薛思瑤 李彩霞 贠克明 叢 斌 趙雯婷**

（1）山西醫(yī)科大學法醫(yī)學院，太原 030001；2）公安部物證鑒定中心，現(xiàn)場物證溯源技術國家工程實驗室，法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室，北京 100038；3）河北醫(yī)科大學法醫(yī)學院，石家莊 050017）

脫發(fā)問題是近年來社會各界關注的熱點問題，尤其在中青年人群中的發(fā)病率一直居高不下，對患者的心理、生活社交造成明顯影響。人類最常見的脫發(fā)形式是男性型脫發(fā)（male pattern baldness，MPB），其特點是頭皮上依賴雄激素的進行性脫發(fā)表現(xiàn)。MPB 嚴重程度與年齡、脫發(fā)部位等密切相關，發(fā)病率隨年齡以平均每10 年提高10%的增速增長［1］，其在歐洲男性中的患病率很高，可達到80%［2］，而一項針對3 519 名上海男性脫發(fā)情況的研究顯示脫發(fā)患病率在19.9%左右［3］。有多項研究表明，與高加索人相比，中國人、日本人和非裔美國人的患病率較低［4］。

人群遺傳學研究顯示，MPB 是一種高度遺傳的多基因疾?。?］。早期針對雙胞胎的研究表明［6］，MPB 的遺傳力約為81%；Liu 等［7］基于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）常見變異的分子遺傳學方法估計MPB 的遺傳力可達50%。近年來，隨著基因分型技術和DNA 測序技術的快速發(fā)展，尤其是全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）的應用，MPB 的遺傳學研究取得了突破性進展，歐洲人群GWAS 研究發(fā)現(xiàn)的MPB 顯著關聯(lián)SNP 位點已達1 000 個以上。比如，2017 年針對8 個獨立的歐洲血統(tǒng)人群隊列22 518 個樣本的薈萃分析［8］確定了63 個MPB 顯著關聯(lián)位點（6 個位于X 染色體上，57個位于常染色體上），同時揭示了脫發(fā)不是孤立的特征，而是可與許多其他人類表型具有相關性的，例如前列腺癌和神經(jīng)退行性疾病等。迄今人群規(guī)模最大的MPB 遺傳分析來自2018 年Ⅴisscher等［9］對UK Biobank 205 327 個歐洲男性的研究，通過GWAS 關聯(lián)出了624 個近獨立的位點（598 個位于常染色體上，26個位于X染色體上）。同年一項針對7 萬歐洲人群的GWAS 研究關聯(lián)出了71 個獨立遺傳位點［10］，可解釋總遺傳力的38%?？梢?，MPB 雖然是多基因復雜表型，但與身高等表型相比，可以用相對較少的SNP 來解釋較大比例的遺傳力。因此，通過SNP 位點建立準確性較高的MPB遺傳預測模型是可行的。

已有的MPB 遺傳預測模型大多采用了邏輯回歸算法。Hagenaars等［11］使用287個SNP位點建立多元邏輯回歸模型，重度脫發(fā)的AUC（ROC 曲線下方的面積大小，area under curve）為0.78，但輕度脫發(fā)和中度脫發(fā)的AUC僅能達到0.68 和0.61。Liu 等［7］針對2 725 個德國和荷蘭男性的研究嘗試建立了25 個SNP 的邏輯回歸模型，AUC=0.74。Marcińska等［12］使用305個50歲及以上的歐洲人群樣本構建了20 個SNP 的模型，對脫發(fā)的遺傳解釋力為35%，AUC=0.86。

與歐洲人群MPB 的遺傳預測研究相比，針對中國人群的研究報道相對較少。在本實驗室的前期研究中，潘思宇等［13］針對中國的歐亞混合人群建立了兩種MPB 預測模型，一種以年齡、BMⅠ和25個SNP為預測因子，AUC=0.82；另一種是以年齡、BMⅠ和68 個SNP 為預測因子，AUC=0.89。這兩種預測模型雖然展現(xiàn)出良好性能，但在僅將年齡作為預測因子的情況下AUC值就可以達到0.77?？梢娫撃Ｐ湍挲g依賴性過強，SNP的獨立預測能力有待提高。

本研究選取了近十余年發(fā)表的關于MPB 研究的16 篇文獻中486 個歐洲人群關聯(lián)SNP 位點［7-8，10-12，14-24］，在312名中國漢族人群樣本中進行關聯(lián)驗證分析，并基于篩選后的具有顯著關聯(lián)性的SNP位點建立了MPB邏輯回歸預測模型，同時對k近鄰分類器（k-nearest neighbor classifier）、隨機森林（random forest）、支持向量機（support vector machine，SⅤM）等常見的分類器模型［25］在MPB遺傳預測中的性能進行了比對評估，力求找到MPB預測準確性最高的建模方法。

1 材料與方法

1.1 男性型脫發(fā)表型的獲取及分類標準

Hamilton-Norwood（H-N）脫發(fā)分級標準［1］根據(jù)發(fā)際線后移程度以及頭頂部毛發(fā)稀疏程度將MPB劃分為不脫發(fā)（Ⅰ類）、6種MPB主類型（ⅠⅠ至ⅤⅠⅠ類）和5 種亞類型（ⅠⅠA 至ⅤA 以及ⅠⅠⅠvertex）。參照該標準，本研究將表型分為兩組（圖1）：a.MPB 表型組，即頭頂部可見明顯脫發(fā)且發(fā)際線嚴重后移（Ⅳ、Ⅳa、Ⅴ、Ⅴa、Ⅵ和Ⅶ）；b.對照表型組，即完全沒有脫發(fā)或輕微發(fā)際線后移（Ⅰ和Ⅱ）。表型讀取時，由3名評分者同時觀看照片，并獨立對每一位志愿者的MPB 等級進行評級，排除表型判斷有困難的樣本，以3個評分者對每個志愿者分級結果的眾數(shù)作為最終的MPB等級。

1.2 樣本及DNA提取

按照1.1的表型分組標準，本研究共收集了中國不同地域的漢族男性個體312 例，除7 例樣本為南方漢族（四川6、江西1）外，其余均為北方漢族（山東4、山西296、河南5）群體，其中MPB表型組143 例，對照表型組169 例，且所有研究個體無內分泌功能障礙類疾病、未接受過毛發(fā)相關治療。考慮到年齡因素對MPB的影響［12］，MPB表型組年齡在28～69歲之間，平均年齡約53，而對照表型組選取了高齡不脫發(fā)的志愿者，年齡在55 歲以上，平均年齡59 歲左右。詳細組內信息和外觀概覽見表1 和圖1。使用Canon EOS 5D Mark ⅠⅠ（佳能，日本）高清照相機分別采集志愿者頭部左側、正面及右側3張二維照片。本研究通過公安部物證鑒定中心倫理委員會審查，所有參與者均簽署了書面知情同意書。

1.3 基因分型及質量控制

使用Ⅰllumina HiSeq X Ten測序平臺（Ⅰllumina，美國）對樣本進行3X 低深度全基因組測序，每個樣本得到平均10G Raw data。對經(jīng)過變異檢測（variant calling）處理后的數(shù)據(jù)，使用本實驗室中國人群低深度測序2 510 份樣本進行基因填補。使用PLⅠNK v1.9［26］對SNP進行質量控制，包括分型成功率（call rate）＞0.97，哈迪溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）P＞0.000 1和次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.01。個體樣本質量控制包括性別檢查，親緣關系檢測及雜合性判斷。以千人基因組數(shù)據(jù)第三階段（1000 Genomes Project Phase 3）數(shù)據(jù)作為參考基因組，使用ⅠMPUTE［27］對常染色體進行基因填補并過濾填補質量分數(shù)小于0.6 的SNP，并再次重復上面質量控制標準，最終共獲得20 681 872個SNP位點。

Table 1 Sample information

Fig.1 Diagram of MPB

1.4 統(tǒng)計分析

1.4.1 遺傳關聯(lián)分析

本研究選用基于歐洲人群關聯(lián)出的486個SNP位點，均通過了質量控制，詳細位點信息見附件表S1。使用Plink v1.9 軟件（哈佛大學，波士頓，馬薩諸塞州，美國） 分別進行了一般線性回歸（general linear model，GLM）和二元邏輯回歸分析，測試486 個SNP 與MPB 的相關性?；蛐偷馁x值為加性模型，假設個體攜帶的次等位基因的數(shù)量與表型特征有累積效應。估計了所有SNP 的優(yōu)勢比（odds ratio，OR）、相應的95%可信區(qū)間（confidence interval，CⅠ）和P值。將P＜0.05 認為在關聯(lián)分析中具有統(tǒng)計學意義。同時通過將所獲得的OR與OR=1 時相比，從而估計脫發(fā)風險增加倍數(shù)。使用wANNOⅤAR［28］對與MPB 相關性最高的前20 個SNP 進行相關基因區(qū)域識別。多重假設檢驗校正后沒有達到顯著關聯(lián)性的位點，故而在本研究中沒有應用多重假設檢驗的校正。

1.4.2 預測建模

將在關聯(lián)分析中具有統(tǒng)計學意義的SNP 位點作為建立預測模型的初始位點集合。首先對數(shù)據(jù)進行預處理，先將因變量的編碼分為“1”（MPB 表型）和“0”（對照表型），再依據(jù)次要等位基因數(shù)目對SNP基因型進行編碼：具有2個次要等位基因編碼為“2”，只有1 個次要等位基因編碼為“1”，不含次要等位基因編碼為“0”。然后，采用兩種方法對位點進行篩選，一種是基于R 軟件STEP 函數(shù)對AⅠC信息標準進行逐步分析，另一種是通過R軟件glmnet包建立Lasso回歸模型，從而對SNP預測因子進行最終選擇和排序。

邏輯回歸適用于二值響應變量（即0和1），故選用二元邏輯回歸對預測模型進行訓練。模型假設因變量服從二項分布，模型的擬合形式為：

由于本研究樣本量較小，采用十折交叉驗證法來防止過度擬合。將MPB 的預測概率與觀察到的MPB狀態(tài)進行比較，將AUC作為預測準確性的總體衡量標準。AUC值的范圍從0.5 到1.0，0.5 表示隨機預測，1.0 表示完全準確的預測。如果預測概率＞0.5，則定義受試者為MPB，否則為不脫發(fā)。使用混淆矩陣比較預測和觀察的脫發(fā)狀態(tài)，并得出靈敏度和特異值，兩者的范圍都在0 到1 之間。所有候選SNP 分析和預測分析都在R v4.0.2（http://www.r-project.org/）中進行。

1.4.3 多模型對比評估

在R 軟件中分別對k 近鄰分類器、隨機森林、支持向量機3 種機器學習算法進行建模-驗證，獲得不同模型的預測準確性從而對比模型的預測性能。建模過程中使用的R 包主要包括class 包、kknn 包、randomForest 包、e1027 包等。每種機器學習算法共運行10 次，求其平均值。對于二分類任務，可將驗證樣本的真實情況作為金標準，對所有驗證樣本的模型分類結果和金標準結果分別計數(shù)，從而獲得分類器性能混淆矩陣。分別計算模型的正確率、敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值以及五折交叉驗證的預測準確性。以上分類器性能衡量標準的取值范圍均為0～1，值越大，表示分類性能越高。

2 結果與分析

2.1 遺傳關聯(lián)分析結果

通過對312 個樣本的486 個SNP 進行關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)174 個SNP 與MPB 顯著相關，相關性最顯著的20 個見表2。在與MPB 相關的SNP 中，位于chr20 上的位點最多，有145 個，chr5 和chr6 上各有6個SNP，chr1上有4個SNP，chr9和chr10上各 有3 個SNP，chr2 上 有2 個SNP，chr3、chr7、chr8、chr15、chr19 上各有1 個SNP。與前20 個顯著位點有關的基因分別為EBF1、TFAP2C、PAX1以 及RUNX3。位 于EBF1 的rs17643057 在chr5 上的分布具有最高的統(tǒng)計學意義（邏輯回歸關聯(lián)分析OR=0.479，95%CI=0.321～0.714，P=3.42×10-4）。值得注意的是，當應用一般線性回歸關聯(lián)分析時，前9個SNP的顯著性更高。據(jù)估計，攜帶rs985546-C等位基因的男性患MPB 的風險是攜帶T 等位基因男性的3.4 倍。從OR來看，其余3 個與MPB 易感性 相 關 最 顯 著 的SNP 是rs17643057-G （chr5）、rs1422798-G（chr5）和rs6113382-A（Chr20），使MPB的風險分別增加2.1、2.0和1.9倍。

Table 2 Top 20 SNPs most significantly associated with MPB in Han Chinese （P＜0.05）

2.2 位點篩選

逐步回歸不僅可以從備選因子中篩選出最終預測變量，還可以防止模型過度擬合。本研究通過雙向逐步回歸的方法，根據(jù)提前設定的赤池信息準則（Akaike information criterion，AⅠC），將直接納入模型的174 個MPB 相關SNP 精簡至22 個SNP 用于下游預測模型的建立。此時的AIC達到最小值，跨度區(qū)間為322.38～305.81（圖2）。每一預測因子的方差膨脹系數(shù)（variance inflation factor，ⅤⅠF）均小于10，不存在多重共線性問題。

Lasso 回歸基于懲罰系數(shù)λ對備選因子進行篩選，隨著懲罰系數(shù)λ的增大，模型回歸系數(shù)β逐漸趨近于0，最終變?yōu)?（圖3a，b）。圖3a 左側虛線對應使模型估計誤差最小的λ，右側虛線對應使模型估計誤差在可接受范圍內的λ，根據(jù)最高效原則確定納入模型的最優(yōu)變量組合，最終篩選出25 個SNP位點。

Fig.2 Characteristic variable screening based on stepwise regression

Fig.3 Characteristic variable screening based on Lasso regression

2.3 預測模型

根據(jù)上述篩選得到的兩種位點集合，建立了兩個預測模型。兩模型所包含位點信息見表3，詳細位點信息見附件表S2。

第一個模型包括通過逐步回歸分析篩選出的22 個SNP，該模型解釋了患MPB 總風險的48%（R2=0.48）。第二個模型包括通過Lasso回歸篩選出的25 個SNP，該模型解釋了患MPB 總風險的45%（R2=0.45）。MPB 預測模型具有總體預測精度，區(qū)分度指標分別為AUC=0.85 和AUC=0.84，ROC 曲線見圖4。應用50%的概率閾值，22-SNP 預測模型正確預測的總數(shù)為76%（236/309），有3 個不確定結果。然而，65%的概率閾值的正確預測降低到75%（234/311），有1 個不確定結果。同樣，應用50%的概率閾值，25-SNP 預測模型正確預測的總數(shù)為74%（228/309），有3 個不確定結果。而65%的概率閾值的正確預測保持不變，仍為74%（226/307），有5個不確定結果。兩模型均通過十折交叉驗證的方法進行驗證，驗證后的AUC分別為0.81和0.77。在加入年齡作為預測因子之一后，預測準確性分別提升到了80%（251/312）和81%（252/312），沒有不確定結果。相比較而言，通過Lasso回歸篩選出來的位點在十折交叉驗證過程中AUC有一定程度的下滑，且有個別位點存在多重共線性問題。22-SNP預測模型和25-SNP預測模型在18個SNP 上相同，僅存在4～7 個位點差異，但22-SNP預測模型在各項指標上均優(yōu)于25-SNP 預測模型。在加入年齡作為預測因子后，兩模型的預測準確率等各指標均有提升， 整體表現(xiàn)AUC均為0.89（表4）。

Table 3 Information of 22-and 25-SNP used in predictive model building

Fig.4 Receiver operating characteristic(ROC)curves for 22-SNP(left)and 25-SNP(right)MPB prediction models The ROC curves have sensitivity as the ordinate.

Table 4 Prediction performance for MPB with different SNP-sets and factors

2.4 分類器模型性能評估

通過混淆矩陣獲得的分類器模型性能評價見表5。在3 種分類器模型中，最高的準確率是基于22-SNP 的支持向量機分類器模型，但也僅能到達68%，其預測效能和預測準確性遠不如邏輯回歸模型。

Table 5 Performance comparison of k-NN,random forest and SVM for MPB prediction

3 討 論

本研究首次在中國漢族人群中進行較為系統(tǒng)的MPB 相關位點驗證分析，并初步篩選出與中國人群MPB 表型相關的SNP 位點，同時構建出性能較高的非年齡依賴MPB預測模型。

從關聯(lián)分析結果來看，chr20 上的多個SNP 與MPB具有強關聯(lián)性，這說明chr20不僅是歐洲人群MPB的主要危險區(qū)域［29］，也是中國漢族人群MPB的主要危險區(qū)域，這提示了在不同祖源人群中MPB 可能存在相似的遺傳機制。本研究中關聯(lián)性最顯著的SNP位點（rs17643057）所在基因區(qū)域已被歐洲研究證實與毛發(fā)生長特征有關［8］，受早期B細胞因子1（early B cell factor 1，EBF1）調控。EBF1 是早期B 細胞發(fā)育和脂肪形成所必需的轉錄因子，動物研究表明其在小鼠成熟、生長的毛囊中表達。除EBF1外，在本研究前20個顯著關聯(lián)位點中，有75% 以上位點與PAX1 （paired Box 1，PAX1）這一基因區(qū)域有關。PAX1在皮膚、頭發(fā)和頭皮中表達，是典型的MPB易感位點［17，29］。這提示了將PAX1 作為中國漢族人群MPB 候選基因的必要性。值得一提的是，本研究關聯(lián)出的顯著位點（rs2180439）在另一項基于中國漢族人群的研究中［14］同樣被證實與脫發(fā)顯著相關，效應方向與本研究一致，超過了統(tǒng)計意義的關聯(lián)閾值（P≤3.13×10-3）。對于那些關聯(lián)性較低的SNP，本文暫時無法驗證SNP 是否與MPB 存在真實關聯(lián)，需要進一步擴大樣本量來提升結果的準確性。

為了進一步優(yōu)化MPB 相關SNP 位點集合以建立預測模型，本研究采用了兩種不同的位點篩選方法，并獲得22-SNP和25-SNP兩組位點集合。這樣做的目的一方面是為了比較兩種位點篩選辦法所獲得的SNP 對模型的預測性能所造成的差異，另一方面是為了防止模型過度擬合。若模型過度擬合，其在外部驗證中的表現(xiàn)就會變差。在僅使用SNP作為預測因子的情況下，基于22-SNP和25-SNP脫發(fā)的二分類預測模型均表現(xiàn)出了良好的性能。在加入年齡作為預測因子后，模型的預測性雖有小幅提升，但不能排除在高齡對照樣本的影響下，年齡所產(chǎn)生的虛假相關性。在實驗室前期研究成果中，不加入年齡作為預測因子的前提下，模型AUC低于0.7［13］。說明本研究所采用的表型組、對照組樣本篩選方法，顯著降低了年齡對關聯(lián)結果的影響，篩選出的位點對表型的影響效力更強，所解釋的遺傳力度相較前期研究的不足30%也有顯著提升。

已有的MPB預測模型大多基于邏輯回歸算法，本研究進一步探索了不同分類器模型對MPB 表型的預測性能。從邏輯回歸、k近鄰分類器、隨機森林、SⅤM 這4 種常用分類器模型在本研究人群的運行結果來看，邏輯回歸模型具有明顯優(yōu)勢。

4 結 論

本研究通過將歐洲人群MPB 關聯(lián)位點在中國人群的驗證分析，為了解中國漢族人群MPB 的遺傳機制奠定了基礎。同時，所構建的預測模型，能夠在不依賴年齡作為預測因子的條件下，達到較為優(yōu)良的預測性能。在后續(xù)的研究工作中，通過擴大樣本量、采用全基因組關聯(lián)分析、引入表觀遺傳分析等方法，有望得到更優(yōu)的MPB 相關遺傳位點集合，建立更為精準的MPB 預測模型，應用到臨床醫(yī)學診斷和法庭科學領域中。

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