基于頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析山烏桕蜜揮發(fā)性成分

羅麗萍，喬 寧，郭利敏，劉 韜,3

(1.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330031；2.贛州海關(guān)，江西 贛州 341000； 3.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000)

山烏桕(Triadicacochinchinensis)是我國(guó)南方夏季的主要蜜源植物之一，通常 4～6月份開(kāi)花，其群體花期可維持30～40 d，花單性，雌雄同株，其花序可生長(zhǎng)至4～9 cm。山烏桕主要分布于我國(guó)江西、浙江、福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、云南及貴州等長(zhǎng)江以南各省區(qū)，此外印度、緬甸等國(guó)也有分布，其葉片在秋冬季落葉之前由淡綠色轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅色，因此又稱為紅葉烏桕[1]。山烏桕群體花期較長(zhǎng)，泌蜜量大，夏季大流蜜期強(qiáng)群產(chǎn)量更可高達(dá)25 kg/群。雖然產(chǎn)量較大，但山烏桕蜜的潤(rùn)喉性較差，結(jié)晶粒較粗，因此售價(jià)較低，銷量增長(zhǎng)緩慢。目前對(duì)于山烏桕蜜的研究主要集中在食品加工領(lǐng)域，研究人員以山烏桕蜜為發(fā)酵基質(zhì)，篩選合適的菌種，開(kāi)發(fā)蜂蜜酒和醋等產(chǎn)品[2-4]。作為發(fā)酵原料雖然可以部分解決銷量問(wèn)題，但是限于釀酒的成本控制，無(wú)法從根本上解決山烏桕蜜售價(jià)低，蜂農(nóng)效益較低的困擾。

蜂蜜的氣味是其感官特征的重要組成部分，賦予了蜂蜜獨(dú)特的風(fēng)味，也直接影響了人們的購(gòu)買選擇。氣味成分主要來(lái)源于植物，在加工儲(chǔ)存過(guò)程中由于溫度、酶以及微生物的作用，其組成和含量也會(huì)發(fā)生改變。近年來(lái)，隨著對(duì)單花蜜獨(dú)特的風(fēng)味和藥理特性的深入研究，消費(fèi)者對(duì)單花蜂蜜的需求不斷增加，極大地增加了其商業(yè)價(jià)值，但是也造成了以次充好的現(xiàn)象，而氣味成分作為蜂蜜最典型的指紋圖譜之一，研究人員已將其作為蜂蜜植物源鑒別的有效工具。

蜂蜜中含有600多種揮發(fā)性化合物，種類包括：烴類、醛類、高級(jí)醇類、酮類、脂肪和其他羧酸類、酯類、苯及其衍生物(呋喃和吡喃)、類異戊二烯類、倍半萜及其衍生物和硫等化合物[5]。這些化合物給蜂蜜帶來(lái)了不同的風(fēng)味：如乙酸會(huì)帶來(lái)辛辣的風(fēng)味，而丁酸和己酸具有酸敗的哈喇味[6]。研究人員最初采用同時(shí)蒸餾萃取(Simultaneous Distillation-Extraction，SDE)的方式分析蜂蜜中的揮發(fā)性成分，但是高溫的提取方式會(huì)產(chǎn)生糠醛類物質(zhì)[7]。另一種采用超聲波溶劑萃取(Ultrasonic Solvent Extraction,USE)的方法能夠顯著降低提取時(shí)間、提高萃取效率，但是提取溶劑(如丙酮、氯仿等)較為昂貴且具有毒性，萃取物也常含有非揮發(fā)性化合物不適宜用于氣相分析[8]。隨著技術(shù)的進(jìn)步，頂空(Headspace)、固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)和固相微萃取(Solid Phase Micro-Extraction，SPME)等方式也應(yīng)用于蜂蜜氣味分析中。SPME具有提取效率高、無(wú)需復(fù)雜預(yù)處理步驟以及可以耦合氣相、液相和質(zhì)譜類分析儀器的優(yōu)點(diǎn)，它與頂空結(jié)合，能夠使萃取頭免受蜂蜜中糖基質(zhì)的影響，是目前主流的分析方法。

Machado等通過(guò)比較不同研究中單花蜜特征氣味物質(zhì)出現(xiàn)的頻率，描述列舉了每個(gè)樣品中5種主要的化合物，總結(jié)了20種不同植物源蜂蜜的氣味特征。作者推測(cè)順式芳樟醇氧化物、3-甲基-3-丁烯-1-醇和庚醛是洋槐蜜的特征性揮發(fā)性化合物；3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和異戊酸是蕎麥蜂蜜中最常見(jiàn)的成份；另外，部分揮發(fā)物如：苯甲醛、糠醛、辛烷、壬烷、2-苯乙醇、壬醛或苯乙醛在不同的單花蜂蜜中都能檢測(cè)到，因此它們不適合作為單花蜜的標(biāo)記物[9]。

山烏桕蜜的揮發(fā)性成分尚未有研究報(bào)道，因此本文以山烏桕、棗樹(shù)、荊條、洋槐、油菜和椴樹(shù)蜜為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)SPME和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)技術(shù)，以期找到山烏桕蜜的特征揮發(fā)性化合物以及共有物質(zhì)，并通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)建立6種蜂蜜的植物源鑒別方法，為蜂蜜揮發(fā)性化合物的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜樣品：從江西、山東、湖北、遼寧、吉林、黑龍江、陜西、河北、河南、和內(nèi)蒙古等省份的養(yǎng)蜂人處實(shí)地采集樣本52份，從專業(yè)市場(chǎng)購(gòu)買樣本14份。按蜜源和數(shù)量進(jìn)行編號(hào)，其中山烏桕蜜樣品12份(TC1-12)、棗樹(shù)蜜樣本10份(JU1-10)、椴樹(shù)蜜樣本14份(LI1-14)、荊條蜜樣本10份(CA1-10)、洋槐蜜樣本13份(AC1-13)、油菜蜜樣本7份(RA1-7)。樣本保存于4℃冰箱備用。

實(shí)驗(yàn)主要試劑：分析級(jí)氯化鈉、正辛醇購(gòu)于上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材有限公司，C7-C40正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于O2si公司，50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭(1 cm)購(gòu)于Supelco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS(7890A-7000C)，美國(guó)安捷倫科技有限公司；GC多功能自動(dòng)進(jìn)樣器(RTCPAL)，瑞士思特斯分析儀器有限公司；電子分析天平(BSA224S)，德國(guó)賽多利斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蜂蜜揮發(fā)性成分萃取

40℃水浴中均質(zhì)化蜂蜜樣本，稱取5.0 g用蒸餾水溶解并定容至10 mL，配置成濃度為0.5 g·ml-1的蜂蜜水溶液。

將10 mL蜂蜜水溶液轉(zhuǎn)移至20 ml頂空瓶中，加入200 μl(10 μg·ml-1)正辛醇內(nèi)標(biāo)溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣器中并設(shè)定：萃取前老化30 min，加熱溫度65℃，平衡時(shí)間15 min，振搖速度250 r·min-1，萃取深度20 mm，萃取時(shí)間55 min。

1.3.2 儀器分析方法

萃取完成后轉(zhuǎn)移至GC進(jìn)樣口解吸，時(shí)間3min，解吸深度35 mm。氣相采用脈沖不分流模式，采用30 mHP-5MS-UI非極性毛細(xì)管色譜柱，前進(jìn)樣口溫度為250℃，色譜柱流量1.5 ml·min-1,氦氣流量2.25 ml·min-1，氮?dú)饬髁?.5 ml·min-1。質(zhì)譜采用MS1 SCAN 模式，質(zhì)量范圍30～500 U，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃。氣相梯度升溫程序：起始溫度45℃并保持2 min，后以3℃·min-1速率升至180℃，后以10℃·min-1,速率升至250℃，以300℃后運(yùn)行3min，共計(jì)57 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用Masshunter采集數(shù)據(jù)并通過(guò)UnknownsAnalys軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行解卷積、峰提取、峰識(shí)別和保留指數(shù)計(jì)算等批處理，通過(guò)比對(duì)NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)以及保留指數(shù)建立本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，匯總山烏桕蜜等其他5種蜂蜜的物質(zhì)信息和組分面積，采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法(Wilcox test)比較山烏桕蜜與其他5種蜂蜜之間的組分含量差異。采用偏最小二乘法判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA)建立6種植物源蜂蜜的判別模型，利用受試者工作曲線(Receiver Operating Curve ,ROC)的曲線下面積(Area Under Curve ,AUC)比較分類模型性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 山烏桕蜜的特征揮發(fā)性成分

山烏桕蜜中共計(jì)檢出氣味化合物29種，圖1為山烏桕蜜典型揮發(fā)性成分色譜圖，標(biāo)注1～12的峰為所有山烏桕蜜樣品中檢出頻率大于50%的成分。

t/min圖1 山烏桕蜜典型揮發(fā)性成分色譜圖Figure 1 Typical chromatograms of volatile components of Triadica cochinchinensis honey

經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、對(duì)比碎片峰和保留指數(shù)：峰1～4分別鑒定為異戊醇，2-甲基-1-丁醇，正辛醛，β-苯乙醇，它們的檢出頻率均大于90%，應(yīng)為山烏桕蜜中常檢出揮發(fā)性化合物；峰5～12分別鑒定為壬醛、2,5-二甲基苯甲醛、乙酸苯乙酯、苯乙醛、十六酸乙酯、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)、壬醇和正庚醛(表1)。

表1 山烏桕蜜主要揮發(fā)性成分Table 1 Themainvolatile components of Triadica cochinchinensis honey

正辛醛、β-苯乙醇、壬醛和乙酸苯乙酯的解卷積色譜峰和質(zhì)譜碎片比對(duì)見(jiàn)圖2。

圖2 解卷積提取峰3(A)、4(B)、5(C)和7(D)的色譜圖、質(zhì)譜峰與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)Figure2 The chromatograms and mass spectra of peaks 3(A),4(B) ,5(C)and 7(D) were extracted by deconvolution and compared with the database

對(duì)比12種成分在其他5種蜂蜜中的檢出頻率和峰面積(表2)，正辛醛、β-苯乙醇和壬醛在6種蜂蜜樣品中檢出頻率均大于70%。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，張麗珍等[3]在山烏桕蜂蜜醋中同樣檢出這3種成分，且β-苯乙醇的相對(duì)含量達(dá)到16.42%。史瑩等[4]從山烏桕蜂蜜酒中檢出β-苯乙醇和壬醛，并且認(rèn)為具有較強(qiáng)新鮮果香和蜂蜜香味的己酸乙酯可構(gòu)成酒的典型香氣。另有研究表明辛醛和壬醛是洋槐蜜和松樹(shù)蜜中主要揮發(fā)性成分之一[10,11]。任佳淼等[12]在16種不同蜜源蜂蜜中均測(cè)定到β-苯乙醇。陳奇奇等[13]發(fā)現(xiàn)壬醛是棗樹(shù)花樣品的共有成分之一。正辛醛屬于脂肪醛類，具有強(qiáng)烈的脂肪和水果香氣，在濃度較低時(shí)具有令人愉悅的甜橙香氣，在茶樹(shù)、柑橘等植物精油中普遍存在，主要用于柑橘類香料的調(diào)和。與正辛醛類似，壬醛具有強(qiáng)烈的蜜蠟花香和甜橙氣息，其稀乙醇溶液有香草醛香調(diào)。

表2 12種成分在6種蜂蜜中的檢出頻率(A)和平均相對(duì)面積比較(B)Table 2 Comparison of detection frequency (A) and average relative area (B) of 12 components among 6 kinds honey

天然的β-苯乙醇主要存在于顯花植物的花果和提取的精油中，具有蜂蜜香氣，同時(shí)也是許多成熟水果玫瑰香味的主要來(lái)源，因此常用于食品、化妝品、煙草等產(chǎn)品[14]。研究表明β-苯乙醇在植物中的合成代謝起始于苯丙氨酸。Wahlberg等[15]發(fā)現(xiàn)隨著陳化的進(jìn)行，烤煙中的苯丙氨酸和木質(zhì)素由苯丙氨酸裂解酶催化生成苯甲酸、苯乙醛、β-苯乙醇等香味物質(zhì)。Tieman等[16]通過(guò)同位素示蹤法研究了番茄中苯丙氨酸—苯乙胺—苯乙醛—β-苯乙醇的合成途徑以及相應(yīng)的3個(gè)關(guān)鍵酶芳香族氨基酸脫羧酶(Aromatic amino-acid decarboxylase,AADC)、單胺氧化酶(Monoamine oxidase,MAO)和苯乙醛還原酶(Phenylacetaldehyde reductase,PAR)。根據(jù)AADC的基因序列信息，楊曉等[17]從葡萄中克隆了控制β-苯乙醇合成的關(guān)鍵酶基因片段，證明在葡萄成熟及后熟階段隨著AADC的表達(dá)量增高，啟動(dòng)了苯丙氨酸代謝合成β-苯乙醇。

植物源揮發(fā)性有機(jī)物(Biogenic volatile organic compounds,BVOCs)是植物體內(nèi)通過(guò)次生代謝途徑合成的沸點(diǎn)低、揮發(fā)性強(qiáng)的小分子化合物。研究表明，不同的植物器官，如葉片、花瓣和花粉，釋放的BVOCs不盡相同，花主要釋放萜類、醇類、酯類和烴類等，枝葉主要釋放萜類、醛類和醇類等[18]。

因此我們推斷這3種物質(zhì)主要來(lái)源于植物。將3種物質(zhì)的峰面積進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換(log2)，將5種蜂蜜與山烏桕蜜進(jìn)行非參數(shù)差異檢驗(yàn)(圖3)，山烏桕蜜中正辛醛的含量顯著高于洋槐蜜，β-苯乙醇的含量顯著低于椴樹(shù)和荊條蜜，壬醛含量均顯著低于其他樣品。結(jié)合3種物質(zhì)的氣味屬性，我們推測(cè)由正辛醛、β-苯乙醇和壬醛構(gòu)成了蜂蜜的基調(diào)香氣，呈現(xiàn)了蜂蜜固有的蜜香和花香，但是含量的差異也使不同蜂蜜的基香出現(xiàn)分化。國(guó)際蜂蜜委員會(huì)規(guī)范定義了蜂蜜的氣味，比如花香可以分為稀薄和濃郁，芳香可以分為辛辣、木質(zhì)、樹(shù)脂和香脂，果香可以分為新鮮、檸檬和甜蜜等。也有研究人員認(rèn)為果香和花香并不能很好地區(qū)分蜂蜜，一些如焦糖、煙熏、蜂膠和辛辣味能夠更好地反應(yīng)蜂蜜在提取過(guò)程中發(fā)生的美拉德反應(yīng)[19-20]。

注：圖中5種蜂蜜與山烏桕蜜組進(jìn)行非參數(shù)秩檢驗(yàn)(wilcoxon test)比較其各組分的差異，其中ns表示差異不顯著；*，**，***，****分別表示p<0.05，0.01，0.001，0.0001.圖3 6種植物源蜂蜜中正辛醛(A)、β-苯乙醇(B)與壬醛(C)的峰面積(log2)對(duì)比Figure3 Comparison of the peak area (log2) of n-octanal(A),β-phenylethyl alcohol (B) and nonanal (C) in 6 botanical originkinds honey

對(duì)比其他9組分可知，山烏桕蜜具有以下特征：(1)、異戊醇和2-甲基-1-丁醇檢出頻率>90%，但其峰面積均小于油菜蜜；(2)、2,5-二甲基苯甲醛和乙酸苯乙酯檢出頻率>70%，但其峰面積均小于椴樹(shù)蜜；(3)、苯乙醛和十六酸乙酯檢出頻率>60%，但苯乙醛的峰面積顯著小于荊條蜜且與棗樹(shù)蜜接近，十六酸乙酯的峰面積顯著低于油菜蜜；(4)、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)和正庚醛檢出頻率>50%，且在其他5種蜂蜜中均未檢出。在山烏桕蜜中，正辛醛、苯乙醇、壬醛和乙酸苯乙酯的峰面積分別占12種組分的37.45%，44.20%，1.27 %和7.64%且總和大于90%。因此上述2種成分面積雖然顯著高于其他5種蜂蜜，但是其面積占比在組內(nèi)相對(duì)較小(0.40 %和0.31%)。壬醇的檢出頻率>50%，但其峰面積顯著小于棗樹(shù)和荊條蜜，與油菜蜜較為接近。

綜上所述，山烏桕蜜的氣味特征主要呈現(xiàn)：清香帶甜，這主要由苯乙醇為主體貢獻(xiàn)；甜香濃厚，由乙酸苯乙酯等貢獻(xiàn)；貫穿整體的花香和木香則由壬醛、正庚醛提供；稀薄的奶香氣息則由異戊醇和2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)貢獻(xiàn)；因缺乏5-甲基糠醛和2-乙?；秽然衔?，因此不具有焦糖香。

2.2 6種蜂蜜植物源鑒別分析

將山烏桕蜜中檢出頻率大于50%的成分與5種單花蜜進(jìn)行了頻率以及峰面積的對(duì)比分析后，發(fā)現(xiàn)不同植物源蜂蜜之間具有基調(diào)相同的氣味成分：正辛醛、β-苯乙醇和壬醛，但其他組分特征差異明顯。基于上述結(jié)果，綜合6種蜂蜜的81種揮發(fā)性成分，采用PLS-DA方法建立山烏桕蜜等6種蜂蜜的分類模型，結(jié)果顯示：

(1)樣品總體可分為3類(圖4-A)，其中椴樹(shù)蜜與其他5種植物源蜂蜜區(qū)分界限明顯。以分類模型下的主成分1、2和3繪制單個(gè)植物源蜂蜜與其他5種植物源進(jìn)行區(qū)分時(shí)的ROC曲線(圖4-B)，并積分計(jì)算其曲線的AUC值。椴樹(shù)蜜的AUC值為0.9979，說(shuō)明本模型可以有效區(qū)分椴樹(shù)蜜與其他5種植物源蜂蜜。載荷向量圖(圖4-C)顯示相較于其他蜂蜜，玫瑰醚、順式玫瑰氧化物、薄荷呋喃和異檸檬醛等26種化合物是椴樹(shù)蜜中的特征性化合物，它們?cè)诒痉诸惸Ｐ椭胸暙I(xiàn)較大；

圖4 6種植物源蜂蜜PLS-DA區(qū)分模型的得分圖(A)、受試者工作曲線(B)和載荷圖(C)Figure4 Scoreplot(A) ,receiver operating curve(B) and loading plot (C)of PLS-DA discrimination model of 6 kinds of botanical origin honey

(2)荊條蜜和棗樹(shù)蜜樣品分布區(qū)域較為接近，它們的AUC分別為0.8482和0.9407，說(shuō)明本模型區(qū)分棗樹(shù)蜜的性能要高于荊條蜜，但兩者均低于椴樹(shù)蜜。其中壬醛、苯乙醛和對(duì)甲苯甲醚以及煙堿甲腈、癸醛和辛烷等化合物分別對(duì)荊條和棗樹(shù)蜜的區(qū)分起到較大貢獻(xiàn)；

(3)山烏桕蜜和油菜蜜樣品分布區(qū)域接近，它們的AUC值分別為0.9979和0.9909?？芍灸Ｐ涂梢杂行^(qū)分中山烏桕蜜和油菜蜜。山烏桕蜜中的正庚醛和2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)是其特征化合物，對(duì)其區(qū)分起到較大作用，它們的載荷值分別為0.049和0.047，這與單變量對(duì)比分析一致。洋槐蜜氣味偏淡且成分含量偏低，特征物質(zhì)較少，且與其他植物源蜂蜜重合區(qū)域較多，分布于5種蜂蜜聚類中心，其AUC值為0.7239，說(shuō)明本模型對(duì)洋槐蜜的區(qū)分性能低于其他5種蜂蜜。

3 結(jié)論

本文通過(guò)GC-MS技術(shù)對(duì)比了山烏桕蜜與5種蜂蜜揮發(fā)性成分的共同點(diǎn)和差異性。發(fā)現(xiàn)6種蜂蜜共有的成分為正辛醛、β-苯乙醇和壬醛，它們構(gòu)成了蜂蜜的基調(diào)香氣，貢獻(xiàn)了蜂蜜獨(dú)有的蜜蠟香和水果玫瑰香味。山烏桕蜜特征性成分為正庚醛和2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環(huán)?；?1種揮發(fā)性化合物組成建立的分類模型能夠有效區(qū)分包含椴樹(shù)蜜、山烏桕蜜、油菜蜜、荊條蜜和棗樹(shù)蜜在內(nèi)的5種蜂蜜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為山烏桕蜜的氣味研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，闡述了蜂蜜具有的基調(diào)氣味成分，為蜂蜜揮發(fā)性化合物的深入研究提供參考。