劉冬戀，張 謙，謝 蕾，夏陽(yáng)淼

(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610500)

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”“脾癉”范疇，患者多因過(guò)食肥甘厚膩、多食少動(dòng)所致脾胃損傷，運(yùn)化失司，積熱內(nèi)蘊(yùn)，痰熱互結(jié)，故中滿(mǎn)內(nèi)熱為其基本病機(jī)[1]。目前，2型糖尿病(T2DM)大鼠模型均是借用西醫(yī)造模方法，采用西醫(yī)病因病理復(fù)制的動(dòng)物模型，雖具有造模方法穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但這類(lèi)造模方法是用西醫(yī)的思路來(lái)探討中醫(yī)的理論，與中醫(yī)傳統(tǒng)病因不符，同時(shí)制作出來(lái)的動(dòng)物模型不具有中醫(yī)糖尿病的本質(zhì)和特點(diǎn)[2-3]。因此，在T2DM大鼠模型基礎(chǔ)上，動(dòng)態(tài)觀察大鼠的宏觀表征和微觀指標(biāo)，綜合形體、飲水、大小便、舌脈等進(jìn)行證候判定，在此思路上構(gòu)建的“痰熱互結(jié)”中醫(yī)證候?qū)傩缘拇笫竽Ｐ?，具有客觀性強(qiáng)、可信度高以及更貼近臨床等特點(diǎn)。

小陷胸湯出自《傷寒論》辨太陽(yáng)病脈證并治太陽(yáng)病變證篇，是至今仍在中醫(yī)臨床被廣泛使用的名方之一，方中瓜蔞清熱滌痰、寬胸散結(jié)；黃連清泄“心下”之熱；半夏滌痰化飲開(kāi)結(jié)，三藥合用，辛開(kāi)苦降，則痰熱各自分消，而無(wú)結(jié)滯之患，用于治療T2DM前期對(duì)應(yīng)的痰熱互結(jié)證候[4]。本實(shí)驗(yàn)建立T2DM前期痰熱互結(jié)證大鼠模型，經(jīng)小陷胸湯的干預(yù)治療，通過(guò)陽(yáng)性表征檢測(cè)和血糖、體質(zhì)量、飲水量、尿量、體溫等指標(biāo)檢測(cè)，初步評(píng)價(jià)小陷胸湯對(duì)T2DM痰熱互結(jié)證大鼠的療效，為小陷胸湯臨床應(yīng)用于T2DM的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雄性wistar大鼠55只，體質(zhì)量200～250 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(川)2018-24。每只大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(22±2)℃、相對(duì)濕度(55±5)%、12 h/12 h明暗交替。

黃連購(gòu)自北京同仁堂(集團(tuán))有限公司，批號(hào)170801；法半夏和瓜蔞購(gòu)自四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，批號(hào)170817、170902，3種藥材經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院游元元教授鑒定為正品。鹽酸二甲雙胍片購(gòu)自鞍山九天制藥有限公司，批號(hào)201806；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)170325。其他化學(xué)試劑均為分析純。

小陷胸湯由黃連25 g、法半夏12 g、瓜蔞25 g組成，浸泡1 h，煎煮2次，每次30 min，合并濾液后減壓濃縮，得到質(zhì)量濃度為6.5 g/kg的小陷胸湯[5-6]。

大鼠代謝籠，蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司；CP225D精密分析天平，德國(guó)Sartorious公司；安穩(wěn)血糖儀、血糖試紙，長(zhǎng)沙三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 造模 參考文獻(xiàn)[7]方法，所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組和造模組，正常組10只，給予普通飼料，造模組大鼠喂養(yǎng)45%熱量比高脂飼料(20%蛋白質(zhì)，35%碳水化合物，45%脂肪)。為限制大鼠的活動(dòng)空間，造模組10只/籠。第8周末，造模組大鼠均一次性左下腹腹腔注射30 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)，注射后72 h剪尾采血測(cè)空腹血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L為造模成功。繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，1周后(即第9周末)再測(cè)血糖，空腹血糖仍>11.1 mmol/L證明模型穩(wěn)定，選入正式實(shí)驗(yàn)，開(kāi)始給藥。

1.2.2 分組 將造模成功的36只大鼠隨機(jī)分為小陷胸湯組(6.5 g/kg)、二甲雙胍組(100 mg/kg)、模型組，每組各12只，正常組及模型組按10 mL/kg灌胃給予生理鹽水，其余組灌胃給予相應(yīng)藥物。每天灌胃給藥1次，給藥周期為4周。在給藥期間，正常組喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料，其余各組大鼠繼續(xù)給予高脂飼料。

1.2.3 表征指標(biāo) 參考潘秋[8]的表征采集表，見(jiàn)表1。觀察并記錄第13周各組大鼠表征的變化，統(tǒng)計(jì)各組大鼠異常變化的只數(shù)，以組內(nèi)變化只數(shù)/組內(nèi)總只數(shù)(n/N)表示。

表1 2型糖尿病大鼠表征采集表

1.2.4 口服葡萄糖耐量試驗(yàn) 在第9周末，即STZ注射后1周(給藥前)和第13周末，即給藥第4周末(第28天)，分別進(jìn)行一次口服葡萄糖耐量(OGTT)試驗(yàn)，即大鼠空腹12 h后，灌胃給予50%葡萄糖溶液2 g/kg，剪尾采血，檢測(cè)給糖前即0 h和給糖后0.5、1、2 h的血糖，計(jì)算糖耐量曲線(xiàn)下面積[9](AUC)，公式為AUC=(G0+G2)/2+G0.5+G1。

1.2.5 體質(zhì)量、24 h飲水量、24 h尿量和體溫檢測(cè) 稱(chēng)定各組大鼠第1、3、5、7、9、10、11、12、13周的體質(zhì)量，檢測(cè)給藥后(即10～13周)各組大鼠24 h飲水量、24 h尿量和體溫的變化。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠第13周表征的變化 根據(jù)中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)制訂的《糖尿病中醫(yī)診療標(biāo)準(zhǔn)》[10]中關(guān)于T2DM痰熱互結(jié)型標(biāo)準(zhǔn)，主癥為形體肥胖、腹部脹大、胸悶脘痞；次癥為口干口渴、喜冷飲、飲水量多、心煩口苦、大便干結(jié)、小便色黃；舌脈表現(xiàn)為舌體胖大、舌質(zhì)紅、苔黃膩、脈弦滑。與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)了肥胖，神情倦怠，皮毛枯黃，鼻、舌、爪暗紅，耳、唇鮮紅，大便干結(jié)等表征(P<0.01)，符合T2DM痰熱互結(jié)證的外觀表現(xiàn)；經(jīng)小陷胸湯干預(yù)治療后，大鼠的各項(xiàng)體征都有明顯變化，與模型組比較，小陷胸湯組大鼠體質(zhì)量降低，大鼠皮毛和爪的清潔程度增加，大鼠鼻和爪暗紅的程度有改善(P<0.05)，見(jiàn)圖1～2。

注：在橫坐標(biāo)中，1.1表示肥胖，1.2表示神情倦怠，2.1表示皮毛有光澤，2.2表示皮毛順滑，3表示鼻濕潤(rùn)，4表示大便堅(jiān)硬，5表示爪清潔，6表示尾部有結(jié)痂。與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。圖1 第13周各組大鼠表征比較

注：在橫坐標(biāo)中，1表示皮毛枯黃，2表示眼部淡白，3表示耳鮮紅，4表示鼻暗紅，5表示唇鮮紅，6表示舌暗紅，7表示爪暗紅。與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。圖2 第13周各組大鼠表征比較

2.2 各組大鼠第9、13周血糖和AUC值的比較 在第9周末，與正常組比較，其余各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的血糖值和AUC值均上升(P<0.01)；與模型組比較，小陷胸湯組和二甲雙胍組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的血糖值和AUC值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥后，第13周末時(shí)，與模型組比較，小陷胸湯組大鼠0.5、1、2 h血糖值和AUC值下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3～4。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。圖3 各組大鼠血糖值比較

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。圖4 各組大鼠第9周和第13周末AUC值比較

2.3 各組大鼠體質(zhì)量的變化 在第1～7周，各組大鼠的體質(zhì)量均呈緩慢增加的趨勢(shì)。與正常組比較，在第5周時(shí)，模型組和二甲雙胍組大鼠體質(zhì)量增加(P<0.05)；在第7周時(shí)，模型組和小陷胸湯組大鼠體質(zhì)量增加(P<0.05)，說(shuō)明飼喂高脂飼料的方法能夠增加大鼠的體質(zhì)量。STZ腹腔注射造模后，即第9周時(shí)，與正常組比較，其余各組大鼠體質(zhì)量增加緩慢。在給藥后，即第10～13周，與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量在10～13周均有上升趨勢(shì)(P<0.05，P<0.01)，此結(jié)果佐證了模型組大鼠“形體肥胖”的體征。與模型組比較，第11～13周，小陷胸湯組和二甲雙胍組大鼠體質(zhì)量均下降(P<0.01)，見(jiàn)圖5。由此可知，小陷胸湯和二甲雙胍均能降低T2DM大鼠體質(zhì)量。

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖5 各組大鼠第1、3、5、7、9、10、11、12、13周體質(zhì)量的比較

2.4 各組大鼠第10～13周24 h飲水量和24 h尿量的變化 與正常組比較，第11～13周模型組24 h飲水量增加(P<0.01)，第10～13周模型組大鼠24 h尿量均增加(P<0.01)；與模型組比較，小陷胸湯組大鼠第11～13周24 h飲水量和尿量均降低(P<0.05，P<0.01)，二甲雙胍組大鼠第11、13周的24 h尿量降低(P<0.05)，而同時(shí)間點(diǎn)的24 h飲水量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖6。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 各組大鼠第10～13周24 h飲水量和24 h尿量的比較

2.5 各組大鼠第10～13周體溫的變化 第10～13周，與正常組比較，模型組大鼠體溫均上升(P<0.01)；與模型組比較，小陷胸湯組大鼠第12～13周體溫下降(P<0.01)，二甲雙胍組大鼠第11～12周體溫降低(P<0.01)，見(jiàn)圖7。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖7 各組大鼠第10～13周體溫的比較

2.6 各組大鼠第13周時(shí)AUC、體質(zhì)量、24 h飲水量、24 h尿量和體溫的相關(guān)性分析 第13周時(shí)，各組大鼠的AUC、體質(zhì)量、24 h飲水量、24 h尿量和體溫之間均相關(guān)(P<0.05,P<0.01)，見(jiàn)圖8。

3 討論

在臨床上，T2DM的癥候分型較多，如腎陰虛證、痰濕中阻證、痰熱互結(jié)證、脾虛濕盛證等，其中以痰熱互結(jié)、肝火允盛和脾虛濕盛的患者居多，痰熱互結(jié)證患者分布的年齡段多在20～40歲[11]。痰熱互結(jié)證患者在被辯證時(shí)認(rèn)為其舌厚腐膩答，舌形胖大、齒痕均反映痰濕痰油，紅舌、黃苔反映中滿(mǎn)內(nèi)熱的病機(jī)[12]。本實(shí)驗(yàn)采用45%高脂飼料長(zhǎng)時(shí)間喂養(yǎng)，限制活動(dòng)空間疊加小劑量STZ的方式，根據(jù)臨床癥候判斷標(biāo)準(zhǔn)作為大鼠癥候?qū)傩缘呐袛嘁罁?jù)，多數(shù)模型組大鼠的表征出現(xiàn)舌象呈暗紅色，與正常組的淡紅色有明顯差異，提示模型組大鼠出現(xiàn)痰熱體征。同時(shí)，模型組大鼠出現(xiàn)肥胖，神情倦怠，皮毛枯黃，鼻、爪暗紅，耳、唇鮮紅，大便干結(jié)等表征，符合T2DM痰熱互結(jié)證的外觀表現(xiàn)。采用定量指標(biāo)評(píng)價(jià)，從第5周開(kāi)始，模型組大鼠的體質(zhì)量持續(xù)增加，符合T2DM痰熱互結(jié)證形體肥胖的主癥表現(xiàn)；10～13周，模型組大鼠的24 h飲水量和24 h尿量均增加，體溫升高，符合T2DM痰熱互結(jié)證口干口渴和飲水量多的次癥特點(diǎn)以及“熱”的外在表現(xiàn)。因此，判斷模型組大鼠符合T2DM痰熱互結(jié)的癥候?qū)傩浴?/p>

小陷胸湯出自《傷寒論》，由黃連一兩、半夏半升、瓜蔞一枚組成，三藥合用則具有清熱化痰、寬胸散結(jié)的功能，用于痰熱互結(jié)之癥[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)小陷胸湯干預(yù)治療后，大鼠的各項(xiàng)體征都有明顯變化，與模型組比較，小陷胸湯能較大程度改善暗紅色舌象，降低大鼠的肥胖程度、鼻和爪暗紅的程度，改善T2DM痰熱互結(jié)模型大鼠的表征。在臨床實(shí)踐中，小陷胸湯能有效地降低患者血糖，明顯改善患者的胰島素抵抗指數(shù)，保護(hù)β細(xì)胞功能，同時(shí)糾正糖尿病前期痰濕蘊(yùn)熱偏頗的體質(zhì)，治療痰熱互結(jié)型2型糖尿病[14-16]。本研究中，小陷胸湯能降低T2DM痰熱互結(jié)模型大鼠的體質(zhì)量和體溫，減少24 h飲水量和24 h尿量。同時(shí)，小陷胸湯組大鼠0.5、1、2 h餐后血糖值和AUC值均較模型組下降，與臨床報(bào)道一致。

綜上所述，高脂飼料長(zhǎng)程喂養(yǎng)+限制活動(dòng)空間+小劑量STZ可以建立T2DM痰熱互結(jié)癥候的大鼠模型。小陷胸湯對(duì)T2DM痰熱互結(jié)模型大鼠各種表征有不同程度的改善，同時(shí)對(duì)血糖、體質(zhì)量、飲水量和尿量等T2DM典型指標(biāo)有顯著改善，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)和阻止痰熱互結(jié)證模型大鼠T2DM發(fā)展的作用。因此，小陷胸湯是一劑良好的T2DM痰熱互結(jié)模型的反證方藥，本研究也為中醫(yī)辨證論治中“方證相關(guān)”提供了的實(shí)證依據(jù)。