鯉幼魚耳石熒光化合物和鍶復(fù)合標記研究

邱 晨，姜 濤，陳修報，劉洪波，楊 健1,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院， 江蘇 無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心漁業(yè)微化學(xué)研究室，江蘇 無錫 214081；3.沅江市南大膳鎮(zhèn)人民政府，湖南 沅江 413100）

魚類增殖放流是加強生態(tài)環(huán)境保護和漁業(yè)資源養(yǎng)護的關(guān)鍵手段之一，但放流后客觀的效果評價卻是一個無法回避的難題。這就需要合適的放流標記技術(shù)來有效解決。目前，已有很多放流標記的方法（如掛牌法、分子標記法等），但各有優(yōu)缺點[1]。因此，需要進一步優(yōu)選標記模式，尤其是針對早期生活史的規(guī)模化標記模式。目前的研究通常僅利用熒光物質(zhì)或鍶（Sr）等對水生生物進行了單一標記[2-5]。然而，在探索研究和實際生產(chǎn)中，為了使一次標記獲得更多研究成果，節(jié)省多次標記的重復(fù)操作，同時也為了使呈現(xiàn)的結(jié)果更易被觀察，筆者認為利用不同標記物對同一批次魚進行耳石復(fù)合標記具有更大的應(yīng)用潛力，但相關(guān)方面的報道卻較為少見。為此，該研究選用早期生活史鯉（Cyprinus carpio）幼魚為對象，嘗試利用茜素絡(luò)合物（alizarin complexone ，ALC）和六水氯化鍶（SrCl2·6H2O）混合溶液對鯉幼魚進行浸泡，進而比較其3 對耳石[矢耳石（Sagitta）、微耳石（Lapillus）和星耳石（Asteriscus）]的ALC-Sr 復(fù)合標記效果，得到最佳標記耳石樣本，規(guī)范及優(yōu)化鯉魚耳石熒光-Sr 復(fù)合標記條件，為實現(xiàn)多樣化地增殖放流標記模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

20 尾人工繁殖的健康鯉幼魚采集自江蘇省無錫市中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南區(qū)實驗基地，試驗前供試魚均暫養(yǎng)于盛有曝氣2 d 以上的自來水的玻璃缸中，暫養(yǎng)期間不投餌。供試試劑有ALC（上海生工生物工程股份有限公司）、SrCl2·6H2O（分析純，上海撫生實業(yè)有限公司）。整個試驗均在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價與資源養(yǎng)護重點實驗室自主研發(fā)的耳石化學(xué)標記系統(tǒng)（LFEROM-1901 型，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心）中進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計與樣本采集在一個玻璃標記缸內(nèi)配制15 L 的200 mg/L ALC 和80 mg/L SrCl2·6H2O（配置濃度的準確性經(jīng)電感耦合等離子質(zhì)譜儀確認）的混合溶液，同時設(shè)置對照組。隨機捕取暫養(yǎng)后規(guī)格基本一致的10 尾鯉幼魚，平均體重（2.49±0.35） g，平均全長（60.98±2.68） mm，分別放入對照組和標記組的標記缸內(nèi)進行2 d 的浸泡標記處理。浸泡標記期間向試驗水體中充氣增氧，但不喂食。待浸泡標記結(jié)束后，將對照組和標記組的鯉幼魚分別置于一個盛有100 L曝氣自來水的后續(xù)飼養(yǎng)缸中恢復(fù)續(xù)養(yǎng)，投喂普通配合飼料。待恢復(fù)續(xù)養(yǎng)20 d 時進行取樣，測量其全長與體重后保存，以待后期標記檢測。試驗期間不控水溫和光周期，每日清理排泄物，并更換1/4 的養(yǎng)殖水體。

1.2.2 耳石摘取、處理與檢測在解剖鏡下取出5 尾樣本魚（剩余5 尾備用）的微耳石、星耳石、矢耳石（圖1）后，進行耳石樣本前處理，先在熒光顯微鏡（OLYMPUS BX51 型）下進行耳石ALC 標記檢測，再檢測同一耳石上Sr 的沉積標記狀況。（1）耳石樣本ALC 標記檢測具體方法如下：將耳石清洗干凈后，用透明指甲油封片，待凝固后在熒光顯微鏡下，分別用熒光顯微鏡的2 組濾光片（藍色激發(fā)光WBS 和綠色激發(fā)光WGS）對耳石進行比較觀察，拍照。耳石熒光標記強度參照歐陽斌等[6]的方法按無（-）、微弱（+）、較明顯（++）、明顯（+++）及非常明顯（++++）5 個等級來記錄。（2）耳石樣本Sr 標記檢測具體方法如下：耳石樣本用環(huán)氧樹脂（Epofix，Struers，丹麥）包埋固定，再使用 500 目和1 200 目砂紙打磨至接近核心截面，然后用磨拋機（LaboPol-35，Struers，丹麥）配合拋光液將其拋光至核心截面，且表面無明顯劃痕，清洗后晾干24 h，待完全干燥后，用真空鍍膜機（JEE-420，日本電子株式會社）完成鍍膜。參考邱晨等[7]的分析方法，利用電子探針微區(qū)分析儀（EPMA，JXA-8100，日本電子株式會社）對耳石樣本進行元素微化學(xué)的定量線分析和面分布分析。

圖1 鯉幼魚的3 對耳石

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007 軟件進行統(tǒng)計分析并作圖，對鯉幼魚的死亡情況、體重和全長等數(shù)據(jù)進行差異顯著分析（P＜0.05 為差異顯著）。耳石不同區(qū)域Sr/Ca 比值用平均值±標準差表示。由于耳石中的Sr 含量遠小于Ca 含量，所以按慣例Sr/Ca 指經(jīng)過標準化的比值，即統(tǒng)一用（Sr/Ca）×103的比值表示，簡稱Sr/Ca 比值[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合標記處理對鯉幼魚生存和生長的影響

在整個試驗過程中標記組和對照組試驗魚均未出現(xiàn)死亡（表1），在恢復(fù)續(xù)養(yǎng)20 d 時，2 組試驗魚的平均全長和平均體重（n=5）均有增長，無明顯差異（P＞0.05），且標記組試驗魚的活動行為、游動和攝食正常。從死亡率、行為學(xué)上來說，在該試驗設(shè)計的劑量范圍內(nèi)，復(fù)合標記處理對標記魚的急性和慢性毒性風(fēng)險小，不會對試驗魚的活動行為、游動和攝食產(chǎn)生顯著影響。

表1 鯉幼魚耳石復(fù)合標記后恢復(fù)續(xù)養(yǎng)20 d時個體的死亡率、體重和全長情況

2.2 鯉幼魚耳石復(fù)合標記的標記效果

利用熒光和Sr 同時對同一鯉幼魚進行復(fù)合標記，其3 對耳石均得到了良好的熒光標記和Sr 標記圖譜，在耳石邊緣形成了清晰可識別的橙紅色ALC 標記輪和紅色Sr 標記區(qū)，標記成功率為100%（圖2）。

圖2 鯉幼魚耳石復(fù)合標記檢測圖譜

不同耳石Sr/Ca 比值不同區(qū)域變化趨勢如圖3 所示，標記組的線分布結(jié)果與面分布顯示的從耳石核心至邊緣的截面變化一致，先是急劇升高，出現(xiàn)1 個明顯的Sr/Ca 比值沉積高峰（Sr/Ca 比值遠大于3.0，對應(yīng)于面分布中耳石上紅色Sr 標記區(qū)），后又逐漸下降并恢復(fù)至標記前正常水平（Sr/Ca 比值小于3.0，對應(yīng)于面分布中耳石邊緣藍色區(qū)）。而對照組耳石Sr/Ca 比值較低，變化趨勢平穩(wěn)且無明顯波動（Sr/Ca 比值小于3.0，面分布中整個耳石截面均表現(xiàn)為藍色區(qū)）。這說明ALC-Sr 復(fù)合浸泡標記是有效的。

標記組的3 類耳石在綠色激發(fā)光、藍色激發(fā)光下均可發(fā)現(xiàn)熒光標記信號（圖2）。在綠色激發(fā)光、藍色激發(fā)光下，雖然檢測到的熒光標記環(huán)均為橘紅色，但不同光源下ALC 標記環(huán)分辨度不同。在綠色激發(fā)光源下，標記環(huán)在耳石上呈深橘紅色，耳石中心區(qū)（核心至標記環(huán)之間區(qū)域）及外圍（標記后恢復(fù)續(xù)養(yǎng)期間耳石新生長部分）呈淡橘紅色，與標記環(huán)的顏色相近，不易分辨、識別；在藍色激發(fā)光源下，標記環(huán)在耳石上呈橘紅色，耳石中心區(qū)（核心至標記環(huán)之間區(qū)域）及外圍（標記后恢復(fù)續(xù)養(yǎng)期間耳石新生長部分）呈綠色，顏色差異顯著，易于識別。通過對不同激發(fā)光下熒光效果的比較發(fā)現(xiàn)，在藍色激發(fā)光下的ALC 標記環(huán)最明顯。因此，在檢測鯉幼魚耳石上的ALC 標記環(huán)時使用藍色激發(fā)光源應(yīng)該更適宜且有效。

從耳石ALC 和Sr 標記圖譜來看，矢耳石、微耳石和星耳石均可檢測到熒光標記環(huán)，但不同耳石上的熒光和Sr 標記的強度不同。在藍色激發(fā)光下，星耳石上ALC 標記環(huán)清晰、顏色鮮艷，非常明顯（++++）。從恢復(fù)的情況來，星耳石ALC 標記恢復(fù)最快。因此，星耳石標記效果最好。

由圖3 可知，從Sr/Ca 比值來看，微耳石Sr/Ca比值峰值為138.12±46.63，面分布圖譜上表現(xiàn)的紅色Sr 標記區(qū)寬而粗，易被觀察，星耳石和矢耳石的Sr/Ca 比值峰值分別為15.96±3.31、26.61±2.27，紅色Sr 標記區(qū)雖較窄，但已足夠說明Sr 標記效果；從代謝Sr的速度來看，星耳石和矢耳石代謝Sr的速度更快，其邊緣表現(xiàn)出的紅色Sr 標記區(qū)之后已有明顯的藍色峰值恢復(fù)階段，星耳石和矢耳石Sr/Ca 比值已恢復(fù)到標記前的正常水平，而微耳石邊緣未恢復(fù)。

圖3 標記組合處理組鯉幼魚耳石從核心（0 μm）到邊緣定量線分析的Sr/Ca 比值變化

3 討 論

3.1 鯉幼魚復(fù)合標記有效性評價

利用化學(xué)染料和微量元素短時間浸泡標記魚類，必定會對其生理造成一定程度的脅迫，也可能會對魚體的生存和生長產(chǎn)生一定毒性。周喬[8]的研究表明，在標記過程中魚體雖在短時間內(nèi)會因外界環(huán)境條件改變而遭受脅迫，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，但一段時間后可以恢復(fù)正常。目前，關(guān)于這方面的研究報道較少。該研究利用200 mg/L ALC 和80 mg/L SrCl2·6H2O 同時浸泡標記鯉幼魚，2 d 后試驗魚無死亡情況，表明在該研究設(shè)計的劑量范圍內(nèi)，標記物對試驗魚的急性致毒風(fēng)險小。恢復(fù)續(xù)養(yǎng)期間標記組和對照組正常生長、生存，無死亡現(xiàn)象，在恢復(fù)續(xù)養(yǎng)20 d 時平均體重和平均全長也無顯著差異。這表明利用這2 種物質(zhì)同時浸泡標記魚類，標記魚對其的毒性反應(yīng)不敏感，相對安全性較高。這與單一進行ALC 或Sr 標記其他魚類得到的安全性結(jié)果一致[9-10]。

在過去的研究中，體外標記法、分子標記法等均在鯉魚放流標記中普遍應(yīng)用，但這些標記方法存在一定的局限性，均不適合鯉魚早期個體規(guī)?；帕鳂擞?。課題組前期證實了利用化學(xué)物質(zhì)標記鯉魚早期個體是有效可行的，而該研究將ALC 和Sr 結(jié)合起來在同一時間對同一批次鯉幼魚進行耳石復(fù)合標記，不僅獲得了與單一ALC 或Sr 標記一致的效果[7,11]）和100%的標記率，而且2 種標記的檢測互不干擾，結(jié)果可在2種設(shè)備（熒光顯微鏡和電子探針微區(qū)分析儀）中展示，不需要標記和相關(guān)風(fēng)險之間的時間間隔。由于ALC和Sr 檢測的耳石準備在第一步幾乎是相同的，且在魚類早期個體中，耳石熒光檢測可直接用透明指甲油封片后（無需打磨耳石）放在熒光顯微鏡下觀察，因此可先檢測耳石上的熒光標記，這樣既方便又省時省力。但若需檢測較長時間前的標記魚，當熒光衰敗或熒光反應(yīng)不明顯時，可再通過Sr 標記確認即可，因為Sr 標記在耳石上能長久保存。這將大大縮短檢測時間，節(jié)省檢測成本，提高檢測效率。

綜合表明，利用熒光物質(zhì)和Sr 進行復(fù)合標記是可行的，這與王臣[12]對大麻哈魚（Oncorhynchus keta）先進行Sr 標記再進行ALC 標記得到的結(jié)果一致，在其他魚上也有類似結(jié)果[13-14]。下一步課題組將探究關(guān)于熒光物質(zhì)與Sr 在魚耳石上的沉積速度及時滯性等問題，期望能夠了解熒光標記與Sr 標記出現(xiàn)在耳石上的先后順序，以便指導(dǎo)生產(chǎn)應(yīng)用。

3.2 鯉幼魚復(fù)合標記最適合耳石樣本篩選

從該研究選擇的3 對耳石的ALC 和Sr 標記圖譜來看，矢耳石、微耳石和星耳石均可檢測到ALC 標記環(huán)和Sr 標記區(qū)，但不同耳石上的ALC 和Sr 標記的強度不同。

在藍色激發(fā)光下，星耳石上ALC 標記環(huán)清晰、顏色鮮艷，與鯉魚耳石自身發(fā)出的熒光顏色對比非常明顯；且從恢復(fù)續(xù)養(yǎng)過程的情況來，星耳石ALC 標記結(jié)束，耳石狀況恢復(fù)正常的速度最快。因此，星耳石較為適宜作為觀察ALC 標記效果的靶耳石。

對比3 對耳石的Sr 標記特征，從Sr 標記區(qū)寬窄來看，微耳石表現(xiàn)的紅色Sr 標記區(qū)寬而粗，易被觀察；而星耳石和矢耳石的紅色Sr 標記區(qū)雖較窄，但已足夠顯示Sr 標記的明顯效果。造成耳石間Sr 標記區(qū)寬窄的原因可能是：（1）由于耳石結(jié)構(gòu)不同，微耳石和矢耳石的礦物相為文石晶體，而星耳石則為球文石晶體構(gòu)成[15-16]，導(dǎo)致耳石吸收Sr 的量不同導(dǎo)致的，Macdonald 等[17]研究顯示微耳石的Sr/Ca 比值比星耳石高7 倍左右，這與筆者的研究中微耳石峰值的Sr/Ca 比值比星耳石高8.6 倍的結(jié)果一致；（2）由于Sr在不同耳石上的時滯效應(yīng)差異造成的[7,18]，從Sr 標記區(qū)耳石的恢復(fù)狀況來看，星耳石和矢耳石邊緣的紅色Sr 標記區(qū)已有明顯的Sr/Ca 比值回到標記前正常水平的藍色區(qū)域，而微耳石邊緣Sr 含量仍未恢復(fù)到正常狀態(tài)。另外，從耳石樣品采集和前處理的容易程度來看，微耳石形態(tài)很小，采樣和前處理難度較大，而鯉科魚類矢耳石形狀特殊，呈細長的長條狀，摘取和打磨時都易損壞。與之相比，星耳石最大，形狀規(guī)則，易采取，便于前處理。因此，星耳石亦較為適宜作為觀察Sr 標記效果的靶耳石。

4 結(jié) 論

該研究對鯉幼魚進行了200 mg/L ALC 和80 mg/L SrCl2·6H2O 的復(fù)合標記，采集矢耳石、微耳石和星耳石這3 對耳石進行檢測，結(jié)果均檢測到了明顯可識別的ALC 標記環(huán)和Sr 標記區(qū)，標記率為100%，證實熒光-Sr 復(fù)合標記模式是有效和可行的。不同耳石上的ALC 和Sr 標記強度不同，基于標記效果的顯著性和標本前處理的便利性綜合考慮，建議首選星耳石作為鯉幼魚熒光-Sr 復(fù)合標記相關(guān)檢測的靶樣本。