特性的實驗細(xì)菌.根據(jù)培養(yǎng)過程中從每代編號的培養(yǎng)基中逐一提純的順序，將該菌株命名為1a51[15-16].對該菌株進(jìn)行16SrDNA分子學(xué)鑒定，在NCBI(national center of biotechnology information)網(wǎng)站上進(jìn)行同源基因序列比對(Blast)和分析發(fā)現(xiàn)，該菌株屬于表皮葡萄球菌屬(Staphylococcus epidermidis)[17].細(xì)菌1a51降解EtP、PrP和BuP的實驗采用控制變量法，在細(xì)菌生長48 h后加入3種目標(biāo)污染物，保持培養(yǎng)基條件不變，每間隔1 h從培養(yǎng)基中取1 mL溶液，然后通過高效液相色譜采用外標(biāo)法來測定溶液中目標(biāo)污染物的濃度.所有工作在超凈工作臺里完成,實驗中設(shè)置3個平行對照組.

1.3.2 儀器分析方法

采集的溶液樣品需要經(jīng)過離心機(jī)離心，取其上清液經(jīng)過0.22 μm針式過濾器過濾后裝入液相色譜進(jìn)樣瓶中，采用高效液相色譜檢測3種parabens的濃度.儀器及色譜條件如下：色譜柱型號為ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，保護(hù)柱型號為EC-C18(4.6 mm×15.5 mm，2.7 μm)，進(jìn)樣體積為25 μL，色譜柱溫度設(shè)為25 ℃，流動相為甲醇和超純水，流速為1 mL/min，流動相配比見表2，紫外檢測波長為254 nm.

表2 梯度洗脫條件

2 結(jié)果和分析

2.1 目標(biāo)物初始質(zhì)量濃度對降解的影響

在溫度為35 ℃、R2A液體培養(yǎng)基初始pH為7、降解時間為12 h條件下，考察了菌株1a51對各初始質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8和10 mg/L的3種共存目標(biāo)物的降解情況.3種物質(zhì)的濃度變化如圖1所示.由圖1可以看出，在考察時間內(nèi)，3種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度均隨著時間推移而降低.在12 h內(nèi)，3種物質(zhì)基本都能完全被降解，其中BuP降解得最快，在4 h時基本完全被降解；其次是PrP，在6 h時質(zhì)量濃度降到0 mg/L；EtP降解得最慢，需要12 h才能全部消除.由物質(zhì)的質(zhì)量濃度變化趨勢可以看出，在前6 h內(nèi)，EtP降解較慢，而在這期間，PrP和BuP很快被降解完全；在后6 h內(nèi)，體系中沒有PrP和BuP的存在，EtP被細(xì)菌快速降解，3種物質(zhì)在一定時間內(nèi)的降解趨勢是BuP>PrP>EtP.可以明顯看出3種物質(zhì)降解速度的差異與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，即paraben的酯基部分碳鏈越長，其被降解的速率越快.這與文獻(xiàn)[18]報道的污泥體系對PrP的降解規(guī)律一致.可能是酯基部分碳鏈越長，越容易被細(xì)菌吸附在表面，從而優(yōu)先被菌株1a51降解.

圖1 目標(biāo)物初始質(zhì)量濃度對細(xì)菌1a51降解的影響

細(xì)菌表面一般會有孔隙存在，使得其具有一定的疏水性，從而影響細(xì)菌在其他生物和非生物上的粘附能力以及其攝取有機(jī)物的能力[19].為了明確菌株表面吸附目標(biāo)有機(jī)物在paraben去除中的作用，實驗將3種目標(biāo)物加入生長期被滅活的細(xì)菌1a51培養(yǎng)體系中，每間隔2 h檢測培養(yǎng)基里3種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，定量測定細(xì)菌1a51表面對目標(biāo)物的吸附能力.從圖2可以看出，滅活后的細(xì)菌1a51對3種parabens有微弱的吸附能力，其中對BuP的吸附稍強(qiáng).細(xì)菌對3種目標(biāo)物的吸附能力大小為BuP>PrP>EtP，這應(yīng)該是隨著碳鏈的增加，paraben疏水性增強(qiáng)，正辛醇/水分配系數(shù)增大，更有利于被細(xì)菌表面所吸附[20].這個規(guī)律與細(xì)菌降解3種parabens的速率一致.同時發(fā)現(xiàn)，由細(xì)菌表面吸附而帶來的paraben質(zhì)量濃度降低非常有限，說明體系中paraben的消失主要來自細(xì)菌的降解作用.

圖2 細(xì)菌1a51對3種parabens的吸附作用

在3種目標(biāo)物的初始質(zhì)量濃度各為10 mg/L、降解時間為12 h時對其降解動力學(xué)進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，PrP和BuP能夠較好地符合一級動力學(xué)模型，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.954和0.985，反應(yīng)速率常數(shù)分別為0.410 h-1和1.061 h-1(見圖3(a))，而EtP的降解不符合一級動力學(xué)模型.分析原因,可能是由于本體系是一個三物質(zhì)共存體系，物質(zhì)間存在競爭關(guān)系[21].如圖3(b)所示，在前6 h內(nèi)主要是PrP和BuP被降解，而在后6 h內(nèi)EtP被快速降解.對EtP降解過程的后6 h部分進(jìn)行一級動力學(xué)擬合得到，相關(guān)系數(shù)R2為0.996，反應(yīng)速率常數(shù)為0.486 h-1(見圖3(c))，符合一級動力學(xué)函數(shù)[22].

圖3 細(xì)菌1a51對3種parabens的降解動力學(xué)

2.2 pH對降解的影響

pH會影響到細(xì)菌表面所帶的電荷，影響表面孔隙的通透性，從而影響細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取吸收，對它的生長產(chǎn)生影響[23].實驗在溫度為35 ℃、各目標(biāo)物初始質(zhì)量濃度均為10 mg/L、降解時間為12 h條件下，研究了細(xì)菌1a51在不同pH(5、6、7、8、9)培養(yǎng)基里對目標(biāo)物的降解情況.如圖4所示，隨著pH從5升高到9，體系最終剩余的目標(biāo)污染物的質(zhì)量濃度先降低后增加.在pH=7時細(xì)菌對3種物質(zhì)的降解效果最好，物質(zhì)的平均去除率達(dá)到98%，因此可以看出該細(xì)菌適宜的降解環(huán)境應(yīng)為中性.

圖4 pH對細(xì)菌1a51降解的影響

2.3 溫度對降解的影響

已有研究表明，溫度是影響細(xì)菌能否高效降解氯嘧磺隆的主要因素[24]，這是因為溫度過高或過低均可明顯抑制細(xì)菌的活性[25].因此實驗需要考察溫度對細(xì)菌1a51降解能力的影響.在R2A液體培養(yǎng)基初始pH=7、各目標(biāo)物初始質(zhì)量濃度為10 mg/L、降解時間為12 h條件下，細(xì)菌1a51在不同溫度(15、25、35、45 ℃)下對目標(biāo)污染物的降解情況如圖5所示.

圖5 溫度對細(xì)菌1a51降解的影響

在15 ℃和45 ℃時，細(xì)菌對3種目標(biāo)物的降解效果均較差，15 ℃時3種目標(biāo)污染物的平均降解率為45%，45 ℃時僅有BuP的降解率達(dá)到80%以上，其它2種物質(zhì)的降解率均低于45%.這可能是由于過熱使酶失去活性，從而使菌體衰老提前，導(dǎo)致菌種數(shù)量減少[26]；而低溫會使細(xì)菌代謝變緩，有機(jī)物質(zhì)的分解受到抑制[27].在35 ℃的環(huán)境下，3種目標(biāo)物都能被較快降解，10 h即可被完全降解.

2.4 金屬離子對降解的影響

考慮到自然環(huán)境的水體中不僅含有豐富的有機(jī)物，也存在著大量的金屬離子，實驗考察了6種金屬離子(Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Cd2+，Ni2+)存在的情況下細(xì)菌1a51對3種目標(biāo)污染物降解情況.在溫度為35 ℃、R2A液體培養(yǎng)基初始pH=7、各目標(biāo)物初始質(zhì)量濃度為10 mg/L條件下，向體系中分別加入不同質(zhì)量濃度(0.1或1 mmol/L)的各金屬離子，考察一定時間內(nèi)(EtP降解10 h，PrP和BuP降解6 h)各目標(biāo)物的降解率，結(jié)果如圖6所示.可以看出不同的金屬離子對降解的影響存在差異.當(dāng)離子質(zhì)量濃度為0.1 mmol/L時，各金屬離子對細(xì)菌1a51降解3種防腐劑有微弱的抑制作用(與空白組(BK)相比)；濃度升高，抑制作用有些許增強(qiáng).其中抑制作用最強(qiáng)的是Cd2+.有報道顯示，Cd2+具有較強(qiáng)的生物毒性，它會損傷菌株細(xì)胞，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[28].3種parabens中BuP的降解幾乎不受低濃度金屬陽離子的影響，而EtP和PrP受一定程度的抑制.

圖6 金屬離子對細(xì)菌1a51降解的影響

2.5 不同水體中的降解

為考察細(xì)菌1a51在實際水體中對目標(biāo)物的降解情況，實驗采集了5種水樣(湘江水，河水，濕地水，自來水和UP水)，過濾處理后用其制得不同水體基質(zhì)的培養(yǎng)基，在溫度為35 ℃、初始pH=7、各目標(biāo)物初始質(zhì)量濃度為10 mg/L的條件下，考察了一定時間內(nèi)(EtP降解10 h，PrP和BuP降解6 h)目標(biāo)物的降解率，結(jié)果如圖7所示.可以看出同一物質(zhì)在不同基質(zhì)中的降解順序為UP水>自來水>濕地水>河水>湘江水.這可能與環(huán)境水體中有機(jī)物、金屬離子種類及含量差異等因素有關(guān)，但整體上，細(xì)菌1a51在各水體中仍然具有較好的降解能力.不能忽略的一個問題是，實際水體中存在大量的土著微生物，細(xì)菌1a51在其中能否適應(yīng)、繁殖并發(fā)揮其降解能力，需要進(jìn)一步深入研究.

圖7 水體基質(zhì)對細(xì)菌1a51降解的影響

3 結(jié)論

研究了細(xì)菌1a51對3種parabens防腐劑在不同溫度、pH值及不同目標(biāo)物初始質(zhì)量濃度下的降解規(guī)律，結(jié)果表明：細(xì)菌1a51在35 ℃下的中性培養(yǎng)基中，能夠?qū)⒊跏假|(zhì)量濃度為2～10 mg/L的各防腐劑完全降解；在parabens共存體系中，3種物質(zhì)的降解存在競爭關(guān)系，細(xì)菌1a51優(yōu)先降解酯基中碳鏈較長的目標(biāo)物，3種物質(zhì)完全降解所用時長順序為BuP