新疆地區(qū)藍(lán)舌病病毒的分離鑒定及編碼VP5外殼蛋白的基因序列分析

馬曉菁，薛曉波，葉 鋒，劉麗婭，古麗扎提·塔力甫汗，谷文喜，易新萍*

（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床研究中心，烏魯木齊 830002；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，烏魯木齊 830002）

藍(lán)舌?。˙luetongue，BT）是由呼腸孤病毒科（Reoviridae）環(huán)狀病毒屬（Orbivirus）的藍(lán)舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的經(jīng)媒介昆蟲如庫(kù)蠓、伊蚊等傳播的非接觸性病毒性傳染病[1]。綿羊?qū)υ摬∽顬橐赘校∷缆释ǔ?%~30%，有時(shí)高達(dá)70%~100%[1]。藍(lán)舌病不僅對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成直接經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)對(duì)國(guó)際貿(mào)易也造成較大影響。藍(lán)舌病病毒血清型眾多且變異快，目前全球有29個(gè)血清型的BTV，亞洲至少存在27個(gè)血清型的BTV[2,3]。新的血清型及強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，應(yīng)引起我國(guó)的高度重視。1979年，云南省的師宗縣首次檢測(cè)出BT，隨后湖北、安徽、四川、山西等29個(gè)省均檢出BTV血清陽(yáng)家畜。目前我國(guó)已陸續(xù)分離到16個(gè)血清型的BTV，其中云南分離并檢測(cè)到的血清型最多，廣東次之[4，5]。新疆已分離到BTV3個(gè)血清型。1988年，新疆首次從遼寧蓋縣調(diào)運(yùn)至克孜勒蘇州的絨山羊中檢出，1988-1989年對(duì)新疆地區(qū)牛羊藍(lán)舌病進(jìn)行普查，結(jié)果顯示BTV血清陽(yáng)性畜在新疆廣泛存在。2012年，新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所對(duì)疆內(nèi)的8個(gè)地州的8個(gè)縣市開展藍(lán)舌病調(diào)查并在新疆尉犁縣監(jiān)控動(dòng)物群中分離獲得BTV分離株[6]。

藍(lán)舌病病毒粒子呈二十面體對(duì)稱，基因組大小約20 Kb，無(wú)囊膜，有多層衣殼，主要由3部分組成，分別為內(nèi)部核心、內(nèi)層衣殼與外層衣殼。該病毒基因組由10個(gè)分節(jié)段的雙鏈RNA組成[7，8]，可編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP7）和5種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1-NS4）。VP2和VP5蛋白構(gòu)成病毒外殼，其中由L2基因編碼的VP2蛋白是主要型特異性抗原，S6基因編碼VP5蛋白是藍(lán)舌病唯一糖基化蛋白，與BTV毒力相關(guān)。研究表明，VP5能增強(qiáng)VP2中和抗體的產(chǎn)生，能增加VP2的保護(hù)作用。對(duì)VP5蛋白相關(guān)研究可為今后BTV基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。我國(guó)流行多種BTV血清型毒株，不同血清型BTV毒株對(duì)綿羊的致病性存在較大差異，因此BTV不同血清型疫苗的研究，對(duì)我國(guó)藍(lán)舌病防控具有重要意義。本研究對(duì)新疆1株疑似BTV分離株進(jìn)行PCR鑒定，明確分離株位藍(lán)舌病病毒。應(yīng)用全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增（full-length amplification of cDNAs，F(xiàn)LAC）技術(shù)，獲得編碼VP5蛋白S6基因序列，同源性比對(duì)結(jié)果表明，BTV新疆分離株S6基因序列出現(xiàn)較大差異，遺傳進(jìn)化關(guān)系可見(jiàn)，新疆藍(lán)舌病分離株與BTV-18血清型及BTV-27血清型關(guān)系較近，但并不能歸屬為藍(lán)舌病血清18型及27型，新疆BTV分離株血清型需進(jìn)一步鑒定。本研究結(jié)果以期為新疆地區(qū)藍(lán)舌病防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆藍(lán)舌病病毒分離株、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）均由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

基因克隆載體PMD18-T、一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（Prime ScriptTM one step RT-PCR kit）均購(gòu)自TaKaRa寶信生物工程（大連）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（SuperScriptTMFirst-strand Synthesis System）購(gòu)自Invitrogen公司，引物合成及測(cè)序服務(wù)由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)舌病分離株的NS1片段RT-PCR擴(kuò)增

依照OIE手冊(cè)提供引物進(jìn)行巢式PCR，第一輪擴(kuò)增引物:FA（5’-3’）:GTTCTCTAGTTGGCAACCACC;RB:（5’-3’）:AAGCCAGACTGTTTCCCGAT;第二輪擴(kuò)增引物FC（5’-3’）:GCAGCATTTTGAGAGAGCGA;RD（5’-3’）:CCCGATCATACATTGCTTCCT，擴(kuò)增產(chǎn)物片段分別為272 bp和101 bp。取BTV新疆分離株提取RNA 5μL，95℃變性5 min為模板，RT-PCR反應(yīng)體系25μL，其中模板5μL，2×1 step Buffer（Dye plus）12.5μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1μL，上游引物FA（10μM）0.5μL，下游引物RB（10μM）0.5μL，ddH2O補(bǔ)足25μL。第一輪擴(kuò)增反應(yīng)程序：45℃40 min，94℃2 min，1個(gè)循環(huán)；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL，其中模板1μL，PCR mix 12.5μL，上游引物FC（10μM）1μL，下游引物RD（10μM）1μL，ddH2O補(bǔ)足25μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性1 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃20 s共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。

1.2.2 分離株S6基因序列擴(kuò)增

根據(jù)FLAC（Full-Length Amplification of cDNA）方法[9]，將BTV新疆分離株接種BHK-21細(xì)胞大量培養(yǎng)，離心收集病毒液200μL，加入20μLRNase A和5μL冷核酸酶，37℃處理24 h；提取分離病毒dsRNA，按照T4 RNA連接試劑盒操作方法將病毒dsRNA與Anchor Primer連接，Anchor Primer：5'p-GACCTCTGAGGATTCTAAAC/iSp9/TCCAGTTTAGAATCC-OH-3’；連接產(chǎn)物經(jīng)RNA試劑盒純化；取純化后dsRNA15μL，94℃變性5 min，立即冰浴，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptⅡHigh Fidelity RT-PCR Kit說(shuō)明書，反轉(zhuǎn)錄純化后dsRNA，反應(yīng)條件30℃10 min，42℃1 h，70℃10 min；分離病毒反轉(zhuǎn)錄cDNA中加入0.5μL的RNase H，37℃反應(yīng)2 h；分離病毒基因組PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物5-15-1 Primer：5'-GAGGGATCCAGTTTAGAATCCTCAGAGGTC-3'，擴(kuò)增體系為25μL，其中5×Prime STAR GXL Buffer 5μL，DNTP（2.5mM）2μL，5-15-1 Primer 1μL，Prime STAR GXL DNA Ploymerase 1μL，分離病毒cDNA 13.5μL，ddH2O補(bǔ)足25μL，反應(yīng)條件94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，68℃4 min，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，觀察結(jié)果。

1.2.3 BTV分離株S6基因序列進(jìn)化樹繪制

選取Genbank中已發(fā)表BTV1-28血清型（除BTV-14及BTV-15）S6基因片段序列，經(jīng)MEGA5.0軟件Neighbour-Joining（NJ）方法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆分離株NS1片段RT-PCR結(jié)果

提取新疆分離株RNA，以其為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見(jiàn)，巢式PCR產(chǎn)物為101 bp目的條帶（見(jiàn)圖1），測(cè)序結(jié)果NCBI Blast比對(duì)分析，分離株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中藍(lán)舌病病毒編碼NS1蛋白基因相似性為98.04%，鑒定新疆該分離株為藍(lán)舌病病毒分離株。

圖1 分離株NS1片段擴(kuò)增結(jié)果

2.2 分離株S6基因序列分析

FLAC技術(shù)對(duì)藍(lán)舌病新疆分離株P(guān)CR擴(kuò)增，S6基因序列片段為1 572 bp（見(jiàn)圖2），將PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。

圖2 分離病毒FLAC方法基因組PCR擴(kuò)增

登錄NCBI GenBank對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性Blast比對(duì)，結(jié)果顯示新疆BTV分離株S6基因序列與GenBank發(fā)表3株BTV分離株S6序列具有同源性，同源性分別為88.11%，87.35%以及70.92%。應(yīng)用MEGA5.0軟件Neighbour-Joining（NJ）方法繪制進(jìn)化樹，其遺傳進(jìn)化關(guān)系可見(jiàn)，新疆地區(qū)BTV分離株S6基因序列與BTV-18血清型在同一進(jìn)化分枝，與BTV-27血清型親緣關(guān)系最近（見(jiàn)圖3），其中BTV-27型為2014年在法國(guó)首次鑒定。

3 討 論

除南極洲外，藍(lán)舌病病毒在所有陸地均有發(fā)現(xiàn)，該病毒呈世界性分布[10]。我國(guó)目前有10個(gè)省份（地區(qū)）分離到16個(gè)血清型的BTV，新疆存在3個(gè)血清型[11，12]。藍(lán)舌病病毒是一種蟲媒傳播疫病，血清型眾多，BTV基因片段重組和變異導(dǎo)致了其遺傳的多樣性，地理環(huán)境的差異造成不同地理區(qū)域藍(lán)舌病病毒出現(xiàn)特有的突變。研究表明，藍(lán)舌病基因組核苷酸變異在某種程度上可反應(yīng)BTV的地理起源[13]。S6基因編碼的VP5蛋白可增強(qiáng)VP2蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，與VP2蛋白構(gòu)成病毒的外層衣殼。我國(guó)BTV-21血清型S6基因序列分析發(fā)現(xiàn)該毒株源于日本，該結(jié)果證明我國(guó)存在基因重組藍(lán)舌病病毒[14]，給我國(guó)藍(lán)舌病防控工作增加了一定難度。對(duì)不同地區(qū)的易感動(dòng)物進(jìn)行藍(lán)舌病有效防控，針對(duì)該地區(qū)藍(lán)舌病特異的血清型疫苗顯得尤為重要。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)新疆分離BTV株的鑒定及S6基因序列分析表明，BTV分離株S6基因序列僅與GenBank中BTV strain XJ1407株、BTV strainMNG2/2016株及BTV-18 strain USA2014/FL株的S6基因具有同源性，且同源性均低于90%，分別為88.11%，87.35%以及70.92%。遺傳進(jìn)化關(guān)系結(jié)果表明分離株S6基因序列與BTV-18血清型在同一進(jìn)化分枝，與BTV-27血清型親緣關(guān)系最近，但均不屬于藍(lán)舌病血清18型及27型。因此，對(duì)新疆分離BTV株需進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)中和試驗(yàn)鑒定分析，以期為新疆地區(qū)藍(lán)舌病疫苗研究提供科學(xué)依據(jù)。