王莉莉， 趙慶佳， 張 娜， 郭慶啟,3

(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院1，哈爾濱 150040) (哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院2，哈爾濱 150076) (黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，哈爾濱 150040)

植物甾醇屬于三萜烯化合物[1]，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用降低膽固醇在小腸內(nèi)的溶解度和吸收[2]，從而降低人體膽固醇水平。研究表明，植物種子油中植物甾醇含量為0.956～3.527 mg/g，通常以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的形式廣泛存在于各種堅(jiān)果、種子和植物油中[3]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇具有降血脂[4]、預(yù)防心血管疾病[5]、抗腫瘤[6]、減肥[7]等作用，在食品、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[8]。

近年來(lái)，人們廣泛關(guān)注安全高效的天然提取物及其活性，同時(shí)適宜的提取方法也是研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)熱輔助回流提取耗能耗時(shí)，因此基于外部能量場(chǎng)的輔助提取被認(rèn)為省時(shí)高效以及耗能較低[9，10]。目前關(guān)于提取方法對(duì)植物甾醇提取效果的影響已有報(bào)道，如龐利蘋(píng)等[11]、夏秋敏等[12]、郭瑞等[13]等分別采用微波輔助提取、超聲波輔助提取、超聲波輔助皂化提取了南瓜籽甾醇、蘋(píng)果籽甾醇、麥角甾醇，得率分別為0.892、2.183、0.880 mg/g，均高于普通的溶劑提取法。而高虹等[14]對(duì)比超聲波法、微波法與溶劑法提取麥角甾醇，發(fā)現(xiàn)微波法的提取率比溶劑法和超聲波法提高約30%，但是3種方法對(duì)其功能性質(zhì)的影響并未深入研究。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于植物甾醇的研究多集中在不同原料來(lái)源的提取及純化等方面，同時(shí)對(duì)于其抗炎、抗氧化以及生理活性等功能的研究也較為全面，但關(guān)于同種原料、不同方法對(duì)植物甾醇的提取效果和功能性質(zhì)影響的比較與分析則是鮮有報(bào)道。

本研究以有機(jī)溶劑浸提法(簡(jiǎn)稱(chēng)“溶劑法”)為基礎(chǔ)，以紅松籽油甾醇得率為指標(biāo)，考察超聲波輔助溶劑法(簡(jiǎn)稱(chēng)“超聲波法”)、微波輔助溶劑法(簡(jiǎn)稱(chēng)“微波法”)、光波輔助溶劑法(簡(jiǎn)稱(chēng)“光波法”)對(duì)紅松籽油甾醇提取效果及功能性質(zhì)的影響。旨在選出一種提取得率高，對(duì)功能性質(zhì)影響小的甾醇提取方法，為紅松籽油甾醇的制備及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅松(Pineskoraiensis)籽食品級(jí)，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)，4-硝基苯酚丁酸酯，豬胰脂肪酶(30 000 u/g)，奧利司他(98%)，?；悄懰徕c(97%)，甘氨膽酸鈉鹽水合物(98%)，2,2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽(ABTS+)自由基(≥98.0%)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基(≥97%)，胰蛋白酶(>250 N.F.U/mg)，胃蛋白酶(≥250 u/mg)，其他所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1900 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，SCIE-NTZ-IIDM 微波光波超聲波萃取儀，Scientz-18N 冷凍干燥機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅松籽油的制備

將紅松籽手工去殼去皮，60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，取100.00 g紅松籽用粉碎機(jī)粉碎，按料液比1∶5 加入正己烷，浸提12 h后過(guò)濾，取濾液在45 ℃條件下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，制得紅松籽油。

1.3.2 紅松籽油甾醇的制備

稱(chēng)取一定質(zhì)量的紅松籽油于錐形瓶中，按料液比加入一定濃度KOH-乙醇溶液，利用不同方法(溶劑法、超聲波法、微波法、光波法)處理后，溶劑萃取分離，合并有機(jī)相后用0.5 mol/L KOH溶液洗3次，蒸餾水洗至中性，再加入無(wú)水硫酸鈉除去水分，取濾液在45 ℃條件下真空濃縮至恒質(zhì)量[15]，制得紅松籽油甾醇。

以溶劑法確定的料液比、KOH-乙醇溶液濃度、時(shí)間、溫度和萃取溶劑為基礎(chǔ)，分別對(duì)超聲波法、微波法、光波法提取紅松籽油甾醇的功率和時(shí)間進(jìn)行研究，以紅松籽油甾醇得率為指標(biāo)，詳細(xì)考察不同方法單獨(dú)處理較短時(shí)間以及處理后再次浸提，紅松籽油甾醇得率的變化情況，進(jìn)一步考察不同提取方法對(duì)紅松籽油甾醇抗氧化、胰脂肪酶活性與膽酸鹽結(jié)合能力的影響。

1.3.3 紅松籽油甾醇得率的測(cè)定方法

采用磷硫鐵顯色法測(cè)定甾醇得率[16]，用無(wú)水乙醇溶液將膽固醇配制成質(zhì)量濃度為0、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，取4 mL不同質(zhì)量濃度的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入2 mL磷硫鐵顯色劑，反應(yīng)15 min后在480 nm條件下測(cè)定溶液的吸光度值，以膽固醇質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=4.910 5x-0.000 7，(R2=0.999)；按式(1)計(jì)算紅松籽油甾醇得率。

(1)

式中：Y為紅松籽油甾醇得率/mg/g；C為紅松籽油甾醇溶液的質(zhì)量濃度/mg/mL；V為定容體積/mL；b為稀釋倍數(shù)；m為紅松籽油的質(zhì)量/g。

1.3.4 紅松籽油甾醇功能性質(zhì)的測(cè)定

利用無(wú)水乙醇溶液將最佳條件下不同方法提取的紅松籽油甾醇溶解，調(diào)至統(tǒng)一濃度作為母液，配置不同濃度的紅松籽油甾醇溶液測(cè)定其功能性質(zhì)。IC50表示自由基清除率或脂肪酶抑制率達(dá)到50%時(shí)，樣品的濃度。IC50通過(guò)SPSS 軟件(IBM SPSS Statistics 24.0)回歸分析計(jì)算。

1.3.4.1 DPPH·清除能力的測(cè)定

準(zhǔn)確移取2 mL不同濃度的紅松籽油甾醇溶液，分別加入2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)，反應(yīng)30 min后，517 nm條件下測(cè)定溶液的吸光度值[17]。按式(2)計(jì)算DPPH·清除率。

(2)

式中：Ai為紅松籽油甾醇溶液與自由基混合溶液的吸光度值；Aj為紅松籽油甾醇溶液與無(wú)水乙醇混合溶液的吸光度值；A0為自由基溶液和無(wú)水乙醇混合溶液的吸光度值。

1.3.4.2 ABTS+·清除能力的測(cè)定

取1 mL不同濃度的紅松籽油甾醇溶液，分別加入5 mL稀釋后的ABTS+和過(guò)硫酸鉀混合液，搖勻避光反應(yīng)30 min，734 nm條件下測(cè)定溶液的吸光度值[18]。按式(2)計(jì)算ABTS+·清除率。

1.3.4.3 胰脂肪酶抑制能力的測(cè)定

以4-硝基苯酚丁酸酯為底物，采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定紅松籽油甾醇對(duì)胰脂肪酶活性的抑制能力[19]。取不同濃度的紅松籽油甾醇溶液50 μL與胰脂肪酶液(5 mg/mL)100 μL混合，37 ℃保溫10 min，加入4-硝基苯酚丁酸酯(5 mmol/L)100 μL，37 ℃保溫10 min后，405 nm條件下測(cè)定溶液的吸光度值。以Tris-HcL緩沖液(100 mmol/L)為空白對(duì)照，奧利司他為陽(yáng)性對(duì)照。按式(3)計(jì)算胰脂肪酶抑制率。

(3)

式中：A2樣品組(紅松籽油甾醇溶液)的吸光度值；A1為反應(yīng)體系中無(wú)胰脂肪酶組吸光度值；A0為空白對(duì)照組吸光度值。

1.3.4.4 膽酸鹽結(jié)合能力的測(cè)定

采用模擬體外消化實(shí)驗(yàn)法測(cè)定膽酸鹽結(jié)合能力[20]。以0.4 mmol/L 甘氨膽酸鈉、0.5 mmol/L ?；悄懰徕c為母液，用0.1 mol/L pH 6.3 磷酸緩沖溶液配置不同濃度的甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c溶液，分別移取1 mL不同濃度的膽酸鹽溶液加入3 mL 60% 硫酸溶液，70 ℃水浴20 min，冰浴5 min，387 nm條件下測(cè)定溶液的吸光度值。以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到牛磺膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.901 7x+0.047 5(R2=0.998)；甘氨膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.63x+0.057(R2=0.999)。

取3 mL不同濃度紅松籽油甾醇溶液，加3 mL胃蛋白酶(10 mg/mL)和1 mL HCl溶液(0.01 mol/L)，37 ℃振蕩消化1 h，用NaOH溶液(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)pH6.3，加入4 mL胰蛋白酶(10 mg/mL)，37 ℃振蕩消化1 h，加入4 mL膽酸鹽溶液(0.4 mmol/L甘氨膽酸鈉、0.5 mmol/L?；悄懰徕c)，37 ℃振蕩消化1 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行分析。按式(4)計(jì)算膽酸鹽結(jié)合率。

(4)

式中：C1為膽酸鹽加入量/μmol；C2為膽酸鹽剩余量/μmol。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 24.0、Excel 2010與Origin 2018軟件進(jìn)行圖表繪制及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅松籽油甾醇提取工藝的研究

2.1.1 料液比對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

如表3、表4所示，油脂與堿性物質(zhì)結(jié)合后，以酯態(tài)形式存在的甾醇被水解為對(duì)應(yīng)的植物甾醇，生成溶于水的高級(jí)脂肪酸鹽、甘油和不溶于水的甾醇，甾醇可通過(guò)有機(jī)溶劑萃取制備。在KOH-乙醇溶液濃度為1 mol/L、時(shí)間120 min、溫度75 ℃、萃取溶劑為乙酸乙酯的條件下，考察料液比對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響，結(jié)果如圖1。

注：圖中小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同。圖1 料液比對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

料液比為1∶4 時(shí)紅松籽油甾醇得率最大(P<0.05)，此時(shí)紅松籽油和KOH-乙醇溶液反應(yīng)完全，當(dāng)料液比小于1∶4 時(shí)，紅松籽油和KOH-乙醇溶液未完全反應(yīng)，致使與脂肪酸結(jié)合的甾醇未完全游離出來(lái)，溶劑萃取游離甾醇時(shí)，導(dǎo)致少部分結(jié)合態(tài)甾醇受到損失。料液比大于1∶4 時(shí)紅松籽油甾醇基本已經(jīng)浸出，而過(guò)大的料液比會(huì)使其他物質(zhì)溶出，反而影響紅松籽油甾醇得率。紅松籽油甾醇得率隨料液比先增大后減小的趨勢(shì)與趙茜茜等[21]提取文冠果仁油甾醇相似，因此選擇料液比為1∶4。

2.1.2 KOH-乙醇溶液濃度對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

在料液比為1∶4、時(shí)間120 min、溫度75 ℃、萃取溶劑為乙酸乙酯的條件下，考察KOH-乙醇溶液濃度對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響，見(jiàn)圖2。氫氧化鉀在提取過(guò)程中起催化作用，可以解離出酯態(tài)甾醇[14]，但紅松籽油在氫氧化鉀溶液中的溶解度有限，故加入乙醇來(lái)增加紅松籽油在氫氧化鉀溶液中的溶解度，加快反應(yīng)的進(jìn)行。隨KOH-乙醇溶液濃度的增加，紅松籽油甾醇得率呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)KOH-乙醇溶液濃度為1 mol/L時(shí)，紅松籽油甾醇得率最大(P<0.05)，達(dá)到(1.763±0.046) mg/g，當(dāng)濃度繼續(xù)增大時(shí)，氫氧化鉀殘留過(guò)多，水洗次數(shù)過(guò)多導(dǎo)致甾醇得率下降，因此選擇溶液濃度為1 mol/L。

圖2 KOH-乙醇溶液濃度對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

2.1.3 浸提時(shí)間對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

在料液比1∶4、KOH-乙醇溶液濃度1 mol/L、溫度75 ℃、萃取溶劑為乙酸乙酯的條件下，考察浸提時(shí)間對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響，結(jié)果如圖3。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

浸提時(shí)間60～90 min紅松籽油甾醇得率快速增長(zhǎng)，90 min時(shí)得率最大(P<0.05)，達(dá)到(1.915±0.055) mg/g，90～180 min紅松籽油甾醇得率呈顯著下降趨勢(shì)。陳佳麗等[22]認(rèn)為當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到平衡點(diǎn)后，溶劑總量等因素會(huì)破壞甾醇的溶解能力，導(dǎo)致甾醇得率下降，故選擇浸提時(shí)間為90 min。

2.1.4 浸提溫度對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

料液比為1∶4、KOH-乙醇溶液濃度為1 mol/L、時(shí)間90 min、萃取溶劑為乙酸乙酯的條件下，考察浸提溫度對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響，結(jié)果如圖4。

圖4 浸提溫度對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

溫度從70 ℃至80 ℃，紅松籽油甾醇得率快速上升，當(dāng)超過(guò)80 ℃時(shí)得率略有下降。這可能是在較高的溫度下處理較長(zhǎng)時(shí)間，導(dǎo)致紅松籽油甾醇降解加快，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)紅松籽油甾醇發(fā)生包裹且有其他雜質(zhì)溶出導(dǎo)致得率下降。當(dāng)干燥溫度超過(guò)80 ℃時(shí)，會(huì)加快油菜中的部分甾醇的降解速率[23]，故選擇80 ℃為浸提溫度。

2.1.5 浸提后萃取溶劑對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

在料液比為1∶4、KOH-乙醇溶液濃度為1 mol/L、時(shí)間90 min、溫度80 ℃的條件下，考察萃取溶劑對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響，結(jié)果如圖5。

圖5 萃取溶劑對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

紅松籽油甾醇得率與溶劑和提取液的分層程度以及是否形成乳化液有關(guān)，用石油醚萃取時(shí)，分層不清晰導(dǎo)致紅松籽油甾醇損失。由圖5可知5種溶劑萃取紅松籽油甾醇得率順序?yàn)橐宜嵋阴?正己烷>乙醚>氯仿>石油醚，龐麗萍等[11]利用微波法篩選溶劑對(duì)南瓜籽甾醇提取率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取效果最好，乙酸乙酯相對(duì)安全且符合GB 2760—2014中允許使用的食品加工助劑。因此確定乙酸乙酯為萃取溶劑。

溶劑法提取最佳工藝條件為：料液比1∶4 ，KOH-乙醇溶液濃度1 mol/L，浸提時(shí)間90 min，溫度80 ℃，萃取溶劑為乙酸乙酯，此工藝條件下紅松籽油甾醇得率為(2.129±0.046) mg/g。

2.2 不同提取方法對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

2.2.1 超聲波法對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

如表3、表4所示，以溶劑法確定的最佳條件為基礎(chǔ)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定超聲波法、微波法、光波法的浸提功率和時(shí)間，單一方法處理后繼續(xù)浸提至總時(shí)間為90 min，考察紅松籽油甾醇得率的變化情況。不同超聲波時(shí)間和功率處理?xiàng)l件下的甾醇得率結(jié)果如表1、表2所示。

表1 超聲波時(shí)間對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

表2 超聲波功率對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

超聲波法(560 W，40 min)提取的紅松籽油甾醇得率最高(P<0.05)，為(2.134±0.010) mg/g，超聲波后繼續(xù)浸提甾醇得率為(2.347±0.013) mg/g。超聲波法提取是通過(guò)破碎、侵蝕、毛細(xì)化、脫紋理等不同的獨(dú)立或聯(lián)合機(jī)制起作用[24]。隨功率和時(shí)間的增長(zhǎng)，加速分子碰撞，細(xì)胞破裂，紅松籽油甾醇溶出量越多得率增大，當(dāng)膜破碎完全后雜質(zhì)溶出越多得率下降。王麗波等[25]從南瓜籽油中以乙酸乙酯為提取溶劑，超聲功率500 W，時(shí)間50 min時(shí)甾醇的含量為1.106 mg/g。對(duì)比超聲波法單獨(dú)處理及處理后繼續(xù)浸提，紅松籽油甾醇得率的變化情況，發(fā)現(xiàn)超聲波(560 W，40 min)時(shí)單獨(dú)提取比例占總量的(90.925±0.156)%，繼續(xù)浸提50 min后得率占總量的(9.075±0.312)%，表明超聲波法短時(shí)間內(nèi)便可提取出大部分紅松籽油甾醇。

2.2.2 微波法對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

如表3、表4所示，微波功率500 W，時(shí)間1 min時(shí)紅松籽油甾醇得率最高(P<0.05)，為(2.263±0.013) mg/g，微波后繼續(xù)浸提甾醇得率為(2.289±0.015) mg/g，隨微波功率和時(shí)間的增長(zhǎng)，紅松籽油甾醇的得率下降。這可能是當(dāng)微波功率小于500 W時(shí)，隨微波功率增大，微波效應(yīng)增強(qiáng)，紅松籽油細(xì)胞內(nèi)極性分子加速振動(dòng)使甾醇快速溶出，得率增加，而微波功率大于500 W時(shí)，雜質(zhì)開(kāi)始溶出，導(dǎo)致紅松籽油甾醇得率下降。徐艷陽(yáng)等[26]以微波功率539 W，微波時(shí)間41 s提取桑白皮中甾醇，發(fā)現(xiàn)功率超過(guò)539 W甾醇得率下降。微波提取是300 MHz～300 GHz的頻帶內(nèi)進(jìn)行的[27]。微波加熱有偶極重定向和離子極化兩種機(jī)制，在微波應(yīng)用中，當(dāng)偶極子與電場(chǎng)重新排列時(shí)，分子發(fā)生碰撞產(chǎn)生熱量，離子向電場(chǎng)移動(dòng)時(shí)，離子發(fā)生碰撞產(chǎn)生熱量[28]。微波萃取時(shí)間短、溶劑消耗少、效率高，但容易導(dǎo)致極熱敏化合物的降解[10]。

表3 微波功率對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

表4 微波時(shí)間對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

2.2.3 光波法對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

如表5、表6所示，光波功率440 W，時(shí)間10 min時(shí)紅松籽油甾醇得率最高(P<0.05)，為(2.198±0.010) mg/g，這可能是光波的迅速制熱功能使紅松籽油與KOH-乙醇溶液快速充分反應(yīng)，與脂肪酸結(jié)合的鍵快速斷裂甾醇單體游離出來(lái)，之后隨光波功率和時(shí)間的增長(zhǎng)，紅松籽油中脂肪酸與乙醇反應(yīng)生成脂肪酸乙酯，隨溶劑與甾醇一起萃取出來(lái)，導(dǎo)致甾醇得率下降。

表5 光波功率對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

表6 光波時(shí)間對(duì)紅松籽油甾醇得率的影響

當(dāng)超聲波法、微波法、光波法單獨(dú)處理時(shí)，微波法(500 W、1 min)提取的紅松籽油甾醇得率最高(2.263±0.013)mg/g，單獨(dú)提取比例占總量的(98.864±0.160)%，繼續(xù)浸提89 min后得率占總量的(1.136±0.320)%。超聲波法、光波法單獨(dú)提取比例分別為(90.925±0.156)%、(97.950±0.244)%，表明超聲波法、微波法、光波法單獨(dú)提取紅松籽油甾醇在總提取過(guò)程中起主導(dǎo)作用。高虹等[14]、徐艷陽(yáng)等[26]對(duì)比超聲波法、微波法與溶劑法提取麥角甾醇、桑白皮甾醇，發(fā)現(xiàn)微波法提取效果最好。而Oludemi等[29]利用熱輔助、超聲、微波提取從姬松茸殘?jiān)刑崛←溄晴薮?，認(rèn)為超聲提取法效果最好，能夠獲得高含量麥角甾醇。胡代花等[30]比較了乙醇超聲提取、超聲輔助皂化提取和傳統(tǒng)回流提取金針菇的麥角甾醇時(shí)發(fā)現(xiàn)乙醇超聲提取更完全，效率更高。有研究認(rèn)為認(rèn)為超聲波法提取植物甾醇更具有實(shí)用價(jià)值，可顯著降低能耗[13,31,32]。

2.3 不同方法提取紅松籽油甾醇對(duì)自由基的清除效果

對(duì)溶劑法最佳條件、超聲波法(560 W，40 min)、微波法(500 W，1 min)、光波法(440 W，10 min)單獨(dú)處理時(shí)提取的紅松籽油甾醇清除自由基能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。不同方法提取的紅松籽油甾醇都具有抗氧化性，且紅松籽油甾醇和VE的濃度與DPPH·、ABTS+·清除率成正相關(guān)。由圖6a看出不同方法提取的紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，DPPH·清除率均達(dá)到最大且超聲波法、微波法和溶劑法提取的甾醇對(duì)DPPH·清除效果差異不顯著(P>0.05)，其IC50值分別為(0.802±0.063)、(0.785±0.041)、(0.882±0.043) mg/mL，而光波法DPPH·清除率為(89.692±2.102)%，IC50為(0.987±0.032) mg/mL。這可能是光波能迅速制熱使細(xì)胞內(nèi)溶物沸騰破壞了紅松籽油甾醇的活性。而超聲波能促進(jìn)有效物質(zhì)溶出，不易破壞物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)[33]。由圖6b可以看出紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度在1～4 mg/mL ABTS+·清除率呈快速上升趨勢(shì)并趨于穩(wěn)定。紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，不同處理方法對(duì)ABTS+·清除效果表現(xiàn)為超聲波法>微波法>光波法>溶劑法。紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度為4 mg/mL，不同處理方法對(duì)ABTS+·清除效果差異不顯著(P>0.05)，均表現(xiàn)為較好的抗氧化效果。田丹丹等[34]發(fā)現(xiàn)牛油果中植物甾醇因有較多β-谷甾醇使DPPH·清除率高于VE，且由于植物甾醇C-3位極性羥基中的氫電子轉(zhuǎn)移給了自由基，清除了DPPH·達(dá)到抗氧化效果。朱雪梅等[35]發(fā)現(xiàn)松籽油中僅含有β-谷甾醇和菜籽甾醇，且β-谷甾醇是菜籽甾醇的8倍。表明紅松籽油甾醇具有良好的抗氧化能力。

2.4 不同方法提取紅松籽油甾醇對(duì)胰脂肪酶活性的抑制效果

如圖7所示，不同方法提取的紅松籽油甾醇均隨著濃度的增大，胰脂肪酶抑制率增大。紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度在0.6～1.8 mg/mL內(nèi)，光波法提取的紅松籽油甾醇相較于其他3種方法對(duì)胰脂肪酶抑制活性差異顯著(P<0.05)。紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，4種方法提取的紅松籽油甾醇對(duì)胰脂肪酶抑制率達(dá)到最大。超聲波法、微波法、光波法和溶劑法提取的紅松籽油甾醇對(duì)胰脂肪酶活性抑制的IC50分別為(1.322±0.020)、(1.620±0.030)、(2.056±0.024)、(1.585±0.031) mg/mL。奧利司他IC50為(0.400±0.045) mg/mL。楊鵬等[36]以?shī)W利司他為陽(yáng)性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)蕎麥黃酮和奧利司他對(duì)胰脂肪酶抑制的IC50分別為1.94、0.47 mg/mL。胰脂肪酶是食品中分解脂肪的主要酶之一，抑制胰脂肪酶活性，會(huì)減少三酰甘油分解，從而降低身體吸收的量而起到降脂作用[37]。研究表明植物甾醇可以抑制與膽固醇吸收有關(guān)的酶活性[38]。奧利司他作為胰脂肪酶抑制劑，通過(guò)共價(jià)修飾活性位點(diǎn)抑制胰腺脂肪酶，降低機(jī)體對(duì)脂肪的吸收[39]。

圖7 不同方法提取紅松籽油甾醇對(duì)胰脂肪酶活性抑制效果

2.5 不同方法提取紅松籽油甾醇結(jié)合膽酸鹽能力比較

從圖8可知不同方法提取的紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度在0.6～2.2 mg/mL內(nèi)隨濃度的增大，與牛磺酸膽酸鈉、甘氨膽酸鈉結(jié)合率均增大，紅松籽油甾醇質(zhì)量濃度在1.8～2.2 mg/mL內(nèi)與兩種膽酸鹽結(jié)合速率上升平緩。超聲波法提取的紅松籽油甾醇結(jié)合率上升速率均高于其他3種方法，且當(dāng)膽酸鹽結(jié)合率趨于穩(wěn)定后，超聲波法提取的紅松籽油甾醇結(jié)合率最大(P<0.05)，?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉結(jié)合率分別為(77.593±1.401)%、(77.601±1.103)%。膽汁酸是膽固醇在膽汁中衍生而來(lái)的能夠加速脂類(lèi)消化代謝引起血脂升高的大分子，膽汁酸通過(guò)酰胺鍵與甘氨酸或牛磺酸迅速結(jié)合，形成相應(yīng)的膽酸和去氧膽酸結(jié)合物，將膽酸鹽結(jié)合能夠降低機(jī)體對(duì)膽固醇的吸收[38]。

3 結(jié)論

以紅松籽油甾醇得率為指標(biāo)，確定了溶劑法、超聲波法、微波法、光波法的最佳工藝條件，其中微波法提取的紅松籽油甾醇得率最大。對(duì)比超聲波法、微波法、光波法處理前后紅松籽油甾醇得率的變化情況，發(fā)現(xiàn)短時(shí)間單獨(dú)處理時(shí)可提取出大部分紅松籽油甾醇，在總浸提過(guò)程中起主導(dǎo)作用。比較4種方法對(duì)紅松籽油甾醇功能性質(zhì)的影響可知：微波法提取的紅松籽油甾醇對(duì)DPPH·清除效果最好，與超聲波法差異不顯著(P>0.05)，超聲波法提取的紅松籽油甾醇對(duì)ABTS+·清除效果最好，并且超聲波法提取的紅松籽油甾醇對(duì)胰脂肪酶抑制效果及膽酸鹽結(jié)合能力最強(qiáng)。得率雖略低于微波法，但綜合考慮超聲波法更適合紅松籽油甾醇的開(kāi)發(fā)利用。

不同提取方法對(duì)紅松籽油甾醇功能性質(zhì)影響的差異性，可能與活性物質(zhì)的降解有關(guān)，但短時(shí)間提取出的甾醇仍然具有較高的活性，均具備較強(qiáng)的清除自由基、抑制胰脂肪酶活性及結(jié)合膽酸鹽的能力，表現(xiàn)出潛在的抗氧化及降血脂效果。植物甾醇具有較高的應(yīng)用價(jià)值和較大的市場(chǎng)發(fā)展空間，關(guān)于4種提取方法對(duì)紅松籽油甾醇結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的影響機(jī)制還需進(jìn)一步研究。