張鈺偉，戴世明，趙旺，鄧正華，黃星美，溫為庚，馬振華*

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510300；2. 三亞熱帶水產(chǎn)研究院， 海南 三亞 572426； 3. 天津農(nóng)學(xué)院， 天津 300384)

黃緣閉殼龜(Cuoraflavomarginata)隸屬龜鱉目，龜科，閉殼龜屬，又名黃緣盒龜，棲息于丘陵山區(qū)靠近水源的林緣、雜草、灌木之中，為亞洲特有物種，主要分布于江蘇、安徽、河南、江西、浙江、廣西、福建、臺(tái)灣等地[1-2]。黃緣閉殼龜不僅是傳統(tǒng)名貴中藥材，而且觀賞價(jià)值高，深受養(yǎng)龜愛好者的喜愛，極具市場(chǎng)潛力[3]。人們對(duì)野生黃緣閉殼龜濫捕濫殺，以及人類活動(dòng)導(dǎo)致自然環(huán)境日益惡化，黃緣閉殼龜?shù)臈⒌夭粩嘣獾狡茐?，使得其野生資源瀕臨滅絕，1998年列為中國(guó)國(guó)家珍稀瀕危動(dòng)物[4]。因此，對(duì)黃緣閉殼龜進(jìn)行大規(guī)模養(yǎng)殖和開發(fā)利用成為國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖者的共同目標(biāo)，黃緣閉殼龜人工養(yǎng)殖技術(shù)的開展，使這一珍稀瀕危動(dòng)物得到有效保護(hù)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)黃緣閉殼龜?shù)难芯恳阎饾u深入。國(guó)內(nèi)主要涉及到黃緣閉殼龜?shù)牡赜蛐再Y源調(diào)查[5-9]、養(yǎng)殖[10-13]、通徑分析[14]、病害[15-17]和遺傳生物學(xué)[18]等多個(gè)方面，而對(duì)于黃緣閉殼龜骨骼相關(guān)的研究并未見報(bào)道。

動(dòng)物骨骼研究的方法通常采用肌肉透明骨骼染色法、蒸煮剔骨法、X射線透視法等[19-21]。龜是一種難以用普通的解剖方法進(jìn)行骨骼研究的生物，龜類骨骼研究目前僅有兩種方法，一是根據(jù)現(xiàn)有的四爪陸龜(TestudohorsfieldiGray)的標(biāo)本進(jìn)行解剖觀察，此方法局限性大，僅限于已死亡的動(dòng)物標(biāo)本，并且在收集儲(chǔ)存標(biāo)本的過程中難免會(huì)有部分細(xì)小骨骼丟失[22]；二是制作透明標(biāo)本的方法,與肌肉透明骨骼染色法類似，此類方法適用于幼體骨骼發(fā)育不完全且個(gè)體較小的生物，但對(duì)于成年個(gè)體，骨骼已充分發(fā)育，此方法并不適用[23]。以上方法均需要失去生命跡象的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并不能連續(xù)記錄同一個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)象生長(zhǎng)過程中骨骼發(fā)育情況，而X射線透視法則可以進(jìn)行活體研究。X射線是一種頻率高、波長(zhǎng)短、能量?jī)H次于伽馬射線的強(qiáng)大電磁波，不受電場(chǎng)和磁場(chǎng)的影響，具有穿透物質(zhì)的能力，但受密度影響，對(duì)不同物質(zhì)的穿透能力強(qiáng)弱不一，經(jīng)過最終的顯像處理后能夠得到不同的影像。因此，X射線透視法目前廣泛應(yīng)用于人體健康檢查，在龜類骨骼研究和龜類疾病檢查方面并未被應(yīng)用[24-26]。采用X射線透視法可以在不損傷龜體的前提下簡(jiǎn)單高效地觀察整個(gè)龜體骨骼特征及其分布特征，對(duì)活體瀕?；蛘哒滟F物種的骨骼研究及其相關(guān)疾病診斷治療具有重要的意義，缺點(diǎn)是當(dāng)骨骼重疊部分過多時(shí)，如頭部和龜類的軀干部重疊，并不容易觀察其細(xì)節(jié)。

本研究運(yùn)用X射線透視法對(duì)黃緣閉殼龜?shù)念^骨、椎骨、前肢骨、后肢骨等進(jìn)行描述，進(jìn)一步豐富黃緣閉殼龜?shù)幕A(chǔ)研究數(shù)據(jù)，并為開展黃緣閉殼龜相關(guān)研究及龜類化石探究提供最佳的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對(duì)象為黃緣閉殼龜，養(yǎng)殖于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

數(shù)字化移動(dòng)式攝影X射線機(jī)(Modulo Easy 30,SMAM S.R.L.)。X射線背景板(Pixium 3543EZ，法國(guó)泰雷茲集團(tuán))。

1.3 方法

設(shè)備開機(jī)預(yù)熱并設(shè)置參數(shù)(kVp=40，mAs=3.2)。將黃緣閉殼龜放置于背景板上,同時(shí)置于X射線發(fā)射端口下，并調(diào)整龜體至射線可以完全覆蓋，待黃緣閉殼龜放松將頭部、四肢和尾巴伸展出殼時(shí)，開始拍攝(過程中注意個(gè)人防護(hù))，掃描完成后將黃緣閉殼龜放回養(yǎng)殖箱，整個(gè)過程不超過35 s。

1.4 數(shù)據(jù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析

將黃緣閉殼龜置于白色桌面上，在其身邊放置一把刻度尺，并在其正上方進(jìn)行拍照。照片均使用Photoshop 2020 軟件進(jìn)行圖片處理，添加標(biāo)注線，根據(jù)照片中刻度尺刻度測(cè)量顱長(zhǎng)、顱寬、背甲長(zhǎng)及背甲寬，并用ImageView軟件測(cè)量下頜骨夾角。

2 結(jié)果

2.1 背腹甲形態(tài)特征

黃緣閉殼龜背腹甲形態(tài)特征如圖1所示，頭部細(xì)長(zhǎng)，表面光滑無(wú)鱗片，頭部背面為淺橄欖色，兩眼后各有一條米黃色帶狀條紋，在頸部交匯成“U”形，腹面為黑色或灰黑色。背甲呈卵圓形，棕紅色，高而隆起，每片盾甲最中間的同心紋路呈黃色，椎盾中間有一條黃色嵴棱，緣盾略微上翹。緣盾和肋盾以嵴棱為中心線呈對(duì)稱分布，單側(cè)緣盾12塊，肋盾5塊，緣盾腹面和甲橋呈現(xiàn)米黃色。

圖1 黃緣閉殼龜背腹甲特征1. 顱寬；2. 顱長(zhǎng)；3. 背甲長(zhǎng)；4. 背甲寬；5. 頸盾；6. 椎盾；7. 緣盾；8. 肋盾；9. 臀盾；10. 喉盾；11. 肱盾；12. 胸盾；13. 甲橋；14. 腹盾；15. 股盾；16. 肛盾。Fig.1 Carapace characteristics of Cuora flavomarginata1. Skull width; 2. Skull length; 3. Carapace length; 4. Carapace width; 5. Nuchal shield; 6. Vertebral shield;7. Marginal shield; 8. Ribs shield; 9. Breech shield; 10. Larynx shield; 11. Brachial shield; 12. Chest shield; 13. Bridge; 14. Venter shield; 15. Thigh shield; 16. Anus shield.

腹甲黑色或灰黑色，呈卵圓形，上小下大，腹甲從前到后依次為喉盾、肱盾、胸盾、腹盾、股盾和肛盾。喉盾位于最前端中間，夾在肱盾之間，胸盾和腹盾與緣盾相連形成甲橋。胸盾和腹盾之間靠鉸鏈韌帶相連，可以使腹甲上端(喉盾和肱盾)、下端(股盾和肛盾)與背甲完全閉合，頭、尾和四肢可完全縮入殼內(nèi)。

2.2 頭部骨骼特征

龜類種類繁多，頭骨形態(tài)特征不一，黃緣閉殼龜頭部X光照片可清晰地呈現(xiàn)頭部的主要骨骼結(jié)構(gòu)(見圖2)。面區(qū)狹而短，眼后方骨位置最寬，具有類似顳窩的顳窩凹陷。整個(gè)頭骨窄而細(xì)長(zhǎng)，與身體占比小，黃緣閉殼龜外部形態(tài)性狀測(cè)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示，顱長(zhǎng)為背甲長(zhǎng)的27.09%～30.93%，顱寬為背甲寬的21.40%～27.66%，顱長(zhǎng)為顱寬的1.35～1.72倍。

圖2 黃緣閉殼龜頭部骨骼X光照片及頭部實(shí)體照片(背側(cè)觀)1.前額骨；2.前頜骨；3.上頜骨；4.下頜骨；5.眼窩；6.頂骨；7.前耳骨；8.方骨；9.后耳骨；10.枕髁；11.枕骨嵴；12.下頜骨夾角。Fig.2 X-ray photographs of head bones and real head picture of Cuora flavomarginata (Dorsal view)1.Forehead;2.Premaxillary;3.Maxilla;4.Mandible;5.Eye socket;6.Parictal bone;7.Prootic;8.Quadrate;9.Opisthotic;10.Occipital condyle;11.Occipital crest；12.Mandibular angle.

前頜骨是位于頭骨最前方的一對(duì)小骨，側(cè)面連接上頜骨，作為鼻腔的底壁和上口蓋的前緣。額骨位于頂骨和前額骨之間，由于層面固定并不清晰。眼窩位于頂骨兩側(cè)，在X射線照片下呈現(xiàn)明顯的輪廓虛影。方骨為一對(duì)，在頭部最寬處方軛骨偏后的位置，兩塊方骨與頭部長(zhǎng)軸成軸對(duì)稱，外部形成喇叭狀的鼓室壁，喇叭口為鼓膜所覆蓋。前耳骨位于方骨和頂骨之間，后部位置為后耳骨，接近上枕骨。下頜骨呈現(xiàn)“V”字形，夾角為55.32～64.52°(見表1)，位于頭部的下側(cè)，比上頜骨略小，下頜骨與上頜骨閉合時(shí)，形成研磨面，用于咀嚼吞咽食物。

表1 黃緣閉殼龜外部形態(tài)性狀測(cè)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.1 Statistical results for external morphological traits of Cuora flavomarginata

2.3 椎部骨骼特征

脊椎骨共34或36枚(見圖3)。頸椎共4枚，細(xì)長(zhǎng)，處游離狀態(tài)與背甲不愈合，無(wú)頸肋。第四頸椎后連接著軀椎，即從第5枚椎骨開始分為軀椎和肋骨，共7枚，第四頸椎和第一軀椎連接處較為粗大，與前肢肩胛骨相連接。第一軀椎開始特化變粗，第三軀椎最粗最寬，后第四軀椎開始到第七軀椎，椎骨逐漸變短變窄。第1～7軀椎兩側(cè)連接著肋骨，肋骨寬度大小與軀椎的寬度相近[22]，最后兩枚軀椎所連接的肋骨寬度較窄。第七枚椎骨后連接薦椎，較為短小，數(shù)量為2至3枚，后連接尾椎。尾椎最為細(xì)小，數(shù)量最多，為21或22枚。

圖3 黃緣閉殼龜椎部骨骼X光照片(背側(cè)觀)1.第一頸椎；2.第四頸椎；3.第一軀椎；4.第三軀椎；5.第七軀椎；6.薦椎；7.尾椎；8.肋骨；9.肋骨寬；10.軀椎寬。Fig.3 X-ray photographs of Cuora flavomarginata vertebrae (Dorsal view)1.First cervical vertebrae;2.Fourth cervical vertebrae;3.First trunk vertebrae;4.Third trunk vertebrae;5.Seventh trunk vertebrae;6.Sacral verebrae;7.Coccygeal vertebrae;8.Rib;9.Rib width;10.Trunk vertebrae width.

2.4 附肢骨骼特征

2.4.1 前肢骨

如圖4所示，肱骨較為粗壯，狀若弓形，兩頭粗大，中部靠近肩胛骨位置偏細(xì)小，橫截面近似圓形。肱骨末端與尺骨和橈骨相連接，尺骨與橈骨相比略微粗壯。橈骨和尺骨兩端粗大中間細(xì)窄，尺骨靠近肱骨端更粗大，略微彎曲，尺骨和橈骨并列，中間形成一條長(zhǎng)形縫隙，末端連接腕骨，有多枚，細(xì)小，形狀不規(guī)則，與掌骨相連。掌骨與指骨連接，末節(jié)指骨較長(zhǎng)并支持角質(zhì)爪，為五爪。

圖4 黃緣閉殼龜附肢骨骼X光照片1.頭骨；2.頸盾；3.肱骨；4.尺骨；5.橈骨；6.指骨；7.掌骨；8.腕骨；9.脊椎骨；10.股骨；11.臀板；12.尾椎；13.緣盾；14.腓骨；15.脛骨；16.跗骨；17.跖骨；18.趾骨。Fig.4 X-ray photographs of Cuora flavomarginata appendicular skeleton1.Skull;2.Nuchal shield;3.Humerus;4.Ulna;5.Radius;6.Phalanges;7.Metacarpal;8.Carpale;9.Vertebral bone；10.Femur；11.Pedical plate；12.Coccygeal vertebra;13.Marginal shield;14.Fibula;15.Tibia;16.Tarsus;17.Metatarsal;18.Phalanges.

2.4.2 后肢骨

股骨、腓骨、脛骨、跖骨、跗骨和趾骨構(gòu)成后肢骨。恥骨、坐骨和髂骨由于層面不一、龜甲和組織的干擾，X射線照片并不能清晰顯示。股骨狀若號(hào)角，略有彎曲，兩端粗大，股骨略短于肱骨，前端與恥骨、坐骨和髂骨相連，末端連接脛骨和腓骨。脛骨和腓骨比尺骨和橈骨細(xì)長(zhǎng)，脛骨比腓骨略顯粗大，兩根骨骼均兩端微隆，腓骨和脛骨并列，間有空隙。腓骨和脛骨末端連接跗骨，多枚，較為細(xì)小，形狀不規(guī)則。跖骨前端連接跗骨，末端連接趾骨，趾骨細(xì)長(zhǎng)，為四爪。

3 討論

3.1 背腹甲形態(tài)特征

龜鱉目在爬行綱中最為特化，背腹具殼，是一種被動(dòng)的保護(hù)性適應(yīng)，龜類種類繁多，形態(tài)特征不一，背腹甲的形狀與其棲息的生存環(huán)境有關(guān)[27]。陸生龜背甲相對(duì)飽滿，高而偏圓；水生龜背甲較扁平，呈流線型[28-29]。黃緣閉殼龜為水陸兩棲龜類，背甲微隆，有同心紋路，觸感光滑，其背甲形態(tài)介于高圓型和扁平流線型之間，能夠承受較大的機(jī)械力。腹甲的形成遠(yuǎn)早于背甲，是龜類自我保護(hù)機(jī)制不可或缺的一部分，主要起著保護(hù)腹部的作用[30-31]。黃緣閉殼龜行動(dòng)遲緩，為閉殼龜屬，胸盾和腹盾之間的鉸鏈結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是一種反捕食適應(yīng)，面臨危險(xiǎn)或者驚嚇時(shí)，頭、尾和四肢均可完全縮入殼內(nèi)，其前端(喉盾和肱盾)和后端(股盾和肛盾)腹甲分別與背甲閉合，將肉體完全封閉保護(hù)起來，很少有動(dòng)物能對(duì)他產(chǎn)生致命威脅，因此黃緣閉殼龜在自然界的天敵很少，幼龜時(shí)期蛇類和猛禽威脅最大。如今因人類的過度捕殺以及其生存環(huán)境的破壞，黃緣閉殼龜野生資源瀕臨滅絕[7]。

3.2 頭部骨骼特征

黃緣閉殼龜作為兩棲龜類，頭骨大小介于陸生龜和水生龜類之間[32-33]，頭部窄長(zhǎng)，整體呈現(xiàn)卵圓形，且頭骨與身體占比較小，頭部收縮自如，方便黃緣閉殼龜捕食和反捕食[7]。黃緣閉殼龜屬雜食性龜類，其頭蓋骨和研磨面偏小。研究表明龜類頭骨的高度與咬合力呈正相關(guān)，以貝類和植物為食的龜類頭蓋骨高而大，上頜骨和研磨面比雜食性龜類大[34]。黃緣閉殼龜?shù)难鄹C位于頭骨兩側(cè)，上端肌肉微隆，對(duì)眼球具有良好的保護(hù)作用，眼球微凸增加了黃緣閉殼龜?shù)囊曈蛎娣e，提高了其發(fā)現(xiàn)獵物的概率和捕食能力，同時(shí)也有利于觀察四周，及時(shí)發(fā)現(xiàn)危險(xiǎn)，關(guān)閉龜殼反捕食。

3.3 椎部骨骼特征

本研究中黃緣閉殼龜脊椎骨共有34或36枚，其中頸椎4枚，軀椎7枚，薦椎2或3枚，尾椎21或22枚。研究表明，脊椎骨是構(gòu)成龜類骨骼系統(tǒng)的重要組成部分，不同龜類脊椎骨的數(shù)量和結(jié)構(gòu)不盡相同，例如：四爪陸龜?shù)募棺倒枪?9或42枚，其中頸椎9枚，軀椎10枚，薦椎2枚，尾椎18或21枚；巴西紅耳龜(Trachemysscriptaelegans)骨骼觀察所使用方法為肌肉透明骨骼染色法，由于龜殼的遮擋，頸椎無(wú)法看清，其尾椎有20枚左右[22-23]。黃緣閉殼龜與上述兩種龜類脊椎數(shù)量不盡相同，其中四爪陸龜屬陸生龜，巴西紅耳龜屬半水棲、半陸棲，而黃緣閉殼龜屬兩棲龜類，由于生境及食性的差異，受系統(tǒng)發(fā)育的影響，龜類的形態(tài)進(jìn)化出現(xiàn)多樣化，通過自然選擇，優(yōu)勝劣汰，不同生境的龜類形態(tài)出現(xiàn)差異，因此其骨骼也存在差異[35]。

3.4 附肢骨骼特征

不同生境中龜類的四肢骨骼存在差異。陸生龜類前肢骨比水生龜?shù)亩?，而陸生龜?shù)乃闹使軤?，水生龜?shù)乃闹珵楸馄綘?，說明陸生龜類前肢骨的尺骨、橈骨之間和后肢骨的腓骨、脛骨之間的空隙比水生龜類的空隙小，并且在陸地支撐著厚重高聳的龜殼，陸生龜?shù)墓趋栏謮眩旑惖乃闹趋垒^為細(xì)長(zhǎng)，尺骨、橈骨之間和腓骨、脛骨之間的空隙較大[36-37]。本研究中，黃緣閉殼龜屬于兩棲龜類，其前肢骨長(zhǎng)而較粗壯，而后肢骨較短并且比前肢骨扁平，說明黃緣閉殼龜尺骨、橈骨之間的空隙比腓骨、脛骨之間的空隙大。Lindeman等[38]研究發(fā)現(xiàn)，矩斑圖龜(Graptemysouachitensis)和滑鱉(Apalonemutica)為河流型物種具有較長(zhǎng)的四肢和指(趾)。黃緣閉殼龜?shù)闹腹?、趾骨和跖骨比陸生龜類的長(zhǎng)，掌骨較為扁平，前掌為五爪，后掌為四爪，在陸地上爬行時(shí)主要依靠前肢骨支撐身體。

4 結(jié)論

綜合以上骨骼研究發(fā)現(xiàn)黃緣閉殼龜具有與生活習(xí)性相匹配的骨骼結(jié)構(gòu)，頭骨和背甲呈卵圓形，頭部與身體占比小，頭部收縮自如，方便捕食和反捕食；前肢骨比后肢骨長(zhǎng)而粗壯，可以支撐其在陸地活動(dòng)，背腹甲可閉合又為其安全提供保障，符合野外生存的特性。同時(shí)也證明X射線透視法可以較為清晰地觀察黃緣閉殼龜?shù)墓趋澜Y(jié)構(gòu)，但由于物種特性，龜類背腹甲的影響，軀椎、薦椎和尾椎骨清晰度略低。X射線透視法可以實(shí)現(xiàn)無(wú)傷化龜類骨骼研究，并進(jìn)一步豐富黃緣閉殼龜?shù)幕A(chǔ)研究數(shù)據(jù)，并為開展黃緣閉殼龜相關(guān)研究及龜類化石探究提供最佳的參考資料。